Studio di fagolisosoma Biogenesis nei macrofagi in diretta

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di catturare il processo dinamico in tempo reale della maturazione dei fagosomi e della biogenesi dei fagolisosomi nei fagociti. Ciò si ottiene caricando i compartimenti lisosomiali delle cellule con filamento dex coniugato fluorescente per consentire la visualizzazione dei compartimenti lisosomiali e il trasferimento del suo carico luminale ai fagosomi. Come secondo passaggio, vengono aggiunte microparticelle, che fungono da modello fagocitico.

Successivamente, la consegna di materiale lisosomiale ai fagosomi viene analizzata utilizzando l'imaging di vendita dal vivo e la successiva elaborazione digitale delle immagini. Al fine di quantificare il processo di maturazione dei fagosomi, i risultati mostrano l'effetto di vari fattori sul processo di maturazione dei fagosomi in base alla consegna del contenuto lisosomiale ai fagosomi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la valutazione della maturazione dei macrofagi in cellule fissate, è la lettura quantitativa con un'alta risoluzione temporale Iniziare sciogliendo il filamento di DExT da 70 kilodalton marcato in rosso del Texas o il Dex 70 KD in PBS a 20 milligrammi per millilitro e conservare le aliquote a meno 20 gradi Celsius.

Successivamente, diluire il ceppo Dex 70 KD in coltura cellulare completa Docos, terreno aquile modificato o DMEM a circa un milligrammo per millilitro. Sonicare l'aliquota del filamento DExT in un bagno d'acqua a ultrasuoni per cinque minuti. Quindi centrifugare la soluzione in una microcentrifuga alla massima velocità per cinque minuti per rimuovere eventuali grumi o contaminanti dalla soluzione.

Spostare con cautela il SuperAgent in un tubo nuovo evitando il pellet sul fondo. Quindi diluire la soluzione a una concentrazione finale di 20 microgrammi per millilitro in coltura cellulare completa. DMEM e filtro.

Sterilizzare la soluzione attraverso un filtro montato su siringa da 0,22 micrometri. Successivamente, vedi due millilitri di macrofagi di topo derivati dal midollo osseo a una concentrazione di cinque volte 10 per la quarta cellula per millilitro. In DMEM in un piatto di vetro non rivestito, incubare le cellule per almeno 12 ore a 37 gradi Celsius in un'atmosfera tamponata con anidride carbonica al 5%.

Per garantire l'adesione e l'acclimatazione dopo l'attacco, aspirare il terreno e aggiungere due millilitri di DMEM prebellico sul fondo di vetro, quindi incubare le cellule per due-otto ore dopo l'incubazione. Lavare le celle tre volte con preriscaldamento DMEM completo. Aspirare il terreno dopo il risciacquo finale e aggiungere due millilitri di DMEM completo.

Incubare le cellule per quattro-12 ore. Quindi sciacquare le celle con DMEM completo privo di rosso fenolo preriscaldato e aggiungere due millilitri di DMEM completo filtrato senza rosso fenolo almeno 30 minuti prima dell'inizio dell'imaging. Quindi, portare a temperatura ambiente un'aliquota di sospensione di barbabietola rivestita all'1% di IgG preparata come descritto nel protocollo di testo allegato.

Sonicare la soluzione in un bagno d'acqua a ultrasuoni per due o tre minuti. Quindi, sotto una cabina di biosicurezza di classe due, aggiungere da uno a sei microlitri della sospensione di perline alle cellule. Diffondere la densa nuvola di perle utilizzando una pipetta per mescolare delicatamente la sospensione nel piatto con fondo in vetro.

Quindi portare il campione al microscopio e mettere a fuoco la regione di interesse. Prima dell'imaging time-lapse. Ottimizza le impostazioni, tra cui scansione, velocità, ingrandimento e risoluzione per poter acquisire un fotogramma ogni sette-20 secondi.

Regolare le impostazioni di emissione dell'eccitazione in base al sistema di imaging e alle sonde utilizzate e ottimizzare le impostazioni per evitare un eccessivo sbiancamento delle foto. Quindi cattura il video time lapse e salvalo nel formato di file nativo del tuo microscopio. Evita di esportare il video in formati compressi come JPG o PNG.

Successivamente, avvia la distribuzione Fiji e Image J contenente un pacchetto di elaborazione delle immagini con menu degli strumenti riorganizzati e plug-in nativi aggiuntivi disponibili gratuitamente. Scaricare. Apri il file nelle Fiji e seleziona il video che deve essere valutato. Quindi impostare le opzioni, i filtri e i parametri di misurazione come descritto nel protocollo di testo allegato.

Quindi, scansiona le immagini notando il fotogramma in cui si forma un fagosoma di perline nascente completamente formato e la coppa acida F è chiusa. Utilizzare lo strumento di selezione Ovale per selezionare una regione circolare di interesse o ROI sul cordone internalizzato. Assicurarsi che la selezione si adatti perfettamente al bordo esterno del cordone.

Quindi vai su analizza e fai clic su misura per eseguire la misurazione. Il risultato verrà visualizzato in una finestra separata intitolata risultati. Nel prossimo fotogramma di interesse, regolare la posizione della ROI nel caso in cui il cordone si sia spostato e ripetere la misurazione, che verrà aggiunta all'elenco nella finestra dei risultati.

Ogni frame analizzato può essere identificato in base al valore nella colonna dell'etichetta. Dopo aver completato la misurazione di tutti i fotogrammi pertinenti, copiare i valori dalla colonna int den in un'applicazione per fogli di calcolo. La colonna int den rappresenta le intensità dell'area selezionata.

Utilizzando questi metodi, sono state acquisite immagini chiare dei macrofagi derivati dal midollo osseo che erano stati caricati con le sonde a filamento DExT. Questa immagine è del tempo zero, che è proprio quando la cellula ha completato l'assorbimento della perlina codificata IgG qui indicata. Le immagini mostrate qui sono state pseudo colorate per una migliore visibilità e raffigurano il fagosoma da zero a 85 minuti dopo l'assorbimento.

Il fagosoma misurato, il ROI è delineato con la linea tratteggiata e i casi di consegna e accumulo di destrano nel fagosoma sono indicati dalle frecce. Da queste immagini sono stati poi generati dei grafici che mostrano una chiara tendenza temporale dell'associazione del segnale con il fagosoma nel tempo. Questo grafico rappresenta una media di 10 fagosomi delle due cellule mostrate qui.

Mentre l'intensità del segnale assoluto varia spesso tra ogni fagosoma analizzato, l'andamento temporale è normalmente molto simile. Somministrazione di Dex 70 KD ai fagosomi, un plateau è stato raggiunto entro 35-40 minuti dopo la fagocitosi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la maturazione dei fagosomi utilizzando la microscopia confocale time-lapse.