Analizzando craniofacciale morfogenesi in Zebrafish Uso 4D Microscopia confocale

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare e caratterizzare i movimenti dell'arco faringeo nella testa del pesce zebra in via di sviluppo. Ciò si ottiene incorporando prima un embrione di pesce zebra transgenico in un gel acrost anestetico. Il secondo passo consiste nel montare l'embrione incorporato nell'agarosio in una goccia di metilcellulosa su un vetrino da microscopio.

Successivamente, l'embrione viene sigillato tra due vetrini da microscopio con grasso sottovuoto. In definitiva, la microscopia confocale time-lapse viene utilizzata per mostrare le differenze tra zebrafish wild type e mutant e i movimenti morfogenetici degli archi faringei. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi di imaging statico è che cattura lo sviluppo dell'arco faringeo in tempo reale, consentendo a un ricercatore di osservare direttamente i movimenti dei tessuti che sono critici per la morfogenesi.

Per realizzare un vetrino coprioggetti a ponte, incollare una colla A, un vetro di copertura 22 per 22 su ciascuna estremità di un vetro di copertura 24 per 60. Lasciando libero il centro. Crea singoli per embrioni di meno di un giorno.

Raddoppia per gli embrioni di età compresa tra uno e quattro giorni o triplica per gli embrioni di cinque giorni o più. E per ogni campione, utilizzare due vetrini coprioggetto a ponte. Ora riempi una siringa da 10 millilitri con grasso per alto vuoto.

Preparare l'anestetico fresco in aros liquido allo 0,2% e mantenerlo in un blocco riscaldante a 42 gradi Celsius. Per decosparare manualmente gli embrioni transgenici non schiusi, strappare lentamente il Corian fino a quando l'embrione non viene liberato. Trasferire ora gli embrioni rivestiti in un terreno pulito contenente MS 2 22 ed estetica.

Per preparare un vetrino coprioggetti a ponte, spingere lentamente il grasso sottovuoto fuori dalla siringa, creando un cordone continuo liscio che è adiacente e all'interno dei ponti e del bordo del vetrino coprioggetti. Stendere un cerchio di metilcellulosa al 4% al centro del ponte per coprire il vetrino. Quando l'embrione è anestetizzato, aspirarlo in una pipetta di vetro.

Tenere la pipetta in verticale per consentire all'embrione di affondare sul fondo del liquido nella pipetta. Quindi spostare la pipetta nella soluzione agro e lasciare che l'embrione cada nell'aros senza espellere il liquido. Aspirare un po' di soluzione agro e l'embrione nella pipetta.

Quindi espellere l'embrione in una goccia di soluzione di aro. Sopra la metilcellulosa. Spingere l'embrione verso il basso sulla metilcellulosa e orientare l'embrione come desiderato per l'imaging per sigillare il campione.

Posizionare un vetrino coprioggetti a ponte sopra quello montato rivolto verso il basso. Applicare una pressione uniforme su entrambi i lati dei vetrini coprioggetti a sandwich fino a quando i ponti non entrano in contatto diretto e gli agros fanno cadere le guarnizioni su entrambi i vetrini. Verificare che l'embrione sia orientato correttamente.

Strofina un applicatore di legno lungo il vetro per appianare crepe e fessure nella velocità del grasso sottovuoto. Rimuovere il grasso in eccesso dai bordi. Attiva il microscopio confocale e tutti i dispositivi laser esterni.

Accendere anche il computer collegato al microscopio confocale e selezionare il sistema di avvio e il software di imaging confocale. Quindi, abbassare la piattaforma di stadiazione del microscopio confocale e spostare le lenti dell'obiettivo fuori posizione. Sostituire lo stadio predefinito con uno stadio riscaldato elettronico.

Accendere il controller per il riscaldamento stage e impostare la temperatura a 29.5 gradi Celsius. Posizionare il campione montato sul tavolino riscaldato. Spostare l'obiettivo 20x in posizione e sollevare la piattaforma di sosta.

Quindi attiva l'emettitore di luce visibile e centra la testa dell'embrione nel campo visivo. Per attivare i canali di fluorescenza, selezionare la lunghezza d'onda fluorescente da rilevare e scegliere le tabelle di ricerca dei colori per ciascun canale. Per ogni canale di fluorescenza, impostare l'intensità del laser su 10,0 e la tensione del fotomoltiplicatore tra 600 e 700.

Per ridurre lo sfondo e aumentare le informazioni fluorescenti raccolte, impostare la media su due o quattro e la profondità di bit su 16 bit. Attivare i moduli stack ZS e Time Series. Regolare il foro stenopeico se necessario.

Imposta l'intervallo di tempo e la durata dell'esperimento. Portare la fotocamera in modalità live. Regolare la messa a fuoco e aumentare l'intensità del laser, se necessario.

Per vedere la fluorescenza. Impostare lo zoom digitale su 0,6 per una visione più ampia. Se lo si desidera.

Posiziona il palco in modo tale che tutte le strutture di interesse siano visibili e che ci sia spazio nel campo visivo per la crescita. Focalizzazione dorsale e anteriore attraverso l'embrione fino ai limiti superiore e inferiore della fluorescenza. Impostare la prima e l'ultima posizione della fetta Zack ad almeno 100 micrometri o più oltre questi limiti.

Quindi, imposta la tabella di ricerca del display sugli indicatori di intervallo in modo che le strutture fluorescenti appaiano di una tonalità di grigio e il resto del campo dovrebbe essere blu o nero. Se necessario, aumentare la tensione del moltiplicatore di foto a un livello appena al di sotto del punto in cui compaiono i pixel rossi saturi. Se le strutture fluorescenti appaiono rosse, ridurre l'intensità del laser e/o il guadagno fino a quando non diventano una tonalità di grigio.

Se necessario, regolare l'offset. Quindi le aree al di fuori del campione sono blu. Impostare il valore per il diametro più piccolo che consente di raccogliere le immagini in modo tempestivo.

L'intervallo Z deve essere sempre impostato sulla distanza ottimale suggerita per il diametro del foro stenopeico, eseguire brevi scansioni per testare le impostazioni, utilizzando sempre l'intensità laser più bassa possibile. Ora esegui l'esperimento per il periodo di tempo desiderato. Successivamente, rimuovere l'embrione dal palco riscaldato e separare lentamente i vetrini coprioggetto, immergere il coperchio, il vetrino e l'embrione in em in una capsula di Petri da 30 millimetri.

Utilizzando una pipetta di vetro, lavare delicatamente l'embrione dal vetrino coprioggetto e rimuovere il vetrino coprioggetto dalla capsula di Petri. Metti l'embrione in un'incubatrice a 28,5 gradi Celsius per continuare a svilupparsi. Alla fine degli esperimenti, prendi le singole immagini di Zack di embrioni fratelli montati su agros che sono stati messi in scena in modo simile al campione all'inizio degli esperimenti, ma sono stati sollevati con un EM e un'incubatrice a 28,5 gradi Celsius.

Misurare gli archi faringei secondo necessità utilizzando un software confocale o un altro software di elaborazione delle immagini in embrioni wild type. Seguendo la popolazione della cresta neuronale, gli archi faringei si allungano lungo gli AE ventrali anteriori posteriori e dorsali mentre si muovono in direzione rostrale. Alla sua estremità anteriore, il primo arco faringeo forma domini mascellari e mandibolari separati dall'ectoderma orale

Qui il settimo arco faringeo non riesce a migrare roly per sovrapporsi a più archi anteriori entro 48 ore dalla fecondazione. I mutanti Zebrafish SM cinque hanno numerosi difetti facciali cranici. In queste immagini confocali statiche.

Le fusioni nei domini ventrali del secondo e del terzo arco sono evidenti entro 32 ore dalla fecondazione. Utilizzando la microscopia confocale time-lapse, analizziamo la morfogenesi degli archi faringei. In Smad cinque fusioni mutanti tra il secondo e il terzo arco compaiono per la prima volta a 32 ore dopo la fecondazione.

Coerente con l'analisi statica. Mentre l'espressione dei membri della famiglia PDGF suggerisce che possa essere ampiamente coinvolta nella morfogenesi dell'arco faringeo, il movimento degli archi posteriori appare normale. Nei mutanti P-D-G-F-R-A, è la morfogenesi del primo arco faringeo che appare specificamente interrotto.

Questa procedura è suscettibile di altre tecniche di zebrafish comunemente usate, come l'iniezione di morfo o la generazione di mosaici genetici. Le analisi time lapse consentono l'analisi diretta delle conseguenze di queste manipolazioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'imaging in vivo time lapse di embrioni di zebrafish transgenico anestetizzando e montando correttamente i campioni e impostando i parametri ideali per la microscopia confocale.