Valutare lo sviluppo delle cellule murine plasmocitoidi dendritiche in placche del Peyer Utilizzando trasferimento adottivo di ematopoietiche Progenitori

L'obiettivo generale della seguente procedura è quello di esaminare la capacità dei progenitori ematopoietici purificati di dare origine a cellule dendritiche plasmacitoidi in chiazze pire intestinali dopo il trasferimento adottivo. Ciò si ottiene eseguendo prima il trasferimento genico idrodinamico del plasmide, codificando il fattore di crescita delle cellule dendritiche. FLIT tre ligando nel patch di PI topi con compromissione di cellule dendritiche plasmacitoidi.

Nella seconda fase, le cellule progenitrici dendritiche comuni vengono isolate dal midollo osseo di tipo selvatico mediante separazione magnetica delle microsfere e smistamento del flusso. Nella fase finale, le cellule progenitrici vengono trasferite adottivamente mediante iniezione endovenosa in topi con cellule dendritiche plasmacitoidi di pire che sono stati trattati mediante trasferimento genico idrodinamico. In definitiva, la popolazione di cellule dendritiche plasmacitoidi del patch PI derivata dalla cellula progenitrice ematopoietica del donatore può essere valutata mediante citometria a flusso.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come ad esempio qual è l'origine dello sviluppo delle cellule plasmatiche di Cy Dendri che si localizzano all'interno delle chiazze pirata. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'origine delle pire e delle cellule dendritiche plasmacitoidi del patch. Può anche essere applicato alla comprensione di come le cellule dendritiche plasmacitoidi influenzano le popolazioni di linfociti all'interno di questi tessuti.

Due giorni prima del trasferimento adottivo dilatano i vasi sanguigni di cinque topi riceventi del recettore alfa dell'interferone positivo CD 45 2 sotto una lampada termica per 5-10 minuti. Quindi, per ogni topo, metti l'animale in un sistema di contenzione e disinfetta la coda con etanolo al 70%. Successivamente, utilizzare un ago calibro 27 per iniettare cinque microgrammi di plasma e rivestire tre ligandi e due millilitri di PBS sterile nella vena caudale di ciascun animale.

Per la coorte di controllo, iniettare cinque microgrammi di vettore vuoto. Dopo aver monitorato i topi per 15-30 minuti, riportateli nella loro struttura abitativa. Il giorno dell'esperimento, posizionare il femore e la tibia sezionati da 10 topi congenici CD 45 1 positivo C 57 neri sei in un piatto di coltura contenente terreni completi.

Quindi inserire un ago calibro 27 in un'estremità di ciascun osso e utilizzare un terreno completo per lavare il midollo osseo nel piatto tre volte per osso. Assicurarsi che le cellule del midollo osseo vengano rimosse confermando che il terreno espulso appaia torbido. Realizzare una sospensione a singola cellula pipettando delicatamente il terreno su e giù da tre a cinque volte nel piatto di coltura.

Quindi rimuovere i detriti facendo passare le cellule del midollo osseo attraverso un colino cellulare da 40 micrometri e disgregare eventuali grumi cellulari applicando delicatamente l'estremità di uno stantuffo a siringa sterile. Sul colino, centrifugare le cellule, rimuovere i surnatanti e pidocchiare i globuli rossi in due millilitri di tampone di lisi da quattro a sei volte da 10 alla settima cellula per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 10 millilitri di tampone fax alle cellule del midollo osseo e centrifugare per quattro minuti a 500 volte G a temperatura ambiente.

Dopo aver aspirato delicatamente il sup natina, lavare il pellet in 10 millilitri di tampone fax. Successivamente, colorare le cellule con un marcatore di lignaggio ematopoietico che riconosca gli anticorpi dopo la colorazione e il lavaggio degli anticorpi. Incubare le cellule con microsfere magnetiche di capra anti ratto.

Durante l'incubazione delle microsfere, caricare una colonna max LD su un separatore di cellule max MIDI e pre-risciacquare la colonna con due millilitri di tampone fax. Quindi posizionare un tubo conico da 15 millilitri sotto la colonna e caricare fino a cinque volte 10 all'ottava cella in 2,5 millilitri di tampone fax nella colonna. Lavare la colonna tre volte con due millilitri di tampone fax per lavaggio, raccogliendo le cellule negative di derivazione che passano attraverso la colonna nel tubo da 15 millilitri.

Conta le celle eluse. Quindi, dopo aver colorato le cellule con gli anticorpi coniugati fluorescenti appropriati, trasferire il campione in un tubo fax per selezionare i progenitori dendritici comuni sulla base del profilo del marcatore desiderato. Raccogliere le cellule purificate per fax in un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di supporto completo, quindi alla fine della tiratura del fax registrare il numero assoluto di celle ordinate.

Dopo la filatura, le cellule diluiscono una volta da 10 a un quinto dei progenitori dendritici comuni purificati per 100 microlitri di volume totale di PBS sterile per topo e aspirano le sospensioni cellulari in una siringa dotata di aghi da 27 gauge. Quindi iniettare le cellule progenitrici positive CD 45 1 nella vena caudale di ciascun topo knockout per il recettore alfa dell'interferone positivo CD 45 2 ricevente, come appena dimostrato da sette a 10 giorni dopo il trasferimento adottivo. Rimuovere l'intestino dai comuni topi progenitori delle cellule dendritiche iniettati posizionando i tessuti su tovaglioli di carta imbevuti di PBS.

Quindi usa un paio di pinze sottili e forbici per raccogliere tutte le macchie di pire visibili lungo la parete dell'intestino tenue. Si noti che le macchie di pire sono spesso strutturalmente distinte anche all'interno di un singolo topo, quindi fai attenzione a garantire che tutte le macchie di P siano identificate e sezionate. Lavare i cerotti di P isolati tre volte in una capsula di Petri contenente PBS usando una pinza per rimuovere le feci.

Quindi digerire i cerotti P'S con un milligrammo per millilitro, la collagenasi quattro su 10 millilitri di HBSS in un pallone da 50 millilitri con agitazione vigorosa a 37 gradi Celsius. Dopo un'ora, versare i cerotti PI digeriti in un colino cellulare da 40 micrometri e utilizzare uno stantuffo a siringa sterile per forzare le cellule in un tubo conico da 15 millilitri. Dopo aver fatto girare la sospensione cellulare filtrata, risospendere il pellet in sei millilitri di soluzione al 37% per chiamata e trasferirlo in una provetta da 15 millilitri.

Quindi posizionare delicatamente sei millilitri di soluzione al 70% per chiamata sotto per formare un gradiente per passo di chiamata. Ora separare le celle per 20 minuti a 800 volte G a temperatura ambiente con la rottura. Quindi raccogliere la popolazione di cellule mononucleate all'interfaccia.

Dopo aver pellettato le celle raccolte, lavarle due volte in 50 millilitri di terreno completo. Quindi colorarli con gli anticorpi appropriati per rilevare il cerotto PYS positivo CD 45 1. Cellule dendritiche plasmacitoidi che derivano dai progenitori positivi CD 41 trasferiti in modo adottivo.

Analizzare le cellule mediante citometria a flusso. Le cellule dendritiche plasmacitoidi possono essere identificate dal loro fenotipo CD 11 C positivo clec H positivo PDCA un B positivo due 20 20 positivo CD 11 B negativo. Infine, determina il numero assoluto di cellule dendritiche plasmacitoidi usando questa equazione.

Questi grafici a punti indicano la strategia di gating per l'isolamento dei progenitori dendritici comuni. Per il topo, le cellule del midollo osseo, come appena dimostrato, i progenitori dendritici comuni comprendono circa lo 0,1% del totale delle cellule del midollo osseo e da circa quattro a sei volte 10-4. Di queste cellule può essere isolato da un topo per identificare le cellule dendritiche plasmacitoidi patch di PI mediante citometria a flusso.

Viene utilizzata una strategia iniziale di gating a dispersione diretta e laterale, seguita dal gating per le celle C positive per le cellule C positive per CD 11 C e H. I topi knockout per il recettore dell'interferone alfa mostrano una riduzione significativa delle cellule dendritiche plasmacitoidi del patch pys rispetto ai topi wild type. Le cellule progenitrici dendritiche comuni si differenziano anche in cellule dendritiche convenzionali.

A differenza delle cellule dendritiche plasmacitoidi, le cellule dendritiche convenzionali CD 11 C positive clec H negative sono osservate in quantità simili sia nei topi wild type che in quelli knockout. Pertanto, i topi knockout per il recettore dell'interferone alfa offrono l'opportunità di esaminare la ricostituzione delle cellule dendritiche plasmacitoidi del patch PS senza gli effetti dell'irradiazione letale. Il trasferimento adottivo di progenitori dendritici comuni wild type in topi knockout per il recettore dell'interferone alfa, come appena dimostrato, stimola un aumento delle cellule dendritiche plasmacitoidi patch PI.

Inoltre, il pretrattamento con il trasferimento genico idrodinamico del ligando FL 3 migliora ulteriormente l'espansione delle cellule dendritiche plasmacitoidi nelle patch PI, il che implica che i progenitori dendritici comuni trasferiti e possibilmente i progenitori FL 3 positivi endogeni rispondono al ligando FL 3 inducendo cellule dendritiche plasmacitoidi patch pyrus. Entrambe le condizioni stimolano anche la produzione di cellule dendritiche convenzionali CD 11 C positive clec H negative, coerenti con l'origine evolutiva delle cellule dendritiche convenzionali. Le cellule dendritiche plasmacitoidi del cerotto PYS esprimevano i tradizionali marcatori delle cellule dendritiche plasmacitoidi, tra cui clec H, PDCA uno e B due 20 e LAC CD 11 B.In Inoltre, l'analisi dei cerotti PYS da topi knockout per il recettore alfa dell'interferone che ricevono sia il trasferimento genico idrodinamico del ligando FL tre che i progenitori dendritici comuni trasferiti mostra che circa il 70% delle cellule dendritiche plasmacitoidi derivano da progenitori dendritici comuni positivi CD 45 1 del donatore.

Collettivamente, questi dati dimostrano che il trasferimento adottivo di progenitori dendritici comuni induce la popolazione di cellule dendritiche plasmacitoidi patch PI in risposta ai segnali mediati dal ligando FL tre in vivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e identificare le cellule D plasmacitoidi pars patch.