In Vivo Imaging ottico dei tumori cerebrali e artrite Uso fluorescente SAPC-DOPS nanovesicles

Descriviamo un multi-angolo di rotazione imaging ottico del sistema (Maroi) in vivo quantificazione di un marcatore fluorescente consegnato da saposin C (SAPC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Impiegando modelli murini di cancro e artrite, si dimostra come l'analisi della curva Maroi segnale può essere utilizzato per la mappatura precisa e caratterizzazione biologica dei processi patologici.

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire l'imaging in vivo a 360 gradi di un topo per determinare l'angolo ottimale per l'analisi della fluorescenza. Ciò si ottiene preparando prima i modelli animali di tumore cerebrale ortotopico, tumore cerebrale ingegnerizzato e artrite. Successivamente viene prodotta la proteina C di SAPs e vengono preparate le nano vescicole SAP D-O-P-S-C-V-M.

Quindi le nano vescicole vengono iniettate nella vena caudale degli animali. Infine, vengono acquisite e analizzate immagini a fluorescenza e a raggi X. In definitiva, il metodo M-A-R-O-I viene utilizzato per mostrare l'angolo ottimale per l'analisi di imaging a fluorescenza.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'imaging a fluorescenza planare 2D, è che il metodo M-A-O-M-A-R-O-I consente agli investigatori di determinare l'angolo ottimale per l'analisi dell'imaging a fluorescenza. Le implicazioni di questa tecnica si espandono verso la terapia e la diagnosi di cancro e artrite perché CEP CS Vesical può colpire il tumore e il tessuto infiammatorio. Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Cincinnati e dalla Cincinnati Children's Hospital Research Foundation per condurre questi studi e il tumore cerebrale ortotopico del topo.

Vengono utilizzati un topo con tumore cerebrale geneticamente modificato e un modello murino per artrite AKBXN Secondo il protocollo di testo, utilizzare un sistema di punteggio macroscopico dell'indice artritico per valutare i topi per l'artrite come segue, zero equivale a nessuna artrite rilevabile, uno equivale a gonfiore e/o arrossamento della zampa o un dito due equivale a due articolazioni coinvolte. Tre uguali tre articolazioni coinvolte e quattro uguali artrite grave dell'intera zampa e del dito producono la proteina C SAPs umana ricombinante nelle cellule di E coli prima di precipitare con etanolo e la purificazione con cromatografia liquida ad alte prestazioni dopo la liofilizzazione determina la concentrazione di SAP C secco in peso. Per miscelare la proteina SAP C, combinare 0,18 milligrammi di DOPS e 0,03 milligrammi di CVM in una provetta di vetro e utilizzare l'azoto gassoso per far evaporare i solventi lipidici.

Quindi aggiungere 0,32 milligrammi di proteine marine in polvere SAPs alla miscela. Sospendere la miscela secca in un millilitro di tampone PBS e bagnare sonicato per 15 minuti. Passare la sospensione attraverso una colonna Cidex G 25 per rimuovere il colorante CVM libero.

Le nanoparticelle SAP C-D-O-P-S-C-V-M avranno un'eccitazione e un'emissione massime rispettivamente di 653 nanometri e 677 nanometri. Per testare l'imaging ottico rotazionale multi-angolo o il metodo M-A-R-O-I utilizzando il sistema Mars, dopo aver anestetizzato un topo da uno dei modelli murini descritti con fluoro ISO al 2%, posizionare il mouse in posizione supina nel sistema Marziano con la colonna vertebrale diretta verso la fotocamera dalla schermata di anteprima della linguetta del rotatore brucker MI, calibrare la pellicola di supporto a 380 gradi di Marte. Per posizionare il topo per somministrare i SAP C-D-O-P-S-C-V-M nella coda del topo, iniettare 200 microlitri per via endovenosa 24 ore dopo, e poi di nuovo da sette a nove giorni dopo l'iniezione, acquisire immagini a fluorescenza e radiografie con incrementi di 10 gradi su un corso di 380 gradi, creando una leggera sovrapposizione per garantire che non vi siano lacune nel set di dati rotazionale.

Utilizzando il software di rotazione Bruker, è possibile sovrapporre immagini fluorescenti a immagini a raggi X per la localizzazione anatomica. Per analizzare le immagini, disegna una regione rettangolare di interesse, o ROI che comprende l'ampiezza del campo visivo, o FOV del sito della malattia per i topi con tumore cerebrale. Utilizza la stessa ROI su ciascun modello di tumore e sui rispettivi topi di controllo per tutti i punti temporali utilizzando punti di riferimento anatomici per contrassegnare la posizione della ROI dopo la sottrazione automatica dello sfondo.

Determinare l'intensità media della fluorescenza per ogni immagine utilizzando il software Brucker MI per convertire le immagini a fluorescenza in fotoni al secondo per millimetro quadrato, tracciare i valori di fluorescenza in funzione degli angoli di imaging e applicarli come barre di errore. La deviazione standard dei valori medi di fluorescenza ottenuti dai topi di controllo. L'immagine a fluorescenza di un topo portatore di tumore ortotopico rappresentativo è mostrata in questa figura.

Dimostriamo qui che i semi di SAP, nano vescicole DOPS marcate con un colorante rosso lontano, si accumulano specificamente nei tumori cerebrali ortotopici e spontanei di topo, così come nelle articolazioni artritiche dei topi KBXN. Lo scopo principale del sistema marziano è quello di determinare l'angolo ottimale di fluorescenza in modo che le misurazioni più accurate possano essere effettuate come si vede qui. L'angolo di immagine ottimale per questo animale è di 10 gradi.

La posizione in cui l'intensità del fotone di fluorescenza è la più grande misurazione di base è stata presa prima dell'iniezione di SAP C-D-O-P-S-C-V-M e 24 ore dopo l'iniezione i topi di controllo liberi dal tumore hanno ricevuto un trattamento simile. Queste cifre mostrano dati comparabili dal modello murino di tumore cerebrale geneticamente modificato. Le immagini a fluorescenza e le misurazioni dei fotoni sono state effettuate al basale 24 ore e nove giorni dopo l'iniezione di SAP C-D-O-P-S-C-V-M.

I grafici mostrano che l'angolo di imaging ottimale nel tumore animale che porta il tumore mute 49 è di 20 gradi, 24 ore dopo l'iniezione, ma cambia a 10 gradi nove giorni dopo l'iniezione. Ciò suggerisce che l'alterazione del segnale fluorescente era correlata a cambiamenti morfologici che probabilmente riflettevano la crescita del tumore. Come mostrato in questa tabella, il metodo M-A-R-O-I dimostra chiaramente che il segnale fluorescente diminuisce per le proiezioni all'aumentare della rotazione lontano dall'angolo di imaging ottimale.

Nei tumori cerebrali, è stata ottenuta una diminuzione media del 7% del segnale fluorescente. Se l'orientamento fisico dell'animale era più di più o meno 10 gradi di scostamento dall'angolo di imaging ottimale. Una diminuzione media del 21% del segnale fluorescente è stata misurata a più o meno 20 gradi.

Pertanto, offset relativamente piccoli dall'angolo ottimale possono comportare diminuzioni percentuali significative del segnale. L'utilizzo della tecnica M-A-R-O-I per il posizionamento delle immagini consentirà agli investigatori di produrre dati più coerenti e affidabili. Il metodo M-A-R-O-I è stato infine utilizzato per valutare il targeting delle articolazioni artritiche da parte dei SAP C-D-O-P-S-C-V-M 24 ore dopo l'iniezione.

Questo animale ha ottenuto tre punti con tre articolazioni artritiche. Le immagini a fluorescenza dell'alluce e della caviglia del topo artritico sono mostrate qui sulla base di grafici delle corrispondenti misurazioni dei fotoni A rotazioni di 10 gradi, gli angoli di imaging ottimali trovati per l'alluce e la caviglia sono rispettivamente di 140 gradi e 120 gradi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare e acquisire i dati M-A-R-O-I che consentono agli investigatori di determinare l'angolo ottimale per l'analisi dell'imaging a fluorescenza.