Name: In Vivo Imaging ottico dei tumori cerebrali e artrite Uso fluorescente SAPC-DOPS nanovesicles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Scopri l'imaging ottico MAROI per l'analisi della fluorescenza in modelli murini di tumore cerebrale e artrite. Questo metodo consente di determinare l'angolo ottimale per misurazioni accurate in vivo.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal NIH / NCI Grants Numero 1R01CA158372-01 (Qi) e New Drug State Key Project di Grant Numero 009ZX09102-205 (Qi). Assistenza Scrittura è stato fornito dal Dr. Judy Racadio, ed è stato finanziato dall&#39;Università di Cincinnati Dipartimento di Ematologia e Oncologia. Vontz Nucleo Imaging Lab (VCIL) presso la Facolta &#39;di Medicina presso l&#39;Università di Cincinnati.

Etica dichiarazione di utilizzo degli animali. Tutti gli studi su animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso dell &#39;Università di Cincinnati (Numero IACUC Protocol: 11-05-05-02) e l&#39;Ospedale Research Foundation dei Bambini di Cincinnati (Animal Welfare Assurance Number A3108-01). Tutti gli esperimenti che coinvolgono i topi hanno seguito le linee guida per la cura degli animali dell&#39;Università di Cincinnati e l&#39;Ospedale Fondazione di Ricerca Pediatrico di Cincinnati. 1. Preparare Modelli Animali Nota: Tre diversi modelli animali descritti di seguito sono stati utilizzati nei nostri studi precedenti: <ol><li> Ortotopico tumore al cervello di topo: Usare Nu / Nu atimico topi femmina che sono stati intracranially iniettati con cellule U87-ΔEGFR-Luc umani. Questi topi sviluppano un tumore aggressivo che mostra le caratteristiche tipiche di glioblastoma umano. </li><li> Modelli di cervello di topo tumore geneticamente 13: Breed MUT3 (GFAP-cre; Nf1loxP / +; Trp53-/ +) topi maschi con Trp53loxP/loxP; Femmine PtenloxP / loxP per generare topi Mut6 (GFAP-CRE; Nf1loxP / +; Trp53-/loxP, PtenloxP / +). Mantenere topi MUT3 in ceppo B6CBAF1 / J allevando topi MUT3 maschio con B6CBAF1 femmina / J topi. Genotipo topi tra P9 e P12 e confermare i genotipi dopo la raccolta i loro tessuti. </li><li> Artrite K / BXN: topi Usa C57BL/6J che sono stati somministrati per via intraperitoneale con 150 microlitri sieri di KRN x topi NOD F1. Questi topi sviluppano l&#39;artrite 24-48 ore dopo l&#39;iniezione sieri. Imaging dei topi artritici viene effettuata il giorno 7 dopo somministrazione sieri, un punto di tempo in cui i topi mostrano artrite macroscopico palese. I topi dovrebbero essere valutati in base ai criteri delineati nella fase successiva. <ol><li> Valutazione del mouse per l&#39;artrite macroscopica utilizzando un indice di sistema di punteggio macroscopico artritici come segue: 0 = nessuna artrite rilevabile, 1 = gonfiore e / o arrossamento della zampa o una cifra, 2 = due articolazioni coinvolte, 3 = tre giunti coinVED, e 4 = artrite severa di tutta la zampa e cifre. Il sistema di punteggio artritico è utilizzato per determinare il numero di articolazioni colpite e la gravità di artrite nelle zampe di topo. Anche i topi con il più alto punteggio possibile artritico raramente mostrano segni di immobilità. Tuttavia, l&#39;artrite è 3x/settimana monitorato e topi nel dolore eccessivo (come grave immobilità da zampe gonfie che inibisce il consumo di cibo e acqua) sono sacrificati. </li><li> Nota: Fluidi IV iniettato nella vena della coda del mouse sono sterilità mantenuta per tutto l&#39;esperimento. Pulito, sterili, siringhe monouso e fiale vengono utilizzati per la preparazione e la somministrazione soluzione studio. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di fluorescenza marcata SAPC-DOPS nanovesicles <ol><li> SAPC produzione di proteine: proteine ​​ricombinanti SAPC con esatta sequenza SAPC umana è stata prodotta in E. coli come precedentemente descritto con modifiche 4.SAPC è stato precipitato da etanolo seguita da purificazione cromatografia liquida ad alte prestazioni. Dopo liofilizzazione, asciutto SAPC stato utilizzato e la sua concentrazione è stata determinata mediante il suo peso. </li><li> Mix di proteine ​​SAPC come descritto in precedenza 7,10,11. Mix DOPS (0,18 mg) e CVM (0,03 mg) in una provetta di vetro e utilizzando gas azoto per evaporare solventi lipidici. </li><li> Aggiungi SAPC proteine ​​in polvere (0,32 mg) alla miscela, sospendere la miscela secca in 1 ml di tampone PBS e bagno a ultrasuoni per circa 15 minuti come descritto in precedenza 7,10,11. Poi passare la sospensione attraverso una colonna Sephadex G25 (PD-10) per rimuovere libera CVM colorante. Eccitazione e massimi di emissione del prodotto finale, cioè nanovesicles SAPC-DOPS-CVM, sono 653 nm e 677 nm, rispettivamente. </li></ol> 3. Imaging <ol><li> Utilizzare tumore al cervello e modelli murini artrite (sopra descritto nella Fase 1) per testare il sistema Maroi. Anestetizzare topi di effettuare con il 2% isoflurano. 1-2% isoflurano è maintainato per la durata della procedura di imaging. L&#39;aria calda viene continuamente e delicatamente trasportato nella camera di imaging per la durata di imaging. Una piccola quantità di sterile lacrime artificiali unguento viene applicato a ciascun occhio del mouse in modo da coprire e lubrificare l&#39;occhio. Posizionare topi nel sistema MARS posizionando il mouse in posizione supina con la spina dorsale inizialmente diretta verso la telecamera (Figura 1). Calibrare il film di supporto ° MARS 380 e posizionare il mouse utilizzando il software di rotazione nella scheda protocollo Bruker MI. Ottenere immagini di base di topi prima della somministrazione SAPC-DOPS-CVM nel modo descritto di seguito. </li><li> Iniettare 200 ml di SAPC-DOPS-CVM via endovenosa nella vena della coda del topo. Somministrare ai topi di controllo e topi portatori di tumore artritici o cerebrali. </li><li> Topi Immagine 24 ore dopo l&#39;iniezione e di nuovo a 7-9 giorni dopo l&#39;iniezione prendendo fluorescenza (25 sec tempo di esposizione) e X-ray (10 sec tempo di esposizione), imaghi a incrementi di 10 ° su un percorso di 380 °, creando una leggera sovrapposizione per garantire non ci sono lacune nel dataset rotazionale. Utilizzando il software Bruker MI, sovrapporre fluorescente su immagini a raggi X per la localizzazione anatomica. </li></ol> 4. Image Analysis <ol><li> Disegnare un ROI rettangolare che comprende la larghezza del campo di vista (FOV) del sito malattia (tumore e artrite). Il ROI deve essere grande abbastanza per mantenere la caratteristica malattia nel FOV come l&#39;animale si muove nel corso della rotazione di 380 °. Per i topi di tumore cerebrale (modelli ortotopici e transgenici), utilizzare lo stesso ROI rettangolare su ogni modello di tumore e le sue tre (3) topi rispettivo controllo di tutti i tempi (di base, 24 ore e 9 giorni). Il posizionamento della ROI rettangolare per ogni mouse viene conservato per tutti i punti temporali utilizzando punti di riferimento anatomici sulle corrispondenti immagini radiografiche di ogni animale. Il riferimento anatomico (s) identificato dal modello tumore deve essere utilizzato anche per place ROI rettangolari identici rispettivi controlli di ciascun modello. Punti di repere anatomici individuati sulle immagini a raggi X che consentono il posizionamento coerente ROI sono alla base del cranio e la faccia posteriore dell&#39;arcata zigomatica. Essi sono visualizzate a destra e sinistra del cranio laterale dell&#39;immagine postero-anteriore (PA) in. </li><li> Dopo automatico background sottrazione, determinare l&#39;intensità di fluorescenza media per ogni immagine. Convertire le immagini di fluorescenza di fotoni / s / mm 2 utilizzando software di imaging Bruker MI. Tracciare i valori di fluorescenza in funzione degli angoli di imaging, e applicare come errore sbarra la deviazione standard dei valori di fluorescenza medi ottenuti da topi di controllo usando Excel o altro software grafici. </li></ol>

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<li>Kwon, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pten+haploinsufficiency+accelerates+formation+of+high-grade+astrocytomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Pten haploinsufficiency accelerates formation of high-grade astrocytomas.</a> Cancer Res. 68, 3286-3294 (2008).</li>
</ol>

Non c&#39;è nulla da rivelare.

Determinazione accurata della posizione e grandezza dei tumori solidi e focolai infiammatori in condizioni reumatiche è fondamentale per attuare un adeguato trattamento e follow-up progressione della malattia o la remissione. Mentre, preziose strategie attuali di imaging (raggi X, risonanza magnetica, ultrasuoni, raggi X tomografia computerizzata) fornire valutazioni incomplete di stato della malattia. Ad esempio, il danno articolare artritico è comunemente valutata dai raggi X, che fornisce informazioni sulla struttura ossea ma non l&#39;infiammazione dei tessuti molli e la distruzione, caratteristica dei primi stadi della malattia. Il metodo Maroi presentato qui unisce i vantaggi di entrambi i raggi X e sofisticate modalità di imaging dei tessuti molli (ad esempio MRI o ultrasuoni) in una piattaforma integrata, non invasiva e semplice che consente anche una mappatura completa in 3D e la ricostruzione del tessuto malato o organo in piccoli animali come topi. Questo metodo sfrutta l&#39;affinità selettiva of SAPC-DOPS nanovesicles per residui fosfatidilserina esposti, che sono abbondanti nelle membrane di cancro e cellule infiammatorie. Il determinante di questa associazione è SAPC, una proteina lisosomiale fusogenica con una forte affinità per i fosfolipidi anionici come fosfatidilserina 7,10,11. Quando coniugata con una sonda fluorescente (CVM), sistemica iniettato SAPC-DOPS possono essere ricondotte al tumore e siti artritici da imaging di fluorescenza. Limiti del nostro metodo sono legati alla sua sensibilità, che attualmente limita l&#39;uso di imaging di piccoli animali come topi. Come con altri metodi di imaging, segnale fluorescente ottimale di rumore è limitato dalle dimensioni del tumore o la portata di artrite, e può essere compromessa quando imaging di tessuti o organi, con fondo elevato (autofluorescenza) come orecchie (brain imaging), intestino / feci (di imaging addominale) e zampe (imaging arti posteriori). A questo proposito, abbiamo scoperto che un colorante rosso lontano come CVM profornisce una maggiore separazione risoluzione spettrale e nell&#39;impostazione in vivo di altre sonde fluorescenti nella gamma visibile. Altre insidie ​​sono potenzialità del movimento dell&#39;animale durante l&#39;imaging, sia mentre anestetizzato e post mortem (rigor mortis). Posizionamento dell&#39;arto posteriore, in particolare, è spesso difficile da stabilizzare per evitare movimenti durante la rotazione. Allo stato attuale della tecnica è anche molto tempo, con tempi di scansione fino a 60 minuti per completare una rotazione completa e acquisire immagini di alta qualità. Il metodo Maroi presenta una serie di vantaggi rispetto ad altre modalità di imaging. La capacità di immagine tessuto malato da 38 (o più) diverse angolazioni permette la visualizzazione di fluorescenza che può essere ostacolato nel valutare da un unico piano; questo è prezioso in studi sugli animali perché può aiutare a minimizzare il numero di falsi negativi che derivano dalle immagini ad angoli inappropriati. Per OVERLying raggi X e immagini di fluorescenza, una precisa localizzazione anatomica della zona malata può essere determinato. Infine, la possibilità di vivere l&#39;imaging (in vivo) consente studi longitudinali da eseguire.

Tutta la rappresentazione degli animali è diventato un potente strumento nello studio della fisiopatologia animale. Tra i sistemi di imaging attuali, MS PRO FX permette ai ricercatori di accuratamente etichettati dettagli di fluorescenza (o luminescenti) composti e / o tessuti nei topi viventi, e contemporaneamente ottenere immagini radiografiche. Con il sistema (MARS) recentemente introdotto multimodale rotazione animale un completo, la rotazione automatica del mouse è realizzata in modo da catturare sia fluorescente / luminescenti e immagini a raggi X ad angoli specifici 1. Acquisizione delle immagini può essere programmato in modo tale che immagine serie sequenziale può essere catturato a specifici angoli incrementali piccolo come 1 °. Questo permette di identificare l&#39;orientamento ottimale dell&#39;animale, cioè. quello in cui la distanza tra il segnale fluorescente / luminescenti generato internamente e dispositivo di rilevazione del sistema è il più corto. Questo, a sua volta, facilita il riposizionamento preciso dell&#39;animale per l&#39;imaging successiva séssions durante gli studi longitudinali. In questo rapporto, descriviamo l&#39;implementazione di un sistema multi-angolo di imaging ottico di rotazione (Maroi) in vivo quantificazione dell&#39;intensità marcatore fluorescente. Maroi analisi della curva di segnale può essere utilizzato in studi longitudinali per correlazione diretta di distribuzione del segnale fluorescente per mappare con precisione i siti malate o processi biologici di interesse. Questo sistema è stato utilizzato per monitorare l&#39;assorbimento di fluorescente nanovesicles SAPC-DOPS da tumori ortotopiche e spontanei, nonché da foci artritici, nei topi vivente; forniva insiemi di dati multispettrali e multimodali derivati ​​da copertura completa rotazione degli animali. Tra le numerose sonde fluorescenti attualmente disponibili per imaging in vivo, quelli che emettono nelle regioni spettrali nel vicino infrarosso e lontano-rosso conferisce l&#39;interferenza minima con la pelle e tessuti, e forniscono la penetrazione e di immagine più alta risoluzioneolution. Abbiamo usato CellVue Maroon (CVM) 2,3, un linker lontano globuli rossi fluorescenti (Ex 647/Em 667), per etichettare SAPC-DOPS (SAPC-DOPS-CVM) 4-12.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>11965</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>16000077</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Hyclone (Logan, Utah)</td><td>SV30010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>Lipidi polari Avanti <td>Dietolifosfatidilserina</td><td>(Alabastro, AL)</td><td>840035C</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CellVue Maroon</td><td>Molecular Targeting Technologies, Inc. (Exton, PA)</td><td>C-1001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Colonna Sephadex G25 PD-10</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, (Piscataway, NJ)</td><td>17-0851-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nuovo stereotassico standard per ratti e topi</td><td>Apparato di Harvard (Holliston, MA)</td><td>726335</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pulitori ad ultrasuoni Bransonic Modello 1510</td><td>Branson Ultrasonics (Danbury, CT)</td><td>CPN-952-118</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema FX multispettrale</td><td>Bruker Corporation (Billerica, MA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di imaging ottico rotazionale multi-angolo</td><td>Bruker Corporation (Billerica, MA)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vivo imaging ottico dei tumori cerebrali e artrite uso fluorescente sapc-dops nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

Descriviamo un multi-angolo di rotazione del sistema di imaging ottico (Maroi) per il monitoraggio in vivo di processi fisiopatologici marcati con un marcatore fluorescente. Modelli murini (tumore al cervello e artrite) sono stati usati per valutare l&#39;utilità di questo metodo. Saposin C (SAPC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles taggati con CellVue Maroon (CVM) fluoroforo sono stati somministrati per via endovenosa. Gli animali sono stati quindi posti nel supporto rotazionale (MARS) del sistema di imaging in vivo. Le immagini sono state acquisite in 10 ° passi oltre 380 °. Una regione rettangolare di interesse (ROI) è stato posto su tutta la larghezza dell&#39;immagine presso il sito della malattia modello. All&#39;interno del ROI, e per ogni immagine, intensità di fluorescenza media è stata calcolata dopo la sottrazione del fondo. In modelli murini studiati, i nanovesicles etichettati state riprese in entrambi i tumori cerebrali ortotopiche e transgeniche, e nei siti artritici (punte e caviglie). Analisi della curva dell&#39;angolo più image ROI determinato l&#39;angolo con il segnale più elevato. Così, l&#39;angolo ottimale per l&#39;imaging ogni sito malattia è stata caratterizzata. Il metodo Maroi applicata all&#39;imaging di composti fluorescenti è uno strumento non invasivo, economico e preciso per l&#39;analisi quantitativa in vivo degli stati di malattia nei modelli murini descritti.

Abbiamo dimostrato qui che nanovesicles SAPC-DOPS marcate con un colorante rosso lontano (CVM) specificamente accumulano nei tumori cerebrali topo ortotopico e spontanee, nonché nelle articolazioni artritiche di topi K / BXN. Immagini seriali fluorescenza / radiografiche acquisite da un ROI disposta sopra ciascun sito malattia durante rotazioni complete dei topi sono stati sottoposti ad analisi Maroi curva, che ha rivelato l&#39;angolo di visione ottimale con la massima intensità di fluorescenza. Lo scopo principale per utilizzare il sistema MARS è quello di determinare l&#39;angolo ottimale della fluorescenza in modo che possano essere adottate le misure più accurate. Sono mostrati i risultati rappresentativi di tre esperimenti su topi con tumori cerebrali o artrite. Uso SAPC-DOPS-CVM e il sistema MARS (Figura 1), l&#39;angolo migliore immagine possibile per l&#39;osservazione del tumore o infiammazione a causa di artrite è stata determinata. Immagini di fluorescenza, seguita da una acquisizione radiografica, sono stati acquisiti ogni 10 °durante una rotazione di 380 ° del mouse. Immagini di fluorescenza sono stati sovrapposti sulle corrispondenti immagini a raggi X per la visualizzazione delle immagini e la generazione di film di rotazione. I risultati del modello di tumore cerebrale ortotopico sono dimostrate in Figura 2. L&#39;immagine di fluorescenza di un rappresentante ortotopico topo portatore di tumore (Ortho1) è mostrato in Figura 2A. L&#39;angolo di immagine ottimale per questo animale è 10 °, la posizione in cui l&#39;intensità di fluorescenza fotone è il più grande (Figura 2B). Le misure sono state prese prima iniezione con SAPC-DOPS-CVM (baseline) e 24 ore dopo l&#39;iniezione. Topi di controllo (tumore libero) hanno ricevuto un trattamento simile. La figura 3 mostra dati comparabili dal tumore al cervello modello di topo geneticamente modificato. Le immagini a fluorescenza e le misure di fotoni sono state prese prima iniezione con SAPC-DOPS-CVM (baseline) e 24 ore (figure 3A e &lt;strong&gt; 3B) e 9 giorni (Figura 3C) dopo l&#39;iniezione. Questi grafici mostrano che l&#39;angolo di imaging ottimale nel tumore-cuscinetto animali (Tumor Mut49) è di 20 ° 24 ore dopo l&#39;iniezione, ma le modifiche ai 10 ° 9 giorni dopo l&#39;iniezione. Ciò suggerisce che l&#39;alterazione del segnale di fluorescenza correlato con i cambiamenti morfologici, probabilmente riflette la crescita tumorale. Come mostrato nella Tabella 1, il metodo Maroi dimostra chiaramente che il segnale fluorescente diminuisce per proiezioni ad aumentare la rotazione distanti l&#39;angolo ottimale di imaging. In tumori cerebrali, una diminuzione media 7% del segnale fluorescente è stato ottenuto se orientamento fisico dell&#39;animale stato di ± 10 ° rispetto alla dall&#39;angolo di imaging ottimale. Una diminuzione media del 21% nel segnale fluorescente è stata misurata a ± 20 °. Quindi relativamente piccoli spostamenti dall&#39;angolo ottimale può portare a notevoli attenuazione del segnale. Utilizzando la tecnica Maroi per il posizionamento dell&#39;immagine consentirà investigators per produrre dati più coerenti e affidabili. Il metodo Maroi è stato infine utilizzato per valutare l&#39;orientamento dei articolazioni artritiche da SAPC-DOPS-CVM 24 ore dopo l&#39;iniezione SAPC-DOPS-CVM. Questo animale ha ottenuto 3 con tre articolazioni artritiche. Immagini di fluorescenza di punta e caviglia del mouse artritici sono mostrate nelle Figure 4A e 4B. Misure fotoni corrispondenti a intervalli di 10 ° di rotazione sono rappresentati graficamente nelle figure 4C e 4D. Gli angoli di imaging ottimali trovati per la punta e caviglia sono 140 ° e 120 ° rispettivamente. In sintesi, la combinazione del sistema Maroi con fluorescenti nanovesicles SAPC-DOPS rappresenta una strategia non invasiva, precisa e altamente sensibile per l&#39;imaging in tempo reale, che consente studi quantitativi e progressione tumorale artrite nei piccoli animali. La possibilità di acquisire un set di dati di imaging multimodale ° 360 notevolmente improvvisazioneanalisi e interpretazione dei dati ES, rispetto a quanto ottenibile con tecniche di imaging di un singolo angolo. <img alt="Tabella 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187table1.jpg" width="600px" /> Tabella 1. Angoli di imaging ottimali per ogni modello di topo. Le differenze tra l&#39;angolo di massima fluorescenza fotone (FLR angolo ottimale) e l&#39;angolo anatomico standard (raggi X) può essere visto. Quando questi due angoli diventano sempre diverso, il segnale misurato cambia in modo significativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1.jpg" width="600px"/&gt; Figura 1. Dispositivo di rotazione imaging ottico (Maroi) Multi-angolazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2.jpg" width="600px" /> Segnale di fluorescenza vs angolo di Figura 2. Immagine di un tumore al cervello modello ortotopico del mouse. (A). Immagine del segnale di picco fluorescente all&#39;angolo immagine ottimale di 10 °. La scatola blu indica il ROI utilizzato per quantificare i fotoni emessi. (B). Grafico dell&#39;angolo dell&#39;immagine rispetto emissione di fotoni. Il rappresentante del mouse ortotopico tumore-cuscinetto (Ortho1) viene rappresentata graficamente con i valori di fluorescenza medi di ROI identico in tre topi non tumorali. Le misurazioni sono state prese al basale (prima dell&#39;iniezione) e 24 ore di post injection. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3.jpg" width="600px" /> Figura 3. Segnale di fluorescenza vs angolo di immagine in un tumore cerebrale spontanea di un modello di topo transgenico. (A). Immagine del segnale fluorescente picco di ROI 1 (top box blu) con l&#39;angolo ottimale di immagine di 20 °. (B) e (C). Grafici dell&#39;angolo immagine contro emissione di fotoni da ROI 1. Valori da una rappresentante cerebrale spontanea del mouse del tumore-cuscinetto, Tumor-Mut 49, sono rappresentati graficamente rispetto ai valori medi di tre topi non tumorali. Le misurazioni sono state prese al basale (prima dell&#39;iniezione) e iniezione 24 ore (B) e 9 giorni (C) post. Errore b<html> ars rappresentano Deviazione Standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4.jpg" width="600px" /> Segnale di fluorescenza vs angolo di Figura 4. Immagine di un topo con l&#39;artrite del piede e della caviglia. (A) e (B). Le immagini mostrano il segnale di picco fluorescente per le dita dei piedi (A) e le articolazioni della caviglia (B), entro i ROI indicati nel riquadro rosso. (C). Grafico dell&#39;angolo rispetto significano emissione di fotoni per la punta. Emissione di fotoni picco può essere visto con un angolo di 140 ° (D) Grafico di angolo rispetto significa emissione di fotoni per la caviglia..; massima intensità si verifica ad un angolo di 120 °.target = &quot;_blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.

Descriviamo un multi-angolo di rotazione imaging ottico del sistema (Maroi) in vivo quantificazione di un marcatore fluorescente consegnato da saposin C (SAPC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Impiegando modelli murini di cancro e artrite, si dimostra come l&#39;analisi della curva Maroi segnale può essere utilizzato per la mappatura precisa e caratterizzazione biologica dei processi patologici.

In Vivo Imaging ottico dei tumori cerebrali e artrite Uso fluorescente SAPC-DOPS nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un'immagine in vivo a 360 gradi di un topo per determinare l'angolo ottimale per l'analisi della fluorescenza. Questo viene realizzato preparando innanzitutto modelli animali di tumore cerebrale ortotopico, tumore cerebrale ingegnerizzato e artrite. Successivamente, viene prodotta la proteina SAPs C e vengono preparate nano vescicole SAP D-O-P-S-C-V-M.Successivamente, le nano vescicole vengono iniettate nella vena della coda degli animali. Infine, vengono acquisite e analizzate immagini a fluorescenza e a raggi X. In ultima analisi, il metodo M-A-R-O-I viene utilizzato per determinare l'angolo ottimale per l'analisi mediante imaging a fluorescenza.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'imaging fluorescente planare 2D è che il metodo M-A-O-M-A-R-O-I consente ai ricercatori di determinare l'angolo ottimale per l'analisi mediante imaging fluorescente. Le implicazioni di questo approccio tecnico si estendono alla terapia e alla diagnosi di cancro e artrite poiché CEP CS Vesical può bersagliare tessuti tumorali e infiammatori. Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Cincinnati e dalla Cincinnati Children's Hospital Research Foundation per condurre questi studi e il modello murino di tumore cerebrale ortotopico.Un modello murino di tumore cerebrale geneticamente modificato e un modello murino di artrite A-K-B-X-N vengono utilizzati. Secondo il protocollo descritto, utilizzare un sistema di punteggio macroscopico dell'indice artritico per valutare i topi per l'artrite come segue: zero corrisponde all'assenza di artrite rilevabile, uno indica gonfiore e/o arrossamento della zampa o di una singola dita, due indica interessamento di due articolazioni, tre indica interessamento di tre articolazioni e quattro indica artrite severa dell'intera zampa e delle dita. Produrre la proteina SAP C umana ricombinante in cellule di E. coli, quindi precipitarla con etanolo e purificarla mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni; dopo liofilizzazione, determinare la concentrazione della SAP C secca per peso. Per preparare la miscela della proteina SAP C, unire 0,18 milligrammi di DOPS e 0,03 milligrammi di CVM in un tubo di vetro ed utilizzare gas azoto per evaporare i solventi lipidici.Quindi aggiungere 0,32 milligrammi di polvere proteica SAPs sea alla miscela. Sospendere la miscela secca in un millilitro di tampone PBS e sottoporre a sonicazione a bagno per 15 minuti. Far passare la sospensione attraverso una colonna Cidex G 25 per rimuovere il colorante CVM libero.Le nanoparticelle SAP C-D-O-P-S-C-V-M avranno massimi di eccitazione e di emissione rispettivamente a 653 nanometri e 677 nanometri. Per testare il metodo di imaging ottico rotazionale multiangolare o M-A-R-O-I mediante il sistema Mars, dopo aver anestetizzato un topo proveniente da uno dei modelli murini descritti con 2% di isoflurano, posizionare il topo in posizione supina all'interno del sistema Mars, con la colonna vertebrale rivolta verso la telecamera, utilizzando la schermata di anteprima della scheda brucker MI rotator. Calibrare il supporto del film del sistema Mars su 380 gradi. Per posizionare il topo e somministrare le SAP C-D-O-P-S-C-V-M nella coda del topo, iniettare 200 microlitri per via endovenosa; 24 ore dopo, e nuovamente da sette a nove giorni dopo l'iniezione, acquisire immagini di fluorescenza e radiografie a incrementi di 10 gradi su un arco di 380 gradi, creando un leggero sovrapposizione per assicurare che non vi siano lacune nel dataset rotazionale.Utilizzando il software di rotazione di Bruker, sovrapporre le immagini fluorescenti alle immagini a raggi X per la localizzazione anatomica. Per analizzare le immagini, disegnare una regione di interesse rettangolare, o ROI, che comprenda l'intera larghezza del campo visivo, o FOV, del sito della malattia nei topi con tumore cerebrale. Utilizzare lo stesso ROI su ciascun modello tumorale e sui rispettivi topi di controllo per tutti i punti temporali, servendosi di punti di riferimento anatomici per indicare la posizione del ROI dopo la sottrazione automatica dello sfondo.Determinare l'intensità media della fluorescenza per ogni immagine utilizzando il software Brucker MI per convertire le immagini di fluorescenza in fotoni al secondo per millimetro quadrato, riportare i valori di fluorescenza in funzione degli angoli di acquisizione e applicare come barre di errore la deviazione standard dei valori medi di fluorescenza ottenuti da topi di controllo. L'immagine di fluorescenza di un topo rappresentativo con tumore ortotopico è mostrata in questa figura.Dimostriamo qui che le SAP, nano vescicole di DOPS marcate con un colorante a luce rossa lontana, si accumulano in modo specifico in tumori cerebrali ortotopici e spontanei nei topi, nonché nelle articolazioni artritiche dei topi KBXN. Lo scopo principale del sistema Mars è determinare l'angolo ottimale della fluorescenza in modo da ottenere le misurazioni più accurate possibili, come mostrato qui. L'angolo ottimale di imaging per questo animale è di 10 gradi.La posizione in cui l'intensità dei fotoni fluorescenti è massima è stata determinata mediante misurazioni di base effettuate prima dell'iniezione di SAP C-D-O-P-S-C-V-M e 24 ore dopo l'iniezione; i topi di controllo privi di tumore hanno ricevuto un trattamento analogo. Queste figure mostrano dati comparabili ottenuti dal modello murino di tumore cerebrale geneticamente modificato. Le immagini di fluorescenza e le misurazioni dei fotoni sono state effettuate a livello basale, a 24 ore e a nove giorni dall'iniezione di SAP C-D-O-P-S-C-V-M.I grafici mostrano che l'angolo ottimale di imaging nell'animale portatore di tumore tumor mute 49 è di 20 gradi, 24 ore dopo l'iniezione, ma cambia a 10 gradi nove giorni dopo l'iniezione. Ciò suggerisce che la variazione del segnale fluorescente, correlata a cambiamenti morfologici, riflette probabilmente la crescita del tumore. Come mostrato in questa tabella, il metodo M-A-R-O-I dimostra chiaramente che il segnale fluorescente diminuisce per proiezioni con rotazioni crescenti rispetto all'angolo ottimale di imaging.Nel caso dei tumori cerebrali, si è ottenuto una diminuzione media del 7% del segnale fluorescente se l'orientamento fisico dell'animale presentava uno scostamento di oltre più o meno 10 gradi rispetto all'angolo di imaging ottimale. È stata misurata una diminuzione media del 21% del segnale fluorescente a più o meno 20 gradi.Pertanto, piccoli scostamenti dall'angolo ottimale possono provocare significative riduzioni percentuali del segnale. L'utilizzo della tecnica M-A-R-O-I per il posizionamento dell'immagine permetterà ai ricercatori di produrre dati più coerenti e affidabili. Il metodo M-A-R-O-I è stato infine impiegato per valutare il targeting delle articolazioni artritiche da parte dei SAPs C-D-O-P-S-C-V-M a 24 ore dall'iniezione.Questo animale ha ottenuto un punteggio di tre con tre articolazioni artritiche. Qui sono mostrate immagini di fluorescenza delle dita e della caviglia del topo artritico, basate sui grafici delle corrispondenti misurazioni di fotoni. Con rotazioni di 10 gradi, gli angoli di imaging ottimali trovati per la dita e la caviglia sono rispettivamente di 140 gradi e 120 gradi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare e acquisire dati M-A-R-O-I che consentono ai ricercatori di determinare l'angolo ottimale per l'analisi mediante imaging a fluorescenza.

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