Name: Isolamento di Double Negative Cellule T αβ dal rene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Scopri un protocollo per isolare cellule T double negative dal rene murino usando digestione con collagenasi e selezione magnetica. Questo metodo consente studi funzionali per comprendere il ruolo immunitario nel danno renale.

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Questo lavoro è supportato dal NIH PBS (R21 AI095484). Ringraziamo core facility tetramer NHI per CD1d tetramero.

1. Preparazione degli strumenti, Cultura Media e reagenti <ol><li> Strumenti: Preparare i reagenti in condizioni sterili e utilizzare sotto una cappa a flusso laminare. </li><li> Preparare 1 L di terreno di coltura RPMI, aggiungere 5% di siero fetale bovino, 2,1 g di bicarbonato, 10 ml glutammato 100x, 10 mg di HEPES, 1 mg di piruvato di sodio e 10 ml di 100x penicillina / streptomicina. Nota: il terreno di coltura tissutale raccomandata, RPMI, è intercambiabile con DMEM. </li><li> Preparare soluzione al 5% di collagenasi &quot;D&quot; (5 ml di collagenasi &quot;D&quot; a 9 ml di terreno di coltura tissutale). </li><li> Preparare la soluzione di Percoll a tre diverse concentrazioni: 100%, 80% e 40%. I seguenti concentrazioni sono calcolati per 1 campione. Mantenere le soluzioni a temperatura ambiente. <ol><li> Soluzione Percoll: aggiungere 9 ml di diluito Percoll (da soluzione stock); aggiungere 1 ml di PBS 10x. </li><li> Soluzione Percoll: aggiungere 8 ml di Percoll 100%; aggiungere 2 ml di PBS 1x. </li><li> Soluzione Percoll:aggiungere 4 ml di Percoll 80%; aggiungere 4 ml di PBS 1x. </li></ol></li><li> Fare 1 L di cella fluorescenza-attivato (FACS) tampone; aggiungere 5 ml di 10% di BSA (0,1% BSA), sodio azide 1 ml 10% (0,1%), 2 agente ml EDTA, portare a 1000 ml con PBS 1x. </li></ol> 2. Preparazione del rene Digestione <ol><li> Avendo acquisito alcuna approvazione istituzionale necessario, sacrificare e exsanguinate i topi con metodi standard e seguendo le normative vigenti e le linee guida per la cura degli animali. <ol><li> Anestetizzare il mouse con pentobarbital (0,07 mg / kg). </li><li> Procedere al dissanguamento. </li><li> Posizionare il mouse in posizione supina su un tavolo operatorio. </li><li> Spruzzare la zona addominale con etanolo al 70%. </li></ol></li><li> Aggiungere 10 ml di soluzione D collagenasi al piatto di Petri. </li><li> Rimuovere e decapsulate entrambi i reni da ogni mouse. <ol><li> Aprire la cavità abdomimal facendo un&#39;incisione mediana attraverso la pelle addominale e del peritoneo dallo sternoil pube. </li><li> Esporre il rene sinistro spostando l&#39;intestino lateralmente al lato. </li><li> Separare con cautela la capsula sinistra con le pinze. Nota: La capsula appare come uno strato trasparente che circonda il rene e parzialmente coperta da tessuto adiposo perirenale. </li><li> Rimuovere il rene sinistro tagliando le navi peduncolo con una forbice chirurgica. </li><li> Ripetere la stessa procedura per il rene destro. Nota: Il rene destro è più craniale e più vicino alla linea mediana (pedicelli sono più corti). </li></ol></li><li> Posizionare il rene nel piatto di Petri. </li><li> Tagliare il tessuto renale in piccoli pezzi (1-2 mm di dimensione) utilizzando una normale lama formatura dei metalli e disporre i pezzi nella soluzione di collagenasi per 30-45 min in incubatore a 37 ° C (Figura 1). </li></ol> 3. Preparazione di cellule mononucleate del rene (KMNC) dalla digestione rene <ol><li> Ottenere una sospensione di cellule di renedigestione interrompendo meccanicamente il tessuto utilizzando un filtro (70 micron) e risospendere in 25 ml di terreno di coltura tissutale e mescolare. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 10 min a 4 ° C per sedimentare la sospensione cellulare. </li><li> Risospendere il pellet in 4 ml di 40% soluzione di Percoll e delicatamente sovrapporre su 4 ml di 80% soluzione di Percoll con una pipetta di plastica trasferimento, molto lentamente e con attenzione. Questo comporta due fasi nettamente separate da uno strato traslucido. Sulla parte superiore sarà uno strato giallo corrispondente ai lipidi. </li><li> Centrifugare a 1500 xg per 30 min a temperatura ambiente con la centrifuga in modalità off freno. </li><li> Rimuovere con aspirazione lo strato superiore di colore giallo e denso (circa 1-2 ml). </li><li> Raccogliere solo il leggero strato biancastro traslucido dall&#39;interfaccia delle due fasi con una pipetta di trasferimento. Trasferire molta attenzione questa sospensione in una provetta conica da 15 ml contenente 2 ml di terreno di coltura tissutale e quindi aggiungere 13 ml di terreno per fare un volume totale di15 ml. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Risospendere i campioni in 1 ml del mezzo. </li><li> Contare il numero di KMNC utilizzando trypan blu su un emocitometro ed esprimere i risultati come numero di KMNC per ml al rene. </li><li> Risciacquare una volta come sopra. </li></ol> 4. Isolamento del emopoietiche (CD45 +) Celle dal KMNC (Fase I) <ol><li> Risospendere le cellule fino a 10 7 in 90 ml di tampone di corsa. </li><li> Aggiungere 10 ml di microsfere CD45 e incubare per 15 min a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone di corsa per arrestare la reazione. Centrifugare a 400 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere in 500 ml di tampone di corsa. </li><li> Preparare la colonna magnetico mettendo a magnete e risciacquare con 3 ml di tampone di corsa. </li><li> Passare la sospensione cellulare attraverso la colonna magnetica e raccogliere le cellule non marcati che passano attraverso la colonna. </li><li> Lavare le cellule tre volte con 3 ml di Running buffer. Poi raccogliere l&#39;effluente. </li><li> Rimuovere la colonna dal separatore e pipetta 5 ml di tampone di corsa sulle colonne e scovare la frazione etichettato immediatamente. Questa frazione contiene le cellule CD45 +. Contare le cellule. </li><li> Per calcolare il numero assoluto di linfociti T diversi sottoinsiemi in reni moltiplicare il numero totale di KMNC per la percentuale di cellule positive determinata mediante citometria di flusso (Figura 2). </li></ol> 5. Isolamento di DN cellule T CD45 + da Preparazione per selezione negativa (Fase II) <ol><li> Aggiungere 2,5 ml (0,5 mg / ml, 1,25 microgrammi) di ciascuno dei seguenti anticorpi biotinilati: anti-CD4 e anti-CD8, anti-recettore Fc (CD16/32), anti-MHC di classe II (IA b), anti- CD1d PBS-57 tetramer ogni 10 cellule ematopoietiche 7. </li><li> Incubare le cellule per 30 minuti nella camera fredda. </li><li> Aggiungere 1 ml microsfere anti-biotina. </li><li> Incubare per 30 min in una camera fredda. </li><li> Porre il tubo in tegli magnete e procedere a esaurimento. </li><li> Contare le cellule vitali per determinare il numero totale di cellule T DN nella frazione negativa utilizzando un emocitometro. </li><li> Controllare la purezza delle cellule DN T con citometria a flusso seguendo questa strategia di gating: primo cancello CD45 +, secondo cancello TCRαβ +. Escludi + cellule CD1d. Plot CD4 + CD8 + vs identificare cellule DN T (Figura 3). </li><li> Moltiplicare il numero totale per la percentuale determinata in purezza. Nota: utilizzando questo protocollo i risultati in una popolazione di cellule pure oltre il 90% DN T. </li></ol>

<ol><li>Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+previously+unknown+antigen-specific+regulatory+T+cell+and+its+mechanism+of+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression.</a> Nat Med. 6, 782-789 (2000).</li>
<li>Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+regulatory+function+of+lymphoproliferative+double+negative+T+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo.</a> J Exp Med. 196, 261-267 (2002).</li>
<li>Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+in+vivo+trogocytosis+as+a+mechanism+of+double+negative+regulatory+T+cell-mediated+antigen-specific+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression.</a> J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).</li>
<li>Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-lymphocyte+infusion+induces+transplantation+tolerance+by+activating+systemic+and+graft-infiltrating+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells.</a> Blood. 100, 3408-3414 (2002).</li>
<li>Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+in+vitro-generated+DN+T+regulatory+cells+induces+permanent+cardiac+allograft+survival+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice.</a> Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).</li>
<li>Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+graft-versus-host+disease+by+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells.</a> J Immunol. 171, 134-141 (2003).</li>
<li>Mohamood, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gld+mutation+of+Fas+ligand+increases+the+frequency+and+up-regulates+cell+survival+genes+in+CD25%2BCD4%2B+TR+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells.</a> Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).</li>
<li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3%2BCD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).</li>
<li>Hamad, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B220%2B+double-negative+T+cells+suppress+polyclonal+T+cell+activation+by+a+Fas-independent+mechanism+that+involves+inhibition+of+IL-2+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production.</a> J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).</li>
<li>Rabb, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+role+of+T+lymphocytes+in+renal+ischemia-reperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Renal%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).</li>
<li>Burne, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+CD4%28%2B%29+T+cell+as+a+major+pathogenic+factor+in+ischemic+acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure.</a> J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).</li>
<li>Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+T+cell+depletion+in+murine+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury.</a> Transplantation. 74, 759-763 (2002).</li>
<li>Crispin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+double+negative+T+cells+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+produce+IL-17+and+infiltrate+the+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys.</a> J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).</li>
<li>Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+analyses+on+T-cell+subsets+in+lymph+nodes+of+MRL%2FMp-lpr%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).</li>
<li>Dowdell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+FAS+mutations+are+common+in+patients+with+genetically+undefined+autoimmune+lymphoproliferative+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome.</a> Blood. 115, 5164-5169 (2010).</li>
<li>Juvet, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcRgamma+promotes+T+cell+apoptosis+in+Fas-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice.</a> J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).</li>
<li>Thomson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcR+gamma+presence+in+TCR+complex+of+double-negative+T+cells+is+critical+for+their+regulatory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function.</a> J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Vi è un crescente interesse in cellule T DN poiché sono stati implicati in diverse condizioni patologiche, come disturbi autoimmuni, il cancro, la tolleranza del trapianto e malattie primarie di rene compresa insufficienza renale acuta (AKI), glomerulonefrite 8, 13. Pertanto, non vi è necessità di comprendere meglio e caratterizzare le funzioni fisiopatologiche delle cellule T DN. Tuttavia, attualmente non vi è una mancanza di comprensione della funzione di queste cellule rispetto ai CD4 e le cellule T CD8. U...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51192/isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney">Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney</a>.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle

A correction was made to: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney.

Erratum: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Periferico αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - doppio negativo cellule (DN) T sono suddivisi in vari sottogruppi che possiedono fenotipi e funzioni 1-4 distinte. Cellule DN T sono poco conosciuti, ma sempre più spesso coinvolti nelle risposte immunitarie fisiopatologiche in differenti modelli di malattia 4-6. Cellule DN T sono un tipo di cellula immunitaria unico che è sempre più coinvolto nella regolazione delle varie risposte immunitarie e autoimmuni e la modulazione della tolleranza allotrapianto. 4-6, 9 sono rari nel sangue periferico e negli organi linfoidi secondari (milza e dei linfonodi ). Tuttavia, essi sono i principali abitanti della normale rene e intestino epitelio 10-12. Molto poco si sa circa la loro funzione 7 del rene in stato stazionario e in condizioni patologiche come danno renale acuto (AKI) associata a Transpl reneant. A causa dei ruoli intricati di diverse cellule immunitarie nel regolare le risposte immunitarie, tra cui alloresponses, la definizione del ruolo di ogni giocatore è fondamentale per comprendere alloresponses e la progettazione di nuove terapie. Dato numero significativo di cellule DN T presenti nel rene in condizioni fisiologiche e diverse malattie, le cellule T DN sono suscettibili di svolgere un ruolo critico nel regolare le risposte immunitarie e autoimmuni nei topi e nell&#39;uomo, e alloresponses nei pazienti trapiantati. Accumulare se prova ancora sparse implica cellule DN T in entrambe le funzioni patogeni e immunosoppressori, ma è poco conosciuta perché e come mostrano una funzione dannoso o soppressiva specifico e come l&#39;ambiente li influenza. A causa della loro bassa abbondanza nel rene, sono necessari metodi migliorati di isolamento. Attualmente non esiste un protocollo standard per l&#39;isolamento di cellule T DN da tegli tessuti non linfoidi. Il nostro protocollo descrive un nuovo metodo per l&#39;isolamento di cellule T DN dal rene; Tuttavia, il metodo può essere utilizzata anche per vari tessuti non linfoidi.

<table><tbody><tr><td>Cappa a flusso laminare&nbsp;</td><td>Baker Company, Inc</td><td></td><td>O attrezzature equivalenti&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>o attrezzatura equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze 63514-11</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore ad atmosfera controllata</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&nbsp;( 37 gradi C con 5% CO2</td></tr><tr><td>)Citometro a flusso analitico</td><td>LSR II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Media Tech</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Corning Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,1% sodio azide (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato tampone (PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Mediatech</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>EDTA tampone&nbsp;</td><td>Colonne Sigma-Aldrich</td><td>E1161</td><td></td></tr><tr><td>LS&nbsp;</td><td>Microsfere MiltenyiBiotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD45+ Microsfere</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>6.78E-51</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere di biotina&nbsp;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (clone: 30-F11)&nbsp; PerCP&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (clone: 30-F11)&nbsp; APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>anti-TCR Blu del Pacifico&nbsp; (catena ab, clone: H57-597)</td><td>Invitrogen</td><td>HM3628</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0043</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 FITC</td><td>eBioscience</td><td>8011-0087</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 biotinilato (GK1.5)</td><td>BD</td><td>553728</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 biotinilato&nbsp; (clone 53-6.7)</td><td>BD</td><td>553029</td><td></td></tr><tr><td>anti-MHC classe II (I-A b) biotinilato</td><td>BD</td><td>553609</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer&nbsp;</td><td>MIlteny I Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6J topi</td><td>Jackson Labs</td><td>000664</td><td>Reni - Piastra di Petri per linfonodi</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>356517</td><td></td></tr><tr><td>70 &#956; m filtro&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Stantuffo&nbsp;</td><td></td><td></td><td>O apparecchiature equivalenti&nbsp;</td></tr><tr><td>Provette GeneMate 50 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-3</td><td>O attrezzatura equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>GeneMate Provette 15 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-1</td><td>O attrezzatura equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>CD1d &#945;-galcer tetramero</td><td>NHI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di double negative cellule t αβ dal rene

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Attualmente non esiste un protocollo standard per l&#39;isolamento delle cellule T DN dai tessuti non linfoidi nonostante il loro coinvolgimento sempre segnalato in varie risposte immunitarie. Cellule DN T sono un tipo di cellula immunitaria unico che è stato implicato nella regolazione delle risposte immunitarie e la tolleranza e autoimmuni di allotrapianto 1-6. Cellule DN T sono, tuttavia, rare nel sangue periferico e negli organi linfoidi secondari (milza e linfonodi), ma sono i principali abitanti del rene normale. Molto poco si sa circa la loro funzione fisiopatologico 7 a causa della loro scarsità in periferia. Abbiamo recentemente descritto una vasta analisi fenotipica e funzionale di questa popolazione nel rene 8 in stato stazionario e durante ischemia riperfusione. Analisi della funzione delle cellule T DN sarà notevolmente migliorata con lo sviluppo di un protocollo per il loro isolamento dal rene. Qui, descriviamo un nuovo protocollo che consente isolation di CD8 + cellule altamente puri ab CD4 + T e le cellule T DN dal rene murino. In breve, abbiamo digerire tessuto renale con collagenasi e isolare le cellule mononucleate del rene (KMNC) dal gradiente di densità. Questo è seguito da due passaggi per arricchire cellule T ematopoietiche dal 3% al 70% dal KMNC. La prima fase consiste in una selezione positiva di cellule ematopoietiche CD45 + utilizzando un kit di isolamento. Nella seconda fase, le cellule T sono DN negativamente isolati mediante rimozione delle cellule non desiderati utilizzando CD4, CD8, e MHC di classe II anticorpi monoclonali e CD1d α-GalCer tetramero. Questa strategia porta ad una popolazione di cellule pure oltre il 90% DN T. Colorazione della superficie con gli anticorpi suddetti seguita mediante analisi FACS è utilizzato per confermare la purezza.

Wild type C57BL / 6 (B6) rene contiene circa 1,5-2,1 x 10 6 cellule mononucleate al rene. Circa meno del 10% sono CD45 + cellule ematopoietiche. Per la preparazione di cellule mononucleate rene (KMNC), i reni sono tagliati in piccoli pezzi, come mostrato in Figura 1 seguito da digestione con collagenasi 5%. Questo è seguito eseguendo una centrifugazione in gradiente di densità per raccogliere KMNC strato (figura 2, pannello di sinistra).</strong...

Cellule DNabT sono rari tra cellule T periferiche; tuttavia, sono abbondanti in alcuni tessuti non linfoidi. Difficoltà di isolare le cellule T DN dal tessuto linfoide non ostacola la loro analisi funzionale, nonostante l&#39;aumento riconosciuto significato fisiopatologico. Descriviamo un nuovo protocollo per l&#39;isolamento di cellule altamente purificate DN T di rene murino.

Isolamento di Double Negative Cellule T αβ dal rene

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere come isolare cellule T pure e doppio negative dal rene del topo. Questo viene ottenuto innanzitutto digerendo il rene in una soluzione di collaghenasi. Successivamente, le cellule mononucleate vengono separate mediante gradiente di densità e le cellule ematopoietiche positive per CD45 vengono raccolte mediante selezione positiva.Alla fine, le cellule T doppio negative possono quindi essere isolate mediante selezione negativa. Nel 1998, il nostro gruppo scoprì che le cellule immunitarie, in particolare le cellule T, contrariamente al dogma vigente, erano responsabili del danno renale acuto. Erano presenti pochissime di queste cellule nel rene e nel cuore da studiare, quindi sviluppammo una tecnica per analizzarle meglio.Siamo rimasti sorpresi nel trovare una popolazione di cellule, le cellule T a doppio negativo prive di CD4 o CD8, presenti in alta percentuale sia nel rene normale che durante il danno tissutale. La tecnica dettagliata e migliorata per studiarle meglio e analizzarne i meccanismi sarà descritta nel video in arrivo. Stiamo studiando le cellule T a doppio negativo dal 2001 e, recentemente, abbiamo collaborato con il laboratorio del dottor Rob per modificare il metodo regionale di isolamento di queste cellule, al fine di ottenere una popolazione pura utilizzabile per diversi tipi di risposte immunitarie biologiche.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle cellule immunitarie nel rene, può essere applicato anche ad altri sistemi, come tessuti non linfatici. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, aggiungere prima 10 millilitri di collagenasi D in una piastra di Petri per il prelievo del tessuto. Quindi spruzzare l'area addominale di un topo eutanasizzato con etanolo al 70%.Successivamente, effettuare un'incisione mediana attraverso la cute addominale e il peritoneo, dallo sterno al pube, quindi spostare lateralmente l'intestino per esporre il rene sinistro. Identificare la capsula sinistra, che appare come uno strato trasparente che avvolge il rene ed è parzialmente ricoperta dal tessuto adiposo perirenale, e separarla con cura dal rene utilizzando pinze. Quindi tagliare il vaso peduncolare con forbici chirurgiche per rimuovere il tessuto, e posizionare il rene nella piastra di Petri.E poi, dopo aver rimosso il rene destro, utilizzare una comune lama metallica per tagliare il tessuto renale in piccoli pezzi di uno-due millimetri. Digestire i pezzi nella soluzione di collaghenasi per 30-45 minuti a 37 gradi Celsius, quindi per isolare le cellule mononucleate renali, rompere meccanicamente la sospensione renale attraverso un setaccio da 70 micron. Ri-sospendere la sospensione cellulare in 25 millilitri di mezzo di coltura tissutale.E poi, dopo una delicata agitazione, centrifugare le cellule e risospendere il pellet in quattro millilitri di soluzione al 40% di percoll. Successivamente, utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per sovrapporre delicatamente la soluzione cellulare di percoll su quattro millilitri di una soluzione all'80% di percoll, creando così due fasi chiaramente separate da uno strato traslucido. Separare le cellule per 30 minuti a 1500 G e temperatura ambiente senza frenata, quindi asportare circa uno o due millilitri dello strato superiore spesso e giallo contenente lipidi.Utilizzare una nuova pipetta di trasferimento per raccogliere lo strato leggermente biancastro e traslucido dall'interfaccia tra le due fasi in un tubo conico da 15 millilitri contenente due millilitri di mezzo di coltura tissutale. Quindi aggiungere 13 millilitri di mezzo per portare il volume totale a 15 millilitri. Dopo il lavaggio e il conteggio, diluire le cellule a uno per 10 alla sette in 90 microlitri di buffer di corsa.Quindi incubare le cellule in 10 microlitri di microsferette CD45 a quattro gradi Celsius. Dopo 15 minuti, aggiungere un millilitro di buffer di lavaggio per arrestare la reazione. Quindi centrifugare le cellule e riutilizzarle.Sospendere il pellet in 500 microlitri di tampone di lavaggio fresco. Successivamente, posizionare una colonna in un magnete per la separazione delle perle ed eseguire il risciacquo della colonna con tre millilitri di tampone di lavaggio. Quindi far passare la sospensione cellulare attraverso la colonna magnetica, raccogliendo le cellule non marcate che eluiscono dalla colonna.Lavare il tubo contenente le cellule tre volte con tre millilitri di buffer di lavaggio, raccogliendo ogni volta l'effluente, quindi rimuovere la colonna dal magnete. Pipettare cinque millilitri di buffer di lavaggio sulla colonna ed eluire immediatamente la frazione marcata contenente le cellule positive per CD45. Dopo il conteggio delle cellule, incubarle in 2,5 microlitri di ciascuno di questi anticorpi biotinilati per ogni 1 × 10⁷ cellule ematopoietiche a quattro gradi Celsius.Dopo 30 minuti, incubare le cellule per un ulteriore mezz'ora a quattro gradi Celsius in un millilitro di microsfere anti-biotina. Posizionare una nuova colonna nel magnete e quindi caricare le cellule sulla colonna come appena dimostrato, raccogliendo questa volta la frazione negativa. Infine, contare le cellule vitali per determinare il numero totale di cellule T doppio negative nella frazione negativa e moltiplicare questo valore per la percentuale di purezza determinata mediante analisi citofluorimetrica.Mentre i reni di tipo C 57, neri, contengono approssimativamente da 1,5 a 2,1 × 10⁶ cellule mononucleate per rene, meno del 10% sono cellule ematopoietiche positive per CD45. Dopo la centrifugazione su gradiente di densità per raccogliere lo strato di cellule mononucleate renali, le cellule positive per CD45 possono essere ulteriormente purificate fino all'80-95% mediante separazione con microsferette magnetiche positive per CD45. Tra le cellule ematopoietiche positive per CD45 arricchite, circa dal 30 al 60% sono cellule T doppio negative.La selezione negativa delle cellule CD45 positive per rimuovere le cellule positive per CD4, positive per CD8, positive per il complesso maggiore di istocompatibilità di classe II e positive per il tetramero consente di ottenere cellule T doppio negative altamente purificate, con una purezza del 90-95%. Utilizzando questo protocollo, è possibile ottenere fino a 0,5 × 10⁶ cellule ematopoietiche CD45 positive marcate magneticamente per topo. Questa procedura fornirà una migliore comprensione delle funzioni biologiche e dei meccanismi d'azione delle popolazioni di cellule T doppio negative in diverse patologie.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Isolamento dei linfociti utilizzando il kit di Miltenyi MAC è un modo affidabile per purificare le cellule da tutta omogenati di tessuto linfoide. Cellule purificate utilizzando il sistema Miltenyi sono tipicamente ≥ 96% puro. Qui, le misure prese per isolare cellule T CD4 +, uno dei tanti kit offerto da Miltenyi.

Isolamento di cellule T CD4 + da Linfonodi mouse utilizzando Miltenyi Purificazione MACS

Il video spiega un modo per purificare le cellule B mediante targeting immunomagnetico e separazione dalla sospensione di cellule mononucleate del sangue periferico. Il metodo prevede la marcatura di tipi di cellule indesiderate con anticorpi o ligandi specifici (legati a particelle magnetiche) che hanno come bersaglio specifiche proteine della superficie cellulare, da esaurire dalla sospensione cellulare eterogenea mediante separazione magnetica.

Selezione immunomagnetica negativa: un metodo per purificare le cellule B dalle cellule mononucleate del sangue periferico

Questo video dimostra un protocollo per l'isolamento basato sulla marcatura magnetica di una popolazione a bassa concentrazione di cellule T CD4+Vδ1+γδ da cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC). Utilizzando una combinazione di anticorpi anti-Vδ1 coniugati con FITC, microsfere magnetiche anti-FITC e perline superparamagnetiche rivestite con anticorpi anti-CD4, le cellule T CD4+Vδ1+ possono essere purificate con successo dalla popolazione PBMC.

Isolamento selettivo di cellule T CD4+ Vδ1+ γδ da cellule mononucleate del sangue periferico umano

Qui, forniamo un protocollo ottimizzato per l'isolamento e la clonazione della scarsa entità di cellule T periferiche Vδ1+CD4+ che è, come abbiamo mostrato di recente, un progenitore extratimico di cellule T αβ. Questa tecnica consente di isolare quantitativamente, clonare ed espandere in modo efficiente queste cellule in coltura ex vivo.

Isolamento e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura di Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Celle γδ T, un Extrathymic αβT-cellule progenitrici

Per le applicazioni a valle sono necessarie tecniche affidabili ed efficienti per l'isolamento delle cellule immunitarie renali. Ciò richiede la marcatura degli anticorpi di superficie di un piccolo numero di cellule immunitarie renali. Qui, descriviamo un metodo conciso per l'isolamento delle cellule immunitarie renali che sembra raggiungere questo obiettivo.

Affidabile e di alta efficienza di estrazione del rene cellule immunitarie

Qui, presentiamo un protocollo per indurre la tolleranza nel trapianto e valutare in vitro e in vivo la capacità soppressiva delle sottopopolazioni cellulari distinti dal destinatario e lo stato immunitario del destinatario verso il donatore o antigeni esogeni.

In Vitro e In Vivo valutazione della attività soppressiva T, B e cellule mieloidi e risposte umorali dai destinatari del trapianto

Qui presentiamo un metodo di isolamento e coltura di romanzo grado clinico per rene perivascolare di cellule stromali (kPSCs) basato sulla perfusione d'organo intero con gli enzimi digestivi e arricchimento NG2-cella. Con questo metodo, è possibile acquisire il numero di celle sufficiente per una terapia cellulare.

Un metodo di isolamento di romanzo Clinical Grade per rene umano perivascolari cellule stromali

Presentiamo un semplice protocollo per l'isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico da sangue intero ottenuto da pazienti con diagnosi di Sindrome di Sézary, seguito dalla selezione di cellule T CD4+, dalla loro stimolazione con phorbol12-myristate13-acetato e A23187 ionoforo, e dalla preparazione dell'RNA per la profilazione trascrittomica.

Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico umano e delle cellule T CD4+ da pazienti con sindrome di Sézary per la profilazione trascrittomica

A seguito di infezione virale, il rene ospita un numero relativamente elevato di cellule CD8+ T e offre l'opportunità di studiare le cellule T RM nonmucose. Qui descriviamo un protocollo per isolare i linfociti renali del topo per l'analisi della citometria del flusso.

Isolamento delle cellule CD8 + T residenti neireni del topo per l'analisi della citometria a flusso

Qui, presentiamo un protocollo per isolare nuclei di alta qualità da reni di topo congelati che migliorano la rappresentazione dei tipi di cellule renali midollari ed evitano gli artefatti di espressione genica dalla dissociazione enzimatica del tessuto.

Isolamento dei nuclei dal rene di topo adulto per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo

Questo protocollo descrive una procedura di sopravvivenza per una linfadenectomia renale bilaterale murina sicura e ben tollerata.

Linfodenectomia renale bilaterale murina

Scopri un protocollo per isolare cellule T double negative dal rene murino usando digestione con collagenasi e selezione magnetica. Questo metodo consente studi funzionali per comprendere il ruolo immunitario nel danno renale.

Isolamento di Double Negative Cellule T αβ dal rene

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