Name: Studio di fagolisosoma Biogenesis nei macrofagi in diretta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Scopri la biogenesi del fagolisosoma nei macrofagi mediante imaging cellulare in tempo reale con destrano fluorescente. Questo metodo quantitativo ad alta risoluzione temporale migliora lo studio della maturazione dei fagosomi rispetto alle analisi su cellule fissate.

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Ringraziamo i membri del Laboratorio di Biologia phagosome per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è supportato da una sovvenzione Helmholtz Young Investigator (Iniziativa e Networking fondi dell&#39;Associazione Helmholtz) e un programma di priorità SPP1580 Concessione del Consiglio per la ricerca tedesca (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).

<ol><li>Greenberg, S., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and innate immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).</li>
<li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).</li>
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<li>Stuart, L., Ezekowitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+elegant+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li>
<li>Blander, J. M., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+regulation+of+phagosome+maturation+and+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">On regulation of phagosome maturation and antigen presentation.</a> Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+aging+gracefully%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: aging gracefully.</a> Biochem. J. 366, 689-704 (2002).</li>
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<li>Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+mechanisms+of+phagocytes+and+bacterial+evasion+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).</li>
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<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Luzio, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-endosome+fusion+and+lysosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis.</a> J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).</li>
<li>Eissenberg, L., Goldman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+lysosomes+with+phagosomes+containing+Histoplasma+capsulatum%3A+use+of+fluoresceinated+dextran%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).</li>
<li>de Souza Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization%2C+phagolysosomal+biogenesis+and+killing+of+mycobacteria+in+enucleated+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).</li>
<li>Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+and+sequential+delivery+of+fluorescent+lysosomal+probes+into+phagosomes+in+mouse+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages.</a> J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).</li>
<li>Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+Fuse+with+Late+Endosomes+and%2For+Lysosomes+by+Extension+of+Membrane+Protrusions+along+Microtubules%3A+Role+of+Rab7+and+RILP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP.</a> Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).</li>
<li>Huynh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAMP+proteins+are+required+for+fusion+of+lysosomes+with+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes.</a> EMBO J. 26, 313-324 (2007).</li>
<li>Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+mechanism+of+cargo+sorting+during+lysosome-phagosome+fusion+is+controlled+by+Rab34%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).</li>
<li>Snijder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li>
<li>Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).</li>
<li>Hemmi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Toll-like+receptor+recognizes+bacterial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA.</a> Nature. 408, 740-745 (2000).</li>
<li>Underhill, D., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors%3A+key+mediators+of+microbe+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors: key mediators of microbe detection.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).</li>
<li>Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I+and+class+III+phosphoinositide+3-kinases+are+required+for+actin+polymerization+that+propels+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes.</a> J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+receptor-ligand+interactions+modulate+gene+expression+and+phagosomal+properties+during+both+early+and+late+stages+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis.</a> Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+phagosome+maturation+as+a+function+of+phagosome%2Flysosome+fusion+and+acquisition+of+hydrolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity.</a> Traffic. 6, 413-420 (2005).</li>
<li>Savina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX2+controls+phagosomal+pH+to+regulate+antigen+processing+during+crosspresentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells.</a> Cell. 126, 205-218 (2006).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+phagosome+maturation+through+the+real-time%2C+spectrofluorometric+measurement+of+hydrolytic+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities.</a> Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).</li>
<li>Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+phagosomal+degradation+and+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).</li>
<li>Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Responds+to+Chloride+and+pH+as+Synergistic+Cues+to+the+Immune+Status+of+its+Host+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
<li>Aziz, M., Yang, W. -L., Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current protocols in immunology. Coliganet, J. E., et al. 14, (2013).</li>
<li>Rogers, L., Foster, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).</li>
<li>Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -M., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+pH%2C+ROS+production%2C+maturation%2C+and+degradation+in+dendritic+cell+phagosomes+using+cytofluorometry-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays.</a> Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nella sezione seguente si discuterà fasi critiche del metodo presentato e le sue limitazioni. Inoltre, ci si collegherà alcuni dei problemi comuni con le loro soluzioni, introdurre eventuali modifiche e valutare i vantaggi del nostro metodo così come i metodi complementari adatti per questo approccio. La preparazione delle perline, compreso l&#39;accoppiamento di IgG di superficie delle sfere, è cruciale e l&#39;uso di preparati unfresh dovrebbe essere evitata. In aggiunta a ciò, è anche fon...

Fagociti professionali, tra macrofagi, svolgono un fondamentale nel sistema immunitario. Oltre ad essere la prima linea di difesa del sistema immunitario innato, ma anche svolgere un ruolo critico nella attivazione della immunità adattativa attraverso la loro segnalazione e presentanti l&#39;antigene ruolo 1-3. Mentre la funzione dei fagociti professionali è multiforme, phagosome maturazione è la spina dorsale critico della funzione di elaborazione battericida ed antigene dei fagociti professionali 4,5. Su engulfment recettore mediata e l&#39;assorbimento di un bersaglio fagocitaria, come batteri, phagosome nascente passa attraverso una sequenza complessa ed armonico di interazione e scambi con compartimenti della rete endocitosi e diversi altri organelli cellulari 6. La natura dei composti scambiate con queste entità cellulari, nonché il regolamento e la tempistica degli eventi di fusione determina il phagosomal milieu luminale e le phagoscomposizione OMAL membrana e, quindi 7, il destino del phagosome maturazione 8. La rilevanza fisiologica di phagosome maturazione è esemplificata dalle diverse strategie utilizzate dai vari agenti patogeni intracellulari di sfuggire, arresto o sovvertire phagosome maturazione 9. La maggior parte di queste strategie impediscono direttamente o indirettamente, la fase finale e critica del processo di maturazione phagosome: la fusione di phagosome con scomparti fine endosomal / lisosomiali, che conferisce loro la maggior parte degli enzimi idrolitici e fattori anti-batterici di un phagosome maturo 7 , 8,10. Analisi di questo passaggio finale e critico quindi ci può fornire con forti indicatori sullo stato di maturazione dei fagosomi e se lo stato fisiologico è essere positivamente o negativamente colpito sotto le impostazioni sperimentali particolari che vengono utilizzati. Il vano tardi endosomal / lisosomiales sono generalmente considerati essere i compartimenti terminali della via endocitosi, definiti e distinti dai primi compartimenti endocitici dalla presenza di vari, determinata fase, molecole marcatori. Per esempio enzimi idrolitici o componenti di membrana quali le proteine ​​di membrana lisosomiale associata (lampade) tra gli altri 11. Il terminale endocitica compartimenti-d&#39;ora in poi indicato semplicemente come lisosomi-servono anche come location principale per le fasi finali della digestione, alla fine della fagocitosi / endocytic percorso 12. In questo modo, non digeribili sonde possono essere caricati tramite endocitosi e macropinocitosi dall&#39;ambiente extracellulare e trasportati attraverso la via endocytic ai lisosomi, dove si accumula 13,14 dopo aver seguito un determinato ciclo di assorbimento e inseguimento. Sonde fluoroforo coniugato per la microscopia a fluorescenza come il destrano polimero organico nondigestible sono comunemente usati come endocyticprobes 15-17. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; In questo metodo, si descrive l&#39;utilizzo di microsfere IgG rivestite come carico fagocitica indagare phagosome maturazione analizzando la consegna di lisosomiale contenuto luminale a phagosomes. Utilizzando una sonda destrano fluoroforo coniugato come marcatore facilmente rilevabile dei lisosomi nel midollo osseo dal vivo macrofagi derivati ​​(BMM) e time-lapse video di imaging con un microscopio confocale a scansione laser, seguiamo il processo dinamico di consegna del carico in phagosomes con elevata risoluzione temporale. Abbiamo poi descrive come i dati di imaging time-lapse raccolti possono essere valutate utilizzando l&#39;open-source e software di analisi dell&#39;immagine liberamente disponibile, Fiji (o ImageJ), statisticamente analizzati utilizzando Microsoft Excel e presentata utilizzando il software GraphPad Prism 14,18. Dopo la descrizione del nostro metodo, esperimenti analoghi possono essere progettati utilizzando le impostazioni modificate e fattori di indagare la loro influenza sulla phagosome maturazione; qualsiasi otil suo tipo di fagociti primarie o linee cellulari aderenti, la perdita genetica degli esperimenti funzionali, tra cui gene knock-out e knock-down, mutanti o espressione delle proteine ​​di fusione, fagocitosi-obiettivi, composti di rivestimento microbead, sonde endosomal / lisosomiali e fattori quali una citochine, inibitori chimici o siRNA tra gli altri sono tutte variabili che possono essere applicate per l&#39;approccio di base di questo metodo. Definiamo l&#39;obiettivo e requisiti di base di questo metodo come segue: <ul type="disc"><li> Obiettivo del metodo: per consentire l&#39;osservazione diretta, quantitativa e qualitativa e l&#39;analisi di phagosome maturazione con alta risoluzione temporale nel vivere fagociti. </li><li> Carico dei fagociti: Un microparticelle opportunamente rivestiti o bersaglio biologico. Qui usiamo IgG-rivestito 3 micron microparticelle sferiche di polistirolo che sono prontamente interiorizzati attraverso il recettore Fc-γ fagocitosi mediata. In alternativa, qualsiasi microrganismo o un microfono patinataroparticle per i quali è presente un recettore fagocitica delle cellule può essere utilizzato. </li><li> Fagociti: fagociti aderenti esprimono gli appropriati recettori fagociti. Qui usiamo il mouse BMMs primari abbondantemente esprimono i recettori Fc-γ. In alternativa, potrebbero essere utilizzati cellule dendritiche (DC), monociti o cellule epiteliali fagocitarie o loro mutanti o varianti genetiche knock-out. </li><li> Lisosomiali cargo: Una sonda lisosomiale fluorescente. Qui, Texas Red-coniugato 70.000 kDa destrano (Dex70kD) è usato come il carico luminale dei lisosomi. In alternativa, qualsiasi marcatore fluorescente rilevabile di un compartimento cellulare o organello, o una sonda appropriata per le proprietà phagosomal come acidità o degradativa capacità, potrebbe essere utilizzata per studiare la progressione della phagosome maturazione. </li><li> Fattori che influenzano: Ad esempio, molecole di segnalazione, composti chimici, gene knock-down, o espressione transiente di proteine ​​mutanti potrebbe. Qui, abbiamo Förguno l&#39;uso di tale fattore per semplicità, ma per un esempio recente con l&#39;espressione della proteina mutante e di knock-down fattori che influenzano Si prega di vedere Kasmapour et al. 18 Qualsiasi fattore che può influenzare la fagocitosi o le circostanze e la mobilità dei phagosomes e / o compartimenti che interagiscono con phagosomes scadenza potrebbero essere utilizzati. </li></ul>

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM)</td><td>PAA, Austria</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium senza rosso fenolo (D-MEM)</td><td>PAA, Austria</td><td>E15-047</td><td></td></tr><tr><td>Fetale Siero Bovino (FBS)</td><td>PAA, Austria</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>PAA, Austria</td><td>M11-004</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA, Austria</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>PAA, Austria</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>WillCo-dish&reg; Piatto con fondo in vetro (35 mm &vuoto;, #1.5)</td><td>WillCo Wells, Paesi Bassi</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>CELLviewTM piatto con fondo in vetro, 35 mm</td><td>Greiner Bio one, Germania</td><td>627871</td><td>Alternativa: Disponibile come</td></tr><tr><td>microsfere di lattice carbossilato</td> segmentato <td>Polysciences, USA</td><td>#09850</td><td>Disponibile in diversi diametri, abbiamo usato 3 &mu; m</td></tr><tr><td>Microparticelle di polistirene</td><td>Kisker Biotech, Germania</td><td>PPs-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH, Germania</td><td>305.1.3</td><td></td></tr><tr><td>topo intero IgG</td><td>Rockland, USA</td><td>010-0102</td><td></td></tr><tr><td>EDAC reticolante</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>E6383-1g</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 1 ml Omnifix -F</td><td>B.Braun, Germania</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>26&nbsp; Ago G (0,45 * 25 mm)</td> <td>B.Baun, Germania</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA, Austria</td><td>E15-039</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>Gibco, USA</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>MES idratare</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &mu; Filtro montato su siringa M</td><td>Sartorius, Germania</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr></tbody></table>

studio di fagolisosoma biogenesis nei macrofagi in diretta

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Fagociti giocano un ruolo importante nel sistema immunitario innato rimuovendo ed eliminando microrganismi invasori nelle loro fagosomi. Phagosome maturazione è un processo complesso e strettamente regolata durante la quale un phagosome nascente subisce drastica trasformazione attraverso le interazioni ben orchestrate, con vari organuli cellulari e scomparti nel citoplasma. Questo processo, che è essenziale per la funzione fisiologica di fagociti dotando phagosomes con le loro proprietà litici e battericide, culmina nella fusione di phagosomes con i lisosomi e biogenesi dei phagolysosomes che è considerato come l&#39;ultimo e fondamentale fase di maturazione per phagosomes. In questo rapporto, descriviamo un metodo basato imaging cellulare dal vivo per l&#39;analisi qualitativa e quantitativa del processo dinamico di lisosomi per phagosome fornitura di contenuti, che è una caratteristica di fagolisosoma biogenesi. Questo approccio utilizza microsfere IgG rivestite come modello per phagocytosis e molecole di destrano fluoroforo coniugato come sonda carico lisosomiale luminale, per seguire la consegna di contenuto dinamico lysosmal ai fagosomi in tempo reale in macrofagi vivi usando time-lapse imaging e microscopia confocale. Qui si descrive nel dettaglio sullo sfondo, le fasi di preparazione e la configurazione step-by-step sperimentale per consentire la distribuzione facile e precisa di questo metodo in altri laboratori. Il nostro metodo descritto è semplice, robusta e, soprattutto, può essere facilmente adattato per studiare le interazioni phagosomal e maturazione in sistemi diversi e in varie impostazioni sperimentali, come l&#39;uso di vari tipi di fagociti, la perdita di funzione esperimenti, diverse sonde, e particelle fagociti.

La corretta preparazione delle cellule e le perline per l&#39;imaging è critica. Figura 1 mostra il profilo della semina, sonda-loading e gradini di imaging iniziale, in questo metodo, basato sulla nostra protocollo ottimizzato per BMMs. È pertanto indispensabile che i parametri di protocollo testati e ottimizzati a seconda del tipo di cellule e sonde che devono essere utilizzati. Dopo l&#39;aggiunta delle perline rivestite con IgG verso le cellule precaricati, è importante ...

Studio di fagolisosoma Biogenesis nei macrofagi in diretta

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è catturare in tempo reale il processo dinamico di maturazione del fagosoma e di biogenesi del fagolisosoma nei fagociti. Questo viene ottenuto caricando i compartimenti lisosomiali delle cellule con una catena di destrano coniugata fluorescente per consentire la visualizzazione dei compartimenti lisosomiali e il trasferimento del loro carico luminale ai fagosomi. Come secondo passaggio, vengono aggiunte microparticelle, che fungono da modello fagocitico.Successivamente, il trasporto del materiale lisosomiale verso i fagosomi viene analizzato mediante imaging in tempo reale e successivo trattamento digitale delle immagini. Per quantificare il processo di maturazione del fagosome, i risultati mostrano l'effetto di diversi fattori sul processo di maturazione del fagosome in base al trasporto del contenuto lisosomiale ai fagosomi. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la valutazione della maturazione dei macrofagi in cellule fissate, è l'output quantitativo con un'elevata risoluzione temporale. Iniziare sciogliendo la destrana marcata con Texas Red da 70 chilodalton o Dex 70 KD in PBS a 20 milligrammi per millilitro e conservare aliquote a meno 20 gradi Celsius.Successivamente, diluire la soluzione madre di Dex 70 KD in Docos completo per colture cellulari, ovvero mezzo di Eagle modificato o DMEM, fino a una concentrazione di circa un milligrammo per millilitro. Sottoporre l'aliquota del filamento DExT a sonicazione in un bagno ad ultrasuoni per cinque minuti. Quindi centrifugare la soluzione in una microcentrifuga alla velocità massima per cinque minuti al fine di rimuovere eventuali grumi o contaminanti dalla soluzione.Spostare con attenzione il SuperAgent in una provetta pulita evitando il pellet sul fondo. Quindi diluire la soluzione fino a una concentrazione finale di lavoro di 20 microgrammi per millilitro in terreno di coltura cellulare completo DMEM e filtrare.Sterilizzare la soluzione attraverso un filtro montato su siringa da 0,22 micrometri. Successivamente, aggiungere due millilitri di macrofagi murini derivati dal midollo osseo a una concentrazione di cinque per 10 alla quarta cellule per millilitro. In DMEM, in una piastra di vetro non rivestita con fondo in vetro, incubare le cellule per almeno 12 ore a 37 gradi Celsius in un’atmosfera tamponata con anidride carbonica al 5%.Per garantire l'attacco e l'acclimatizzazione dopo l'attacco, aspirare il mezzo e aggiungere due millilitri di DMEM con DExT preriscaldato nel piatto con fondo in vetro, quindi incubare le cellule per due a otto ore dopo l'incubazione. Lavare le cellule tre volte con DMEM completo preriscaldato. Aspirare il mezzo dopo l'ultimo risciacquo e aggiungere due millilitri di DMEM completo.Incubare le cellule per quattro-dodici ore. Successivamente, lavare le cellule con DMEM completo privo di rosso fenolo preriscaldato e aggiungere due millilitri di DMEM completo filtrato privo di rosso fenolo almeno 30 minuti prima dell'inizio dell'acquisizione delle immagini. Successivamente, portare un'aliquote del sospensione di barbabietola ricoperta con IgG al 1% preparata come descritto nel protocollo testuale allegato a temperatura ambiente.Sonicare la soluzione in un bagno ad ultrasuoni per due o tre minuti. Quindi, all'interno di una cappa biologica di classe due, aggiungere da uno a sei microlitri della sospensione di perline alle cellule. Diffondere la nuvola densa di perline utilizzando una pipetta per mescolare delicatamente la sospensione nella piastra con fondo in vetro.Quindi portare il campione al microscopio e mettere a fuoco sulla regione di interesse. Prima dell'acquisizione di immagini in time-lapse, ottimizzare le impostazioni, inclusi scansione, velocità, ingrandimento e risoluzione, in modo da poter acquisire un fotogramma ogni sette-venti secondi.Regolare le impostazioni di eccitazione ed emissione in base al sistema di imaging e alle sonde utilizzate, ottimizzando tali impostazioni per prevenire un eccessivo sbiancamento fotoindotto. Quindi acquisire il video in time-lapse e salvarlo nel formato file nativo del microscopio. Evitare di esportare il video in formati compressi come JPG o PNG.Successivamente, avviare Fiji e la distribuzione di Image J contenente un pacchetto per l'elaborazione delle immagini con menu degli strumenti riorganizzati e ulteriori plugin nativi disponibili gratuitamente. Scaricare il programma. Aprire il file in Fiji e selezionare il video da valutare. Quindi impostare le opzioni, i filtri e i parametri di misurazione come specificato nel protocollo testuale allegato.Successivamente, esaminare le immagini individuando il fotogramma in cui si forma un fagosoma nascente completamente sviluppato e la coppa acida F si chiude. Utilizzare lo strumento di selezione ovale per selezionare una regione di interesse (ROI) circolare sul bead internalizzato. Assicurarsi che la selezione aderisca strettamente al bordo esterno del bead.Quindi andare su Analizza e fare clic su Misura per eseguire la misurazione. Il risultato verrà visualizzato in una finestra separata intitolata Risultati. Nel successivo fotogramma di interesse, regolare la posizione dell'area di interesse nel caso in cui la perla si sia spostata e ripetere la misurazione, che verrà aggiunta all'elenco nella finestra dei risultati.Ogni fotogramma analizzato può essere identificato in base al valore nella colonna label. Dopo aver completato la misurazione di tutti i fotogrammi rilevanti, copiare i valori dalla colonna int den in un'applicazione per fogli di calcolo. La colonna int den rappresenta le intensità dell'area selezionata.Utilizzando questi metodi, sono state ottenute immagini nitide di macrofagi derivati dal midollo osseo caricati con le sonde a filamento DExT. Questa immagine corrisponde al tempo zero, ovvero al momento immediatamente successivo al completamento dell'internalizzazione da parte della cellula del microsfera codificata con IgG indicata qui. Le immagini mostrate sono state colorate artificialmente per una migliore visibilità e rappresentano il fagosoma da zero a 85 minuti dopo l'internalizzazione.Il fagosoma misurato, ROI, è delimitato dalla linea tratteggiata e le singole fasi di consegna e accumulo della destrina nel fagosoma sono indicate dalle frecce. I grafici sono stati quindi generati a partire da queste immagini e mostrano un chiaro andamento temporale dell'associazione del segnale al fagosoma nel tempo. Questo grafico rappresenta la media di 10 fagosomi provenienti dalle due cellule mostrate qui.Sebbene l'intensità assoluta del segnale vari spesso tra ciascun fagosoma analizzato, l'andamento temporale è normalmente molto simile. Il rilascio del Dex 70 KD nei fagosomi ha raggiunto una fase di plateau entro 35-40 minuti dal termine della fagocitosi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come valutare la maturazione dei fagosomi mediante microscopia confocale a tempo reale.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Questo video mostra una tecnica di microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) ad alta risoluzione per la visualizzazione in tempo reale della formazione e della chiusura dei fagosomi durante la fagocitosi mediata dai macrofagi dei globuli rossi (RBC) opsonizzati da IgG attaccati alla superficie di un piatto con fondo di vetro. I macrofagi estendono gli pseudopodi attorno ai globuli rossi e li inghiottono all'interno dei fagosomi, staccandoli dalla superficie del vetro.

Visualizzazione basata su microscopia TIRF della formazione e della chiusura dei fagosomi

Si descrivono i metodi per il live-cell microscopia...

Live-cellula Microscopia Video di funghi patogeni fagocitosi

Descriviamo una configurazione sperimentale per visualizzare con un'alta risoluzione senza precedenti la formazione e la chiusura di fagosomi in tre dimensioni in macrofagi viventi, utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Consente il monitoraggio della base della coppa fagocitica, degli pseudopodi estensibili e del sito preciso della scissione fagosomiale.

&quot;Phagosome chiusura Assay&quot; per visualizzare phagosome Formazione in tre dimensioni utilizzando la riflessione totale interna fluorescente Microscopy (TIRFM)

Descriviamo un metodo per misurare la velocità dei fagosomi che si muovono verso il centro cellulare in cellule viventi infettate con o senza il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) di tipo 1, utilizzando la microscopia a fluorescenza confocale a disco rotante per identificare le cellule infette fluorescenti e la microscopia a campo chiaro per rilevare i fagosomi.

Migrazione phagosome e velocità misurata in Live primarie macrofagi umani infettati con HIV-1

Qui descriviamo una tecnica basata sul microscopio per visualizzare e quantificare le prime cascate di eventi durante la fagocitosi di agenti patogeni come i funghi Candida albicans e particolati che sono più grandi di 0,5 μm, inclusi zimosani e perle rivestite di IgG.

Visualizzare le fasi iniziali della fagocitosi

Vi presentiamo metodi per valutare la capacità fagocitica di primari macrofagi murini derivate da midollo osseo, utilizzando residui del myelin fluorescente contrassegnati e lipido intracellulare gocciolina macchiatura.

In Vitro Fagocitosi di residui del Myelin dai macrofagi derivate da midollo osseo

Descriviamo qui un metodo semplice e rapido per l'isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi rivestendo i batteri con biotina e streptavidina.

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

Qui descriviamo i metodi usando la microscopia di confocal di filatura disco ai singoli eventi fagocitica immagine di residenti macrofagi peritoneali del topo. I protocolli possono essere esteso ad altre cellule fagocitiche.

Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo

Il meccanismo associato alla fagocitosi nell'infezione da Leishmania rimane poco conosciuto. Qui, descriviamo i metodi per valutare gli eventi precoci che si verificano durante l'interazione di Leishmania con le cellule ospiti.

Studiare la fagocitosi della Leishmania usando la microscopia confocale

Questo studio chiarisce l'elaborazione fagocitaria delle particelle Godanti Bhasma (GB) nelle cellule di mammifero, caratterizzandone l'assorbimento cellulare, la dinamica del vacuolo, l'acidificazione e la degradazione. Questi risultati non solo migliorano la nostra comprensione dei meccanismi fondamentali della fagocitosi, ma stabiliscono anche la GB come un promettente sistema modello per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche.

Esplorazione degli eventi cellulari sequenziali della fagocitosi innescata da Godanti Bhasma nelle cellule di mammifero

Scopri la biogenesi del fagolisosoma nei macrofagi mediante imaging cellulare in tempo reale con destrano fluorescente. Questo metodo quantitativo ad alta risoluzione temporale migliora lo studio della maturazione dei fagosomi rispetto alle analisi su cellule fissate.

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