Bottom-up e Shotgun Proteomica per identificare una completa Cochlear Proteome

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ottenere il maggior numero di identificazioni proteiche dall'epitelio sensoriale cocleare utilizzando varie tecniche proteomiche. Ciò si ottiene isolando la coclea, l'epitelio sensoriale da topi adulti e sonicandolo in tampone di lisi per ottenere proteine come secondo passaggio. Diverse strategie di digestione vengono applicate al lisato intero o al lisato proteico frazionato al fine di migliorare la copertura di peptidi e sequenze proteiche.

Successivamente vengono utilizzate diverse tecniche di separazione, tra cui lo scambio cationico forte e la cromatografia in fase inversa per ridurre la complessità del campione prima dell'analisi di spettrometria di massa. I risultati mostrano l'identificazione di un gran numero di proteine di membrana e solubili per l'epitelio sensoriale della coclea di topo utilizzando più approcci proteomici e uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il microarray di anticorpi e l'elettroforesi su gel bidimensionale è che viene identificato un gran numero di proteine sia solubili che di membrana, aumentando così i dati del proteoma cocleare.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui biomarcatori correlati ai disturbi dell'udito e della lacrimazione, può essere applicato anche ad altri sistemi come l'identificazione di biomarcatori correlati all'età e al cancro al seno o ai polmoni. Questo metodo può essere applicato anche allo studio di altri campioni biologici come il sangue. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo osservato il limitato set di dati proteomici disponibili dall'orecchio interno dei mammiferi e, in particolare, il numero limitato di proteine di membrana che sono state identificate prima di iniziare questa procedura.

Isolare l'epitelio sensoriale cocleare da topi postnatali del giorno 30. Dopo aver lavato il tessuto con un tampone fosfato, aggiungere 100 microlitri di tampone di lisi al tessuto e sonicare la miscela per 30 secondi su ghiaccio utilizzando uno smembramento sonico. Raffreddare il lisato su ghiaccio per un minuto tra ogni sonicazione, quindi sonicare il campione per un totale di tre volte.

Centra fuse le sospensioni a 16.000 volte G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Al termine, conservare il surnatante per la digestione. Successivamente, aggiungere un'aliquota di 30 microlitri di estratto proteico cocleare direttamente a un filtro centrifugo da 30 K e mescolare con 200 microlitri di urea a otto molari nella centrifuga Riss HCL.

La miscela a 14, 000 volte G per 15 minuti. Al termine, diluire il concentrato con 200 microlitri di soluzione di urea a otto molari e ripetere la centrifugazione utilizzando le stesse condizioni di prima. Quindi, aggiungere 10 microlitri di 10 XI oto acetammide e 90 microlitri di soluzione di urea a otto molari al concentrato nel filtro e vorticare per un minuto.

Dopo aver posizionato il filtro rotante in un rack per microcentrifuga, incubare per 20 minuti a temperatura ambiente al buio dopo la centrifugazione a 14.000 volte G per 10 minuti a 0,1 microgrammi per microlitro di endo proteasi ly C in un rapporto enzima/proteine da uno a 50 e incubare la miscela per una notte a 30 gradi Celsius. Al termine, aggiungere 40 microlitri di soluzione di bicarbonato di ammonio 100 millimolare all'unità filtrante e centrifugare la miscela a 14.000 volte G per 10 minuti Dopo aver ripetuto il passaggio precedente, lavare l'unità filtrante con 40 microlitri di urea a otto molari. Quindi lavare l'unità filtro due volte con 40 microlitri di acqua milli Q.

Una volta che l'unità filtrante è stata lavata tre volte con 100 microlitri di soluzione di bicarbonato di ammonio da 50 millimolari, aggiungere 0,4 microgrammi per microlitro di tripsina in un rapporto enzima/proteine da uno a 100 e incubare la miscela per una notte a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, eluire i peptidi triptici aggiungendo 40 microlitri di soluzione di bicarbonato di ammonio da 50 millimolari all'unità filtrante e centrifugare la miscela a 14.000 volte G per 10 minuti. Quindi ripeti questo passaggio ancora una volta.

A questo punto, iniettare da 50 a 100 microgrammi di campione di proteine digerite su una colonna a scambio cationico di 200 x 2,1 millimetri e cinque micrometri Per separare i peptidi, monitorare le frazioni peptidiche a 280 nanometri e raccogliere le frazioni a intervalli di due minuti. Utilizzando un raccoglitore di frazioni, essiccare le frazioni in un concentratore sottovuoto. Al termine, conservare le frazioni essiccate a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso per la cromatografia liquida.

Analisi di spettrometria di massa tandem. In un altro approccio, il frazionamento senza gel è stato utilizzato per separare la miscela proteica. Una volta che il surnatante della proteina cocleare è stato desalinizzato mediante precipitazione dell'acetone, aggiungere 30 microlitri di tampone campione cinque volte alla proteina desalinizzata precedentemente sospesa in 112 microlitri di acqua Milli Q.

Quindi, aggiungi otto microlitri di un molare DTT e riscalda la miscela a 95 gradi Celsius per cinque minuti per ridurre i legami disolfuro proteico. Dopo il riscaldamento, lasciare raffreddare il composto. Aggiungere otto millilitri di tampone di scorrimento al serbatoio dell'anodo, 150 microlitri di tampone di corsa alla camera di raccolta del campione e sei millilitri di tampone di corsa al serbatoio del catodo.

Dopo questo carico, 150 microlitri della miscela di proteine cocleari nella camera di caricamento del campione, utilizzando una cartuccia di acetato di tris all'8% con un intervallo di massa da 3,5 a 150 kilodalton. Dopo aver iniziato la seduta, prelevare il campione dalla camera di raccolta del campione ad ogni intervallo di pausa sullo strumento utilizzando una pipetta e aggiungerlo a una microprovetta appena etichettata. Quindi lavare la camera di raccolta due volte con 150 microlitri di tampone di scorrimento e gettarla.

A seguito di elettroforesi su gel 1D delle frazioni libere da gel. Aggiungere ogni singola frazione direttamente in un'unità filtrante da 30 K. Quindi mescolare ogni frazione con 200 microlitri di urea a otto molari in tris HCL dopo centrifugazione a 14.000 volte G per 25 minuti, aggiungere 10 microlitri di 10 XI oto acetammide in soluzione di urea al concentrato in ciascuna unità filtrante e vorticare per un minuto.

Dopo aver posizionato i filtri centrifughi in un rack per microcentrifuga, incubare i campioni per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Quindi, aggiungere 0,1 microgrammi per microlitro di LY C per un rapporto enzima/proteina da uno a 50 alle unità filtranti dopo l'incubazione notturna a 30 gradi Celsius, aggiungere 40 microlitri di soluzione di bicarbonato di ammonio millimolare da 100 millimolari ai filtri rotanti e centrifugare i campioni a 14.000 volte G per 10 minuti dopo aver ripetuto il passaggio precedente una volta, Lavare i filtri rotanti tre volte con 100 microlitri di soluzione di bicarbonato di ammonio da 50 millimolari, aggiungere 0,4 microgrammi per microlitro di tripsina in un rapporto enzima/proteine da uno a 100 dopo il lavaggio finale. Una volta che i campioni sono stati incubati per una notte a 37 gradi Celsius, eluire i peptidi del trittico da ciascuna unità filtrante aggiungendo 40 microlitri di soluzione di bicarbonato di ammonio da 50 millimolari e centrifugare i campioni a 14.000 volte G per 10 minuti.

Dopo aver ripetuto questa operazione, il primo passaggio consiste nell'analizzare i campioni mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa tandem. Sono state utilizzate due procedure di doppia digestione. La prima è stata una digestione a trittico, seguita da una seconda digestione con tripsina, che sono state raggruppate frazionate su una colonna a forte scambio cationico in 18 frazioni e analizzate mediante spettrometria di massa tandem con cromatografia nanoliquida.

Un totale di 1.485 proteine sono state identificate con un FDR dell'1% durante l'esecuzione di una spettrometria di massa tandem con cromatografia liquida a ciclo singolo. Utilizzando questo approccio sperimentale. Tra le proteine identificate, 324 e 258 proteine sono state classificate rispettivamente in mitocondrio e membrana plasmatica.

La seconda procedura di doppia digestione consisteva nella digestione della lisa C, seguita dalla digestione della tripsina. Ogni digesto è stato caricato e separato individualmente sulla colonna a scambio cationico forte in 18 frazioni e analizzato mediante cromatografia nano liquida con spettrometria di massa tandem. I risultati della digestione LY C e tripsina hanno prodotto un totale di 3.503 proteine con un FDR dell'1%.

Inoltre, 605 e 617 proteine sono state classificate rispettivamente in mitocondri e membrana plasmatica. Questo approccio ha fornito il maggior numero di ID proteici associati alla membrana. Analisi in doppio del LY C e della tripsina.

Le frazioni hanno mostrato che più di 65 delle proteine identificate erano condivise tra gli esperimenti. Tuttavia, nell'analisi replicata sono state identificate anche proteine di recente. I peptidi e le proteine aggiuntivi sono stati identificati a causa di piccoli cambiamenti nella cromatografia, portando quindi a peptidi diversi per la frammentazione.

È stato preparato un gel colorante d'argento per visualizzare i risultati del frazionamento senza gel come illustrato. Qui, il gel ha mostrato la separazione delle proteine aumentando il peso molecolare per ogni frazione consecutiva. Pertanto, le 12 frazioni liquide prive di gel sono state digerite utilizzando due diversi approcci di digestione multifacet e analizzate mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa tandem.

Il primo approccio di digestione è stato eseguito utilizzando una doppia digestione della tripsina, che ha portato all'identificazione di 2.165 proteine con un FDR dell'1% durante l'esecuzione di una spettrometria di massa tandem con cromatografia liquida a ciclo singolo. In questo esperimento, 516 e 399 proteine sono state classificate rispettivamente nel mitocondrio e nella membrana plasmatica. Il secondo approccio di digestione è stato eseguito utilizzando l'endoproteinasi ly C seguita dalla digestione della tripsina, cromatografia liquida a corsa singola.

L'analisi della spettrometria di massa tandem ha identificato 2.211 proteine con un FDR dell'1%. Questo approccio ha mostrato un numero simile di proteine associate alla membrana poiché quando si utilizza l'approccio della tripsina tripsina, i dati della proteomica della spettrometria di massa sono stati depositati al Proteome Exchange Consortium con l'identificatore del set di dati PXD 0 0 0 2 3 1. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare la contaminazione in ogni fase e di mantenere il tessuto sul ghiaccio quando si esegue l'estrazione delle proteine per evitare la degradazione delle proteine.