Stretching celle micropatterned su una membrana PDMS

L'obiettivo generale di questa procedura è allungare le cellule su un microdisegno realizzato su una membrana elastica di poli dimetil silossano o PDMS. Questo viene ottenuto attraverso l'azione di un foglio di PDMS, seguita dall'applicazione di un microdisegno sul PDMS. Il foglio di PDMS con microdisegno viene quindi montato sul dispositivo di stiramento e una camera per il mantenimento del mezzo viene posizionata sopra.

Successivamente, le cellule vengono seminate sulla superficie del foglio in PDMS con microstrutturazione e lasciate aderire al pattern prima di un lavaggio per rimuovere le cellule non attaccate. L'ultimo passaggio consiste nell'applicare un allungamento al PDMS contenente le cellule, per stirarle. Infine, la microscopia video viene utilizzata per dimostrare che l'applicazione di forze sulle fibre di retrazione delle cellule mitotiche di mammifero durante lo stiramento cellulare provoca una deformazione della cellula.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biomeccanica, come ad esempio quali sono gli effetti delle forze esterne sui processi cellulari come la divisione? Abbiamo avuto l'idea iniziale di questo metodo quando abbiamo voluto applicare delle forze su una cellula in divisione per iniziare a tagliare un pezzo di PDMS di circa 35 per 20 millimetri da un foglio preesistente. In questo caso, viene utilizzato un foglio sottile di PDMS disponibile in commercio perché è più riproducibile e ha minori probabilità di rompersi rispetto al PDMS prodotto in laboratorio.

Rimuovere gli strati protettivi di plastica superiore e inferiore e utilizzare pinzette per posizionare il PDMS in una piastra di Petri di plastica. Quindi lavare il PDMS con etanolo al 70% per cinque minuti su un agitatore rotante a 30 oscillazioni al minuto. Dopo il lavaggio, asciugare la superficie facendo passare dell'aria sopra di essa.

Successivamente, illuminare il PDMS con luce ultravioletta profonda per cinque minuti a una distanza di circa cinque centimetri dalle lampade a ultravioletti. Nel frattempo, preparare una soluzione E-D-C-N-H-S come descritto nel protocollo testuale. La soluzione deve essere preparata immediatamente prima dell'uso poiché la reattività della soluzione decade nell'arco di poche ore.

Trasferire i fogli di PDMS dalla piastra di Petri al coperchio della piastra di Petri, che non è stato illuminato. Questo garantirà che l'ambiente circostante il PDMS sia altamente idrofobico e faciliterà il passaggio successivo.

Pipettare la soluzione E-D-C-N-H-S sopra il PDMS e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, rimuovere l'eccesso di E-D-C-N-H-S con acqua.

Successivamente, aggiungere la soluzione di PEG grefato con PLL e incubare da tre ore a tutta la notte a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, risciacquare via con acqua l'eccesso di PEG grefato con PLL dal PDMS. Il PDMS è ora passivato o funzionalizzato con PEG grefato con PLL e può essere conservato per diversi giorni a quattro gradi Celsius. Per creare il pattern sul PDMS, posizionare il foglio di PDMS su una maschera fotolitografica in quarzo sintetico recante le microstrutture per il patterning.

Posizionare il lato in PDMS con il PEG grafted con PLL affacciato sul lato cromato della fotomaschera. Quindi illuminare per sette minuti attraverso la fotomaschera a una distanza di circa cinque centimetri dalle lampade a raggi ultravioletti. Dopo l'illuminazione.

Aggiungere acqua sulla maschera e sul PDMS, quindi staccare lentamente il PDMS dalla maschera. Montare il PDMS precedentemente passivato sul dispositivo di stiramento. Fissare un lato del PDMS alla parte fissa dello stiratore. Bloccare l'altro lato alla parte mobile dello stiratore senza stringere eccessivamente il foglio di PDMS.

Se il PDMS viene serrato eccessivamente, diventa più corto e ciò può portare alla rottura, poiché la tensione sarà maggiore per la stessa distanza di allungamento. Assicurarsi che le viti siano ben strette, altrimenti il foglio di PDMS scivolerà non appena inizia l'allungamento o successivamente durante l'esperimento. Successivamente, incubare il PDMS con la soluzione di fibronectina per un'ora.

A temperatura ambiente, è possibile utilizzare altre proteine della matrice extracellulare, ma queste non sono state testate con questo protocollo. Come passaggio finale, sciacquare il PDMS con soluzione salina tamponata al fosfato. Successivamente, tagliare un rettangolo di PDMS da un blocco spesso di PDMS.

Quindi ritagliare un altro rettangolo all'interno. Per ottenere una vaschetta in grado di trattenere le cellule e il mezzo, aggiungere grasso siliconico sotto questo ritaglio rettangolare in PDMS e posizionarlo sulla superficie del foglio di PDMS per creare una vaschetta contenitiva per il mezzo. Il grasso permetterà lo scorrimento della vaschetta sul foglio di PDMS durante lo stiramento, consentendo il patterning delle cellule.

Per prima cosa, staccare le cellule da una fiasca di coltura al 50% di confluenza. Una volta che le cellule sono in sospensione, pipettarle più volte con una punta da 200 microlitri per rompere gli aggregati, in modo da garantire che le singole cellule si leghino al pattern. Successivamente, aggiungere un millilitro della sospensione cellulare nella vasca.

Lasciare che le cellule si attacchino ai modelli per 10-30 minuti, a seconda del tipo cellulare, in un incubatore a 37 gradi Celsius. Una volta che le cellule si sono fissate ai modelli, rimuovere delicatamente le cellule non aderenti con del mezzo equilibrato.

Rimuovere il mezzo con una pipetta aspirante aggiungendo contemporaneamente del mezzo fresco. È fondamentale mantenere un flusso sufficiente per lavare via le cellule non aderenti, garantendo al contempo che le cellule rimangano immerse nel mezzo. Successivamente, posizionare un vetrino coprioggetto sulla superficie del pozzetto per evitare l'evaporazione e la fuoriuscita del mezzo nel caso in cui il PDMS si rompa, e lasciare che le cellule si espandano per alcune ore sui modelli.

Quindi posizionare il dispositivo su un microscopio invertito e iniziare l'acquisizione delle immagini. Evitare l'uso di obiettivi a immersione in olio poiché non funzioneranno a causa di problemi di messa a fuoco. Per stirare le cellule del micro-pattern, ruotare la vite micrometrica correggendo contemporaneamente la posizione della piastra lungo gli assi x, y e Z.

La posizione dello stadio deve essere corretta per contrastare l'allargamento del PDMS e la perdita di messa a fuoco. La tecnica presentata in questo protocollo video ha permesso l'applicazione di forze sulle fibre di retrazione di cellule mitotiche di mammifero allungando il substrato all'inizio della metafase. Alcune di queste fibre di retrazione sono state tirate lontano dal corpo cellulare, generando una forza meccanica applicata sulla corteccia delle cellule mitotiche prima dell'allungamento; per ottenere questo risultato, la cellula viene seminata su un modello ovale.

La definizione dei modelli avviene stendendo il PDMS durante l'impressione di modelli rotondi attraverso la maschera fotolitografica. Dopo lo stiramento, il substrato viene allungato in modo che il modello diventi un cerchio. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sia possibile seminare cellule su modelli macroscopici ed esercitare successivamente forze di stiramento sul substrato.