Bottom-up e Shotgun Proteomica per identificare una completa Cochlear Proteome

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere il numero più elevato possibile di identificazioni proteiche dall'epitelio sensoriale cocleare, utilizzando diverse tecniche proteomiche. Questo risultato si ottiene isolando la coclea e l'epitelio sensoriale da topi adulti e sottoponendoli a sonicazione in un buffer di lisi per ottenere le proteine come secondo passaggio. Vengono applicate diverse strategie di digestione al lisato totale o al lisato proteico frazionato al fine di aumentare la copertura delle sequenze peptidiche e proteiche.

Vengono successivamente utilizzate diverse tecniche di separazione, tra cui lo scambio cationico forte e la cromatografia in fase inversa, per ridurre la complessità del campione prima dell'analisi mediante spettrometria di massa. I risultati mostrano l'identificazione di un elevato numero di proteine membrane e solubili nell'epitelio sensoriale della coclea del topo, mediante l'impiego di diversi approcci proteomici e di uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il microarray di anticorpi e l'elettroforesi bidimensionale, consiste nell'identificazione di un gran numero di proteine sia solubili che membrane, aumentando così i dati sul proteoma cocleare.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui biomarcatori associati a disturbi dell'udito e della produzione lacrimale, può essere applicato anche ad altri sistemi, come l'identificazione di biomarcatori legati all'età e al cancro al seno o ai polmoni. Questo metodo può inoltre essere utilizzato per lo studio di altri campioni biologici, come il sangue. Abbiamo concepito per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo osservato la limitata disponibilità di dati proteomici provenienti dall'orecchio interno dei mammiferi, e in particolare il numero ridotto di proteine di membrana che erano state identificate prima di iniziare questa procedura.

Isolare l'epitelio sensoriale cocleare da topi di 30 giorni dopo la nascita. Dopo aver lavato il tessuto con un volume di tampone fosfato, aggiungere 100 microlitri di tampone per la lisi al tessuto e sottoporre la miscela a sonicazione per 30 secondi sul ghiaccio utilizzando un disgregatore a ultrasuoni. Raffreddare il lisato sul ghiaccio per un minuto tra ogni ciclo di sonicazione, quindi sottoporre il campione a sonicazione per un totale di tre volte.

Centrifugare la sospensione a 16.000 ×g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Al termine, conservare il soprannatante per la digestione. Successivamente, aggiungere un'aliquote di 30 microlitri di estratto proteico cocleare direttamente su un filtro spin da 30 K e mescolare con 200 microlitri di urea otto molare in Riss HCl in centrifuga.

La miscela a 14.000 volte G per 15 minuti. Al termine, diluire il concentrato con 200 microlitri di soluzione di urea otto molare e ripetere la centrifugazione utilizzando le stesse condizioni di prima. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di iodoacetamide 10 X e 90 microlitri di soluzione di urea otto molare al concentrato nel filtro e vortexare per un minuto.

Dopo aver posizionato il filtro per centrifuga in un portaprovette per microcentrifuga, incubare per 20 minuti a temperatura ambiente al buio, a seguito di una centrifugazione a 14.000 ×g per 10 minuti a 0,1 microgrammi per microlitro di endoproteasi ly C in un rapporto enzima-proteina di 1:50, quindi incubare la miscela tutta la notte a 30 gradi Celsius. Al termine, aggiungere 40 microlitri di soluzione di bicarbonato di ammonio 100 millimolare all'unità filtrante e centrifugare la miscela a 14.000 ×g per 10 minuti. Dopo aver ripetuto il passaggio precedente, lavare l'unità filtrante con 40 microlitri di urea otto molare. Successivamente, lavare l'unità filtrante due volte con 40 microlitri di acqua milli Q.

Dopo aver lavato l'unità filtrante tre volte con 100 microlitri di soluzione di bicarbonato di ammonio 50 millimolare, aggiungere 0,4 microgrammi per microlitro di tripsina in un rapporto enzima:proteina di uno a 100 e incubare la miscela tutta la notte a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, eluire i peptidi triptici aggiungendo 40 microlitri di soluzione di bicarbonato di ammonio 50 millimolare all'unità filtrante e centrifugare la miscela a 14.000 × g per 10 minuti. Quindi ripetere questo passaggio un'altra volta.

A questo punto, iniettare da 50 a 100 microgrammi di campione proteico digerito su una colonna a scambio cationico forte da 200 per 2,1 millimetri con particelle da cinque micrometri. Per separare i peptidi, monitorare le frazioni peptidiche a 280 nanometri e raccogliere le frazioni a intervalli di due minuti. Utilizzando un raccoglitore di frazioni, asciugare quindi le frazioni in un concentratore sotto vuoto. Al termine, conservare le frazioni essiccate a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso per la cromatografia liquida.

Analisi mediante spettrometria di massa tandem. In un altro approccio, è stata utilizzata una frazionatura libera da gel per separare la miscela proteica. Una volta che il sopranatante proteico cocleare è stato desalato mediante precipitazione con acetone, aggiungere 30 microlitri di buffer campione 5x alla proteina desalata precedentemente sospesa in 112 microlitri di acqua Milli Q.

Successivamente, aggiungere otto microlitri di DTT uno molare e riscaldare la miscela a 95 gradi Celsius per cinque minuti per ridurre i legami disolfuro delle proteine. Dopo il riscaldamento, lasciare raffreddare la miscela. Aggiungere otto millilitri di buffer di corsa al serbatoio dell'anodo, 150 microlitri di buffer di corsa alla camera di raccolta del campione e sei millilitri di buffer di corsa al serbatoio del catodo.

Dopo questo carico, aggiungere 150 microlitri della miscela proteica cocleare nella camera di caricamento del campione, utilizzando una cartuccia all'acetato di tris all'8% con un intervallo di massa compreso tra 3,5 e 150 kilodalton. Dopo aver avviato la corsa, raccogliere il campione dalla camera di raccolta ad ogni intervallo di pausa dello strumento mediante pipetta e trasferirlo in una nuova provetta microcentrifuga opportunamente etichettata. Successivamente, lavare la camera di raccolta due volte con 150 microlitri di buffer di corsa e scartare i lavaggi.

Dopo l'elettroforesi in gel 1D delle frazioni libere da gel, aggiungere ciascuna frazione direttamente a un dispositivo filtrante da 30 K. Successivamente, mescolare ogni frazione con 200 microlitri di urea otto molare in tris HCl; dopo centrifugazione a 14.000 ×g per 25 minuti, aggiungere 10 microlitri di iodoacetamide 10X in soluzione di urea al concentrato in ciascun dispositivo filtrante e vortexare per un minuto.

Dopo aver posizionato i filtri per centrifugazione in un rack per microcentrifuga, incubare i campioni per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Successivamente, aggiungere 0,1 microgrammi per microlitro di LY C in un rapporto enzima-proteina di 1:50 alle unità filtranti; dopo un'incubazione notturna a 30 gradi Celsius, aggiungere 40 microlitri di soluzione di bicarbonato di ammonio 100 millimolare ai filtri per centrifugazione e centrifugare i campioni a 14.000 ×g per 10 minuti. Dopo aver ripetuto il passaggio precedente una volta, lavare i filtri per centrifugazione tre volte con 100 microlitri di soluzione di bicarbonato di ammonio 50 millimolare; aggiungere 0,4 microgrammi per microlitro di tripsina in un rapporto enzima-proteina di 1:100 dopo l'ultimo lavaggio. Una volta che i campioni sono stati incubati tutta la notte a 37 gradi Celsius, eluire i peptidi triptici da ogni unità filtrante aggiungendo 40 microlitri di soluzione di bicarbonato di ammonio 50 millimolare e centrifugare i campioni a 14.000 ×g per 10 minuti.

Dopo aver ripetuto questo passaggio una volta, analizzare i campioni mediante cromatografia liquida in tandem con spettrometria di massa. Sono state utilizzate due procedure di doppia digestione. La prima è stata una digestione con tripsina, seguita da una seconda digestione con tripsina, che sono state raggruppate e frazionate su una colonna a scambio cationico forte in 18 frazioni, e analizzate mediante nano-cromatografia liquida in tandem con spettrometria di massa.

Sono state identificate un totale di 1.485 proteine con una FDR dell'1% eseguendo un'unica corsa di spettrometria di massa in tandem con cromatografia liquida. Utilizzando questo approccio sperimentale, tra le proteine identificate, 324 e 258 sono state classificate rispettivamente in mitocondrio e membrana plasmatica.

La seconda procedura di doppia digestione ha consistito in una digestione con lisina C, seguita da una digestione con tripsina. Ogni digestione è stata caricata e separata individualmente su una colonna di scambio cationico forte in 18 frazioni, e analizzata mediante cromatografia liquida nano in tandem con spettrometria di massa. I risultati delle digestioni con lisina C e tripsina hanno prodotto un totale di 3.503 proteine con un FDR dell'1%.

Inoltre, 605 e 617 proteine sono state classificate rispettivamente nel mitocondrio e nella membrana plasmatica. Questo approccio ha fornito il numero maggiore di identificazioni di proteine associate alla membrana. Analisi duplicata del LY C e della tripsina.

Nelle frazioni, più del 65% delle proteine identificate era condiviso tra gli esperimenti. Tuttavia, nell'analisi di replica sono state individuate anche proteine nuove. I peptidi e le proteine aggiuntivi sono stati identificati a causa di piccole variazioni nella cromatografia, che hanno quindi portato a peptidi diversi per la frammentazione.

È stata preparata una gelatina colorata con argento per visualizzare i risultati della frazionatura libera da gel come illustrato. In questo caso, la gelatina ha mostrato una separazione proteica in base all'aumento del peso molecolare per ciascuna frazione consecutiva. Pertanto, le 12 frazioni liquide libere da gel sono state digerite utilizzando due diversi approcci di digestione multifase e analizzate mediante cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa in tandem.

L'approccio di digestione iniziale è stato eseguito utilizzando una doppia digestione con tripsina, che ha portato all'identificazione di 2.165 proteine con un FDR dell'1% effettuando una singola corsa di spettrometria di massa in tandem con cromatografia liquida. In questo esperimento, 516 e 399 proteine sono state classificate rispettivamente come appartenenti al mitocondrio e alla membrana plasmatica. Il secondo approccio di digestione è stato eseguito utilizzando l'endonucleasi ly C seguita da digestione con tripsina, con una singola corsa di cromatografia liquida.

L'analisi mediante spettrometria di massa tandem ha identificato 2.211 proteine con un FDR dell'1%. Questo approccio ha evidenziato un numero simile di proteine associate alla membrana rispetto all'utilizzo del metodo con tripsina, e i dati proteomici di spettrometria di massa sono stati depositati nel Proteome Exchange Consortium con l'identificatore del set di dati PXD 0 0 0 2 3 1. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale ricordare di evitare contaminazioni a ogni passaggio e mantenere il tessuto sul ghiaccio durante l'estrazione delle proteine per prevenire la degradazione proteica.