Name: Sintesi di una proteina artificiale mediata da inteina Hydrogel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 6 s
Description: Scopri la sintesi di un idrogel proteico altamente stabile mediante reazioni di splicing di inteine. Questo metodo utilizza blocchi proteici purificati per creare un scaffold versatile per l'immobilizzazione di proteine funzionali.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. David Tirrell (Caltech) per la sua gentile dono del plasmide pQE9 AC 10 ATRP 12, il Dr. Tom Muir (Princeton University) per la sua gentile dono del plasmide kanr-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr. Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Giappone) per la sua gentile dono del plasmide PET30-Cuta-Tip1 10, e il Dr. Jay D. Keasling (UC Berkley) per la sua gentile dono del plasmide pJD757 13 . Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla National Science Foundation CARRIERA, US Air Force YIP e Norman Hackman Programma di ricerca avanzata.

1. Plasmide Costruzioni NOTA: Tutti i geni sono stati amplificati in reazioni di PCR standard utilizzando Phusion-High Fidelity DNA Polymerase secondo le specifiche del produttore. Primer utilizzati per il clonaggio sono stati descritti in precedenza 9. Tutti i costrutti sono elencati nella Tabella 1. <ol><li> Per generare Cuta-NpuN (N, Tabella 1): <ol><li> PCR amplifica Cuta e NpuN geni da plasmidi PET30-Cuta-Tip1 10 e kanr-IntRBS-NpuNC-CFN 11, rispettivamente, utilizzando i primer appropriati. </li><li> Digerire questi frammenti con gli appropriati enzimi di restrizione e sequenzialmente inserire questi frammenti nel vettore pET26b tra il promotore T7 e un tag 6xHistidine C-terminale per generare N (Figura 2A). </li></ol></li><li> Per generare NpuC-S-Cuta (C, tabella 1): <ol><li> PCR amplificare NpuC, Cuta e S frammentazionet [AG 3 (PEG)] 10 dal plasmide kanr-IntRBS-NpuNC-CFN 11, PET30-Cuta-Tip1 10 e pQE9 AC 10 ATRP 12, rispettivamente, utilizzando i primer appropriati. </li><li> Digerire questi frammenti con gli appropriati enzimi di restrizione e sequenzialmente inserire questi frammenti nel vettore pET26b tra promotore T7 e un 6xHistidine C-terminale per generare C (Figura 2B). </li></ol></li><li> Per generare NpuC-S-SH3 lig-Cuta (C-SH3 lig, Tabella 1): <ol><li> PCR Amplificazione Cuta utilizzando primer contenenti un lig SH3 (PPPALPPKRRR) ed un linker flessibile (GGGGS) 2 per generare frammento SH3 lig-Cuta. </li><li> Sostituire il gene Cuta da C con frammento SH3 lig-Cuta. </li></ol></li><li> Per generare SH3-GFP (Tabella 1): <ol><li> Amplificare il gene SH3 dal plasmide pJD757 13 utilizzando ilprimer appropriati. </li><li> Fondere questo frammento di gene GFP e inserirlo nel vettore pET26b tra il promotore T7 (Figura 2C) e un tag 6xHistidine C-terminale. </li></ol></li></ol> 2. Protein Expression <ol><li> Trasformare 50 ml di chimicamente competenti di Escherichia coli BL21 (DE3) con il plasmide di espressione appropriato. </li><li> Dopo la trasformazione, serialmente diluire queste cellule, e piatto su Luria-Bertani (LB) / piastre di agar contenenti 50 ug / ml kanamicina. </li><li> Incubare le piastre contenenti cellule trasformate a 37 ° C per ~ 15 ore. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, scegliere la piastra contenente 50-100 colonie e risospendere tutte le colonie in 5 ml di brodo LB. </li><li> Sospensione Trasferimento a 1 L di brodo LB contenente kanamicina (50 mcg / ml) e crescere le cellule a 37 ° C con agitazione a 250 rpm. Monitorare l&#39;assorbanza a 600 nm (OD 600). Far crescere la cultura fino OD 600 ~ 0.8. <ol><li> Per C e C-SH3 lig, indurre l&#39;espressione della proteina aggiungendo isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) alla coltura (1 mM concentrazione finale) e incubare la coltura a 37 ° C per 4 ore sotto agitazione a 250 rpm. </li><li> Per N e SH3-GFP, raffreddare la cultura a ~ 18 ° C immergendo il pallone di coltura in un bagno di acqua ghiacciata per ~ 5 min. Indurre l&#39;espressione di proteine ​​con l&#39;aggiunta di IPTG alla cultura (concentrazione finale 1 mM) e incubare la coltura a 18 ° C per 14-18 ore agitando a 250 rpm. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;espressione della proteina, centrifugare la cultura a 6.000 xg per 20 min a 4 ° C per raccogliere il pellet. Pellet cellulare conservare a -80 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol> 3. Protein Purification <ol><li> Purificazione di N (condizioni denaturanti) <ol><li> Risospendere pellet cellulari in tampone A (Tabella 2) a 10 ml / g di pellet bagnato. </li><li> Immersposta la sospensione pellet in un bagno di ghiaccio-acqua e distruggere le cellule mediante sonicazione (Amp 10, con 1 sec impulso e 6 sec pausa di 1 min). </li><li> Centrifugare il lisato a 16.000 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Scartare il surnatante. Risospendere il pellet in Buffer DA (contenente 8 M urea) e centrifugare la sospensione a 16.000 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Passare il surnatante con una colonna di 5 ml di acido Ni-nitrilotriacetico (NTA) precedentemente equilibrata con tampone DA. </li><li> Lavare colonna con 30 ml di tampone DA integrato con imidazolo 45 mM. Eluire proteina purificata utilizzando 20 ml di tampone DA integrato con imidazolo 150 mM. </li><li> Ridurre la concentrazione di urea nel campione ad &lt;1 mM da uno tra i seguenti metodi indicati in 3.1.7.1 o 3.1.7.2: <ol><li> Dializzare proteina in tampone DPBS (Tabella 2) a 4 ° C per una notte usando tubi con &lt;20 kDa cutoff. </li><li> Centrifugare purificato proteina in un 30 &amp; #160; kDa ultra-filtrazione centrifuga colonna a 2.800 xg, a 4 ° C fino a quando il volume è inferiore a 1 ml. Aggiungere 14 ml tampone DPBS alla colonna di diluire il campione di proteine. Ripetere la centrifugazione / diluizione passaggi da altre tre volte. </li></ol></li><li> Dopo lo scambio di tamponi, aggiungere ditiotreitolo (DTT) per la proteina purificata (finale 2 mM) e concentrato proteico di ~ 100 mg / ml mediante centrifugazione attraverso un ultra-filtrazione centrifuga colonna 30 kDa a 2800 xg, a 4 ° C. </li><li> Aliquotare proteica concentrata e conservare a -80 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol></li><li> Purificazione di C e C-SH3 lig (condizione nativo) <ol><li> Risospendere pellet cellulari in tampone B (pH 6,0) (Tabella 2) supplementato con 1x cocktail di inibitori delle proteasi a 10 ml / g di pellet bagnato. Utilizzare tampone acido a minimizzare la degradazione proteolitica della proteina bersaglio. </li><li> Perturbare sospensione cellulare mediante sonicazione come descritto in 3.1.2. Centrifugare del Lysmangiato a 16.000 xg per 20 min a 4 ° C e conservare il surnatante. </li><li> Passare il lisato solubile attraverso una colonna 5 ml Ni-NTA precedentemente equilibrata con tampone B. </li><li> Lavare colonna con tampone B supplementato con imidazolo 45 mM, ed eluire la proteina bersaglio in 20 ml di tampone B supplementato con imidazolo 150 mM. </li><li> Per la C, passare al punto 3.2.6. Per la C-SH3 lig, effettuare una purificazione a scambio ionico ulteriore passo per rimuovere proteine ​​parzialmente degradata come indicato nei punti 3.2.5.1 alla 3.2.5.3 <ol><li> Ridurre la concentrazione di NaCl in C-SH3 lig a &lt;1 mm seguendo la procedura descritta in 3.1.7. </li><li> Caricare la proteina bersaglio su un ml scambiatore anionico perline agarosio colonna 5 matrice precedentemente equilibrata con tampone sodio fosfato (50 mM, pH 7,0). </li><li> Eluire obiettivo della proteina dalla colonna eseguendo un gradiente da una soluzione contenente 10 mM Tris-HCl pH 8.0 buffer per una soluzione contenente lo stesso tampone supplementato con 1 M NaCl. Prelevare campioni durante proteine ​​eluizione e campioni piscina con la massima purezza basato su sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE). </li></ol></li><li> Buffer scambiare la proteina purificata in tampone DPBS, come descritto in 3.1.7. </li><li> Aggiungere DTT alla proteina purificata (concentrazione finale 2 mM) e concentrare la proteina di ~ 100 mg / ml usando un ultra-filtrazione colonnine 30 kDa come descritto in 3.1.8. Aliquotare e conservare concentrate proteine ​​a -80 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol></li><li> Purificazione di SH3-GFP <ol><li> Pellet cellulari Risospendere con tampone A a 10 ml / g di pellet bagnato. </li><li> Disrupt sospensione pellet mediante ultrasuoni come descritto in 3.1.2. </li><li> Centrifugare il lisato a 16.000 xg per 20 min a 4 ° C e raccogliere il surnatante. </li><li> Passare il surnatante (lisato solubile) attraverso una colonna 5 ml Ni-NTA precedentemente equilibrata conBuffer A. </li><li> Lavare colonna con 30 ml di tampone A completato con imidazolo 45 mM. Eluire proteina purificata utilizzando 20 ml di tampone A, completata con imidazolo 150 mM. </li><li> Buffer scambiare la proteina purificata nel buffer DPBS utilizzando un approccio simile a quello descritto in 3.1.7 e concentrare la proteina di ~ 150 mg / ml utilizzando un ultra-filtrazione colonnine 30 kDa come descritto in 3.1.8. </li><li> Aliquotare e deposito proteico purificato a -80 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol></li><li> SDS-PAGE analisi di campioni purificati contenenti Cuta <ol><li> Diluire ogni proteina purificata in acqua bidistillata per ridurre la concentrazione di NaCl a ~ 1 mM. A questa concentrazione di NaCl, la maggior parte delle proteine ​​Cuta Trimer gestita come monomeri su gel SDS-PAGE. </li><li> Mescolare campioni con tampone campione SDS 2x (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% glicerolo, 10% w / v SDS, 0.1% w / v bromo-fenolo blu, 2% β-mercaptoetanolo), incubato a 95 ° C per 5 min. </li><li> Caricare il samcipi su un gel SDS-PAGE 12%. Effettuare elettroforesi ad una tensione costante di 200 V per ~ 50 min. </li><li> Osservare proteine ​​in gel mediante colorazione con blu brillante Coomassie R250 seguendo i protocolli standard (Figura 1C). </li></ol></li></ol> 4. Idrogel Formazione NOTA: i idrogel campione eseguite in questo studio contengono 1,6 mm di ogni blocco di idrogel salvo diversa indicazione. Questa concentrazione proteica produce un idrogel morbida e stabile. ATTENZIONE: Sodio azide (NaN 3) è aggiunto l&#39;idrogel ad una concentrazione finale di 0,5% w / v per prevenire la contaminazione batterica. NaN 3 è altamente tossico e deve essere maneggiata con estrema cura, come indicato nella scheda di dati di sicurezza del materiale. <ol><li> Calcolare il volume per ciascuna delle proteine ​​concentrate necessari per ottenere una concentrazione finale di 1,6 mM in un idrogel campione 100 microlitri. Per esempio: Concentrazione di N:100 mg / ml Peso molecolare di N: 26.3 kDa (vedi Tabella 1) Concentrazione 100 microlitri desiderata:: volume desiderato 1,6 mm <img alt="" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" width="600" /></li><li> Per effettuare una microlitri idrogel 100 (1,6 mM), mescolare C (x ml, volume calcolato secondo 4.1) con 5% NaN 3 (10 ml), DTT 100 mM (5 ml) e N (y microlitri, volume calcolato secondo 4.1) in una fiala di vetro da 2 ml. </li><li> Aggiungi il tampone di DPBS ((85 - x - y) microlitri) per flaconcino per ottenere un volume finale di 100 ml e mescolare manualmente tutti i componenti attraverso un movimento rotatorio con un puntale. Nota: La soluzione diventa molto viscoso con la miscelazione. </li><li> Centrifugare la miscela per 2 minuti a 8000 xg per rimuovere le bolle d&#39;aria. </li><li> Incubare la miscela a temperatura ambientetemperatura durante la notte per permettere la reazione inteina trans-splicing per raggiungere il completamento. Confermare la formazione di idrogel girando il tubo a testa in giù. Le proteine ​​non affluiranno se si forma un idrogel. </li><li> Stima della resa inteina trans-splicing controllando campioni (0,5 microlitri ciascuno) raccolti prima fase 4.2 e 4.5 dopo passo su un gel SDS-PAGE, come descritto in 3.4 (Figura 1C). </li></ol> 5. Immobilizzazione della GFP via Docking Protein (DP) e Docking Station Peptide (DSP) Interazione <ol><li> Per fare un 50 microlitri GFP-funzionalizzato idrogel (1,2 mM), combinare C-SH3 lig (x microlitri, calcolato secondo 4.1) e SH3-GFP (y microlitri, calcolato secondo 4.1) in rapporto molare 1:1 in 1.7 ml provetta e incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Aggiungere 5% NaN 3 (5 ml), DTT 100 mm (2,5 ml), (42.5 - x - &lt;em&gt; y) DPBS microlitri allo stesso tubo. Aggiungere N (y microlitri, calcolato secondo 4.1) per ottenere un rapporto 1:1 molare di N e C-SH3 lig. Mescolare il campione utilizzando un puntale da un moto vorticoso. </li><li> Centrifugare la miscela a 8.000 xg per 2 minuti e incubare la miscela a temperatura ambiente per una notte al buio. Un idrogel incapsulando forme SH3-GFP durante l&#39;incubazione. </li></ol> 6. L&#39;uso di 1.6 Hydrogel mM come impalcatura immobilizzazione per reazione enzimatica in solvente organico <ol><li> Utilizzare l&#39;HRP come modello enzima. Preparare una soluzione stock di HRP (28 mg / ml o 0,63 mm) a DPBS. </li><li> Per effettuare una microlitri idrogel 30 (1.6 mM) entrapping HRP, unire C (x microlitri, calcolato secondo 4.1) con HRP (2 ml), 5% NaN 3 (3 ml) e DTT (1,5 ml di 100 mM) all&#39;interno di un 1,7 ml provetta da centrifuga. </li><li> Aggiungi N (y &lt;/ Em&gt; microlitri, calcolato secondo 4.1) e DPBS (23.5 - x - y) microlitri. Mescolare con un puntale con un movimento vorticoso. </li><li> Centrifugare la miscela a 8.000 xg per 2 minuti e incubare a temperatura ambiente per una notte. ATTENZIONE: i reggenti utilizzati per il seguente saggio di attività sono altamente tossici. Utilizzare raccomandazioni di sicurezza specifiche per le corrispondenti Schede Dati di Sicurezza. </li><li> Per reazione enzimatica, immergere l&#39;idrogel in 1 ml di cocktail di reazione contenenti N, diammina N-dimetil-p-fenilene (5,8 mM), fenolo (5,8 mM) e tert-butil idroperossido (2,9 mM) in n-eptano 14. Interrompere manualmente il gel utilizzando un puntale per aumentare la superficie di contatto di idrogel e il solvente. </li><li> Controllo prodotto HRP, un indofenolo tipo dye, misurando l&#39;assorbanza ottica di campioni prelevati in tempi diversi a 546 nm in un lettore di piastre (Figura 5). </li> &lt;/ Ol&gt;

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</ol>

Non esistono interessi finanziari concorrenti.

In questo lavoro, abbiamo dimostrato la sintesi di un altamente stabile mediata da inteina idrogel proteina. L&#39;uso di una scissione consente inteina l&#39;idrogel essere condizionale formata in risposta alla miscelazione dei due componenti in fase liquida. In particolare, la scissione collega inteina covalentemente due blocchi in fase liquida tramite una reazione di trans-splicing, producendo una unità polipeptide fiancheggiato da reticolazione unità che a sua volta sé ​​assembla in un idrogel. La formazion...

Gli idrogel interamente in proteine ​​portano il potenziale per far avanzare in modo significativo campi diversi come l&#39;ingegneria dei tessuti, somministrazione di farmaci e biofabrication 1. Essi offrono vantaggi rispetto ai tradizionali idrogel polimerici sintetici, tra cui biocompatibilità e la possibilità di sostenere in modo non invasivo l&#39;incorporazione di proteine ​​globulari bioattive. In questo lavoro, si descrive lo sviluppo di una proteina idrogel romanzo formata tramite split-mediata da inteina reazione proteina trans-splicing e la sua applicazione come impalcatura immobilizzazione di proteine ​​(Figura 1). Gli elementi fondamentali per questo idrogel sono due blocchi copolimeri proteine ​​comprendenti ciascuno il frammento N-o C-terminale di una inteina suddivisa (IN e IC) e una subunità di una proteina multimerica reticolante. Il DnaE inteina da Nostoc punctiforme (Npu) è stato utilizzato come inteina suddivisa 2,3 e una piccola proteina trimeric (12 kDa) Cuta da Pyrococcus horikoshii &lt;/ Em&gt; è stato utilizzato come 4,5 proteina reticolante. Diversi reticolanti sono uniti attraverso inteina reazione catalizzata trans-splicing, che porta alla formazione di una rete di proteine ​​altamente reticolato (idrogel). Npu inteina è stato scelto per le sue cinetica di reazione rapida (t 1/2 = 63 sec) e ad alto rendimento trans-splicing (vicino al 80%) 2,3. La proteina Cuta stato scelto come reticolante grazie alla sua elevata stabilità. Trimeri Cuta hanno una temperatura di denaturazione di prossimità 150 ° C e mantenere la struttura quaternaria trimeric in soluzioni contenenti fino al 5 M guanidina cloridrato 4,6. Dal momento che lo scambio tra le diverse subunità crosslinkers è un importante contributo della idrogel fisica superficie di erosione 7, molto forte interazione tra subunità in Cuta dovrebbe scoraggiare tali scambi subunità, portando ad un idrogel più stabile. Uno di questi blocchi contiene anche un peptide altamente idrofilo S-frammento come mid-block per facilitare acquaritenzione 8. Miscelazione dei due blocchi idrogel inizio a una reazione trans-splicing tra IN e IC inteina frammenti, generando una catena polipeptidica più con reticolanti a entrambi i terminali. Reticolanti da più tali unità molecolari interagiscono tra loro, formando una rete idrogel altamente reticolato (Figura 1A). Una specifica &quot;docking station peptide&quot; (DSP) è incorporato in uno dei blocchi di idrogel per facilitare immobilizzazione stabile di un &quot;aggancio proteina&quot; (DP)-tag proteina bersaglio in idrogel. L&#39;uso di una inteina suddivisa per mediare il montaggio idrogel non solo fornisce una maggiore flessibilità per la sintesi proteica idrogel, ma permette anche ad alta densità, il caricamento uniforme della proteina bersaglio nell&#39;intero idrogel, come le proteine ​​target vengono caricati prima della formazione idrogel. La proteina idrogel mediata da inteina è altamente stazioneBLE in soluzione acquosa con poco a nessuna erosione rilevabile dopo 3 mesi a temperatura ambiente. La stabilità è mantenuto in una vasta gamma di pH (6-10) e temperature (4-50 ° C), e l&#39;idrogel è anche compatibile con solventi organici. Questo idrogel viene utilizzato per l&#39;immobilizzazione di due proteine ​​globulari: la proteina fluorescente verde (GFP) e la perossidasi di rafano (HRP). Idrogel intrappolare quest&#39;ultima proteina viene utilizzato per eseguire biocatalysis in un solvente organico.

<table><tbody><tr><td> Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà </td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td> </td></tr><tr><td> Competente Escherichia coli BL21 (DE3) </td><td>New England BioLabs</td><td>C2527I</td><td> </td></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td>VWR</td><td>90003-350</td><td> </td></tr><tr><td> Bacto Agar Media </td><td>VWR</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>VWR</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> IPTG </td><td>VWR</td><td>EM-5820</td><td> </td></tr><tr><td> Imidazolo </td><td>VWR</td><td>EM-5720</td><td> </td></tr><tr><td> Urea </td><td>VWR</td><td>EM-9510</td><td> </td></tr><tr><td> Ditiotreitolo (DTT) </td><td>Fisher</td><td>BP172-5</td><td> </td></tr><tr><td> Cocktail di inibitori della proteasi </td><td>Roche Applied Science</td><td>11836153001</td><td> </td></tr><tr><td> DPBS </td><td>VWR</td><td>82020-066</td><td> </td></tr><tr><td> Brilliant Blue R </td><td>Acros Organics</td><td>A0297990</td><td> </td></tr><tr><td> Sodium Azide </td><td>Fisher</td><td>AC190380050</td><td> Attenzione, altamente tossico </td></tr><tr><td> Perossidasi di rafano </td><td>Sigma</td><td>P8125-5KU</td><td> </td></tr><tr><td>N,N-dimetil-p-fenilendiammina</td><td>Fisher</td><td>AC408460250</td><td> Attenzione, altamente tossico </td></tr><tr><td> fenolo </td><td>Fisher</td><td>AC149340500</td><td> Attenzione, altamente tossico </td></tr><tr><td>terz-butile idroperossido</td><td>Fisher</td><td>AC180340050</td><td> Attenzione, altamente tossico </td></tr><tr><td> n-eptano </td><td>Acros Organics</td><td>120340010</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td> Shaker/Incubator </td><td>Fisher Scientific</td><td>Max Q 6000</td><td> </td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td>Sorvall</td><td>RC 6</td><td> </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td>QSonica</td><td>Misonix 200</td><td> </td></tr><tr><td> Provette per ultrafiltrazione </td><td>Amicon Ultra</td><td>UFC903024</td><td> </td></tr><tr><td> &nbsp; Colonna HisTrap ad alte prestazioni Ni Sepharose </td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5248-01</td><td> </td></tr><tr><td> HiTrap SP Sepharose FF colonna a scambio ionico </td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5156-01</td><td> </td></tr><tr><td> Plate reader </td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax Gemini EM</td><td> </td></tr></tbody></table>

sintesi di una proteina artificiale mediata da inteina hydrogel

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Presentiamo la sintesi di una proteina idrogel altamente stabile mediata da uno split-inteina catalizzata reazione proteina trans-splicing. Le componenti di questo idrogel sono due blocchi copolimeri proteine ​​contenenti ciascuno una subunità di una proteina trimeric che funge da reticolante e una metà di una inteina scissione. Una bobina casuale altamente idrofila viene inserito in uno dei blocchi copolimeri per la ritenzione idrica. Miscelazione dei due copolimeri a blocchi proteina innesca una reazione trans-splicing inteina, ottenendo una unità polipeptide con reticolanti alle due estremità che rapidamente auto-assembla in un idrogel. Questo idrogel è molto stabile sia in condizioni acide o basiche, a temperature fino a 50 ° C, e in solventi organici. L&#39;idrogel rapidamente riforme dopo la rottura shear-indotta. Costituzione di una &quot;docking station peptide&quot; in blocco dell&#39;edificio idrogel permette conveniente incorporazione di &quot;aggancio proteina&quot;-tagged proteine ​​bersaglio.L&#39;idrogel è compatibile con mezzi di crescita di coltura tissutale, supporta la diffusione di molecole 20 kDa, e consente l&#39;immobilizzazione di proteine ​​globulari bioattivi. L&#39;applicazione del idrogel proteine ​​mediata da inteina come biocatalizzatore compatibile organico-solvente è stato dimostrato incapsulando l&#39;enzima perossidasi di rafano e corroborare la sua attività.

Uno schema per mediata da inteina formazione proteica idrogel è presentato nella Figura 1A. Gli elementi costitutivi del idrogel sono la proteina copolimeri Cuta-NpuN (N) e NpuC-S-Cuta (C) (Figura 1A, Tabella 1). NpuN / C sono i N-/C-fragments del DnaE naturalmente inteina suddivisa da Nostoc punctiforme (Npu). Cuta è una proteina trimeric stabile da Pyrococcus horikoshii 4,5. Miscelazione di purificato N e C in presenza dell&#39;agente riducente DTT induce la formaz...

Presentiamo la sintesi di un idrogel split-mediata da inteina proteina. Le componenti di questo idrogel sono due copolimeri proteine ​​contenenti ciascuno una subunità di una proteina trimeric che funge da reticolante e una metà di una inteina scissione. Miscelazione dei due copolimeri proteina innesca una reazione trans-splicing inteina, ottenendo una unità polipeptide che autoassembla in un idrogel. Questo idrogel è altamente pH e temperatura stabile, compatibile con solventi organici, e facilmente incorpora proteine ​​globulari funzionali.

Sintesi di una proteina artificiale mediata da inteina Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è sintetizzare un idrogel proteico altamente stabile che possa essere utilizzato come impalcatura generale per l'immobilizzazione di proteine. Questo risultato si ottiene innanzitutto sintetizzando due blocchi costitutivi dell'idrogel proteico in un ospite batterico. Ciascun blocco contiene una sottounità di una proteina chimerica che funge da agente di reticolazione e una metà del sistema NPU diviso ene.Queste proteine vengono quindi purificate mediante cromatografia ad affinità nel secondo passaggio. I blocchi proteici purificati vengono mescolati, avviando reazioni di splicing trans in cui si ricostituisce un polipeptide autocomplementare, affiancato da leganti incrociati che innescano la formazione di un idrogel. Questo idrogel è altamente stabile in soluzione grazie all'incorporazione di un opportuno motivo di legame nel blocco proteico.I copolimeri consentono l'incorporazione conveniente e specifica per sito di proteine funzionali nei blocchi costitutivi dell'idrogel, portando alla formazione di un idrogel che immobilizza le proteine; le proteine immobilizzate mostrano un basso tasso di rilascio per oltre tre settimane a temperatura ambiente. Infine, gli enzimi immobilizzati in questo idrogel proteico sono protetti dal denaturamento indotto dai solventi organici. Pertanto, questo idrogel può anche fungere da bioreattore per la sintesi organica.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per l'immobilizzazione stabile di proteine, inclusi quelli che prevedono l'incrocio sulla superficie di LI o il legame con impalcature solide, l'incapsulamento di enzimi in supporti porosi o l'incrocio interenzimatico, è la capacità di immobilizzare stabilmente le proteine bersaglio in un ambiente poroso e altamente idratato senza alcuna modifica chimica delle catene laterali della proteina. Questa tecnologia consente inoltre l'assemblaggio di più enzimi all'interno di un percorso metabolico in un'organizzazione tridimensionale predeterminata, che potrebbe facilitare il canale di substrato tra gli enzimi. Prima di iniziare questa procedura, generare i due copolimeri proteici N e C mediante costruzione di plasmidi attraverso tecnologie di DNA ricombinante, seguita dall'espressione proteica e da purificazione in REIA coli B 21 de tre a per purificare n risospendere i pellet cellulari nel buffer A a 10 millilitri per grammo di pellet umido.Quindi immergere la sospensione del pellet in un bagno di ghiaccio e acqua e rompere le cellule mediante sonificazione a 10 ampere con un impulso di un secondo e una pausa di sei secondi, per un minuto. Centrifugare il lisato a 6.000 ×g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il tubo dalla centrifuga, scartare il sopranatante S e risospendere il pellet nel buffer DA seguendo la centrifugazione usando le stesse condizioni di prima, facendo passare il sopranatante attraverso una colonna NTA da cinque millilitri precedentemente equilibrata con il buffer DA utilizzando un sistema di cromatografia a bassa pressione.Quindi lavare la colonna con 30 millilitri di tampone DA integrato con 45 millimoli di ole, eluire la proteina purificata utilizzando 20 millilitri di tampone DA integrato con 150 millimoli di ole. Trasferire la proteina purificata in una provetta per centrifuga contenente una colonna di filtrazione ultrafine da 30 kilodalton. Centrifugare il campione a 2.800 ×g e a 4 gradi Celsius fino a quando il volume risulti inferiore a un millilitro.Una volta terminato, aggiungere 14 millilitri di tampone DPBS alla colonna per diluire il campione proteico. Ripetere le fasi di centrifugazione e diluizione altre tre volte dopo lo scambio del tampone, quindi aggiungere DTT alla proteina purificata per ottenere una concentrazione finale di due millimolari. Successivamente, concentrare la proteina fino a circa 100 milligrammi per millilitro mediante centrifugazione attraverso una colonna da centrifuga per ultrafiltrazione da 30 kilodalton a 2.800 × g a quattro gradi Celsius per circa 45 minuti fino a un'ora.Per preparare una miscela di idrogel da 100 microlitri, aggiungere 42 microlitri di una soluzione madre di C da 100 milligrammi per millilitro con 10 microlitri di azoturo di sodio al 5%, cinque microlitri di DTT 100 millimolare e 42 microlitri di una soluzione madre di N da 100 milligrammi per millilitro. In un vial di vetro da due millilitri, aggiungere un microlitro di tampone DPBS al vial per ottenere un volume finale di 100 microlitri e mescolare manualmente tutti i componenti mediante un movimento rotatorio usando la punta di una pipetta. Dopo aver centrifugato la miscela per due minuti a 8.000 ×g, incubarla a temperatura ambiente per tutta la notte per permettere al completamento della reazione di trans-splicing ENE. Successivamente, confermare la formazione dell'idrogel capovolgendo il tubo per ottenere 50 microlitri di un idrogel funzionalizzato con GFP 1,2 millimolare.Combinare 17 microlitri di una soluzione madre contenente 100 milligrammi per millilitro di ligando CSH tre e 9 microlitri di una soluzione di SH 3G FP a 230 milligrammi per millilitro in rapporto molare uno a uno in un tubo da centrifuga da 1,7 millilitri, e incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, aggiungere 5 microlitri di azoturo di sodio al 5%, 2,5 microlitri di DTT 100 millimolare e 0,5 microlitri di DPBS nello stesso tubo. Quindi aggiungere 16 microlitri di N per ottenere un rapporto molare uno a uno tra N e il ligando CSH tre e mescolare il campione mediante un movimento rotatorio usando la punta di una pipetta; centrifugare la miscela a 8.000 ×g per due minuti.Al termine, incubare la miscela a temperatura ambiente durante la notte al buio per formare un idrogel ed encapsulare la SH 3G FP. Per un'applicazione aggiuntiva, preparare una soluzione madre di perossidasi di rafano (HRP) 0,63 millimolare in DPBS per ottenere 30 microlitri di un idrogel 1,6 millimolare e intrappolare l'HRP; combinare 12 microlitri di una soluzione madre di C 100 milligrammi per millilitro con due microlitri di HRP, tre microlitri di azide di sodio al 5% e 0,5 microlitri di DTT 300 millimolare in un tubo da centrifuga da 1,7 millilitri. Aggiungere 12 microlitri di una soluzione di N 100 milligrammi per millilitro e 0,5 microlitri di DPBS e mescolare la soluzione mediante un movimento rotatorio usando una punta IPE. Dopo aver centrifugato la miscela a 8.000 ×g per due minuti, incubarla a temperatura ambiente durante la notte.Per la reazione enzimatica, immergere l'idrogel in un millilitro di un cocktail di reazione contenente 5,8 millimolari di fenilendiammina NN dimetil PPH, 5,8 millimolari di fenolo e 2,9 millimolari di idroperossido di t-butilo in n-eptano; interrompere manualmente il gel utilizzando la punta di una pipetta per aumentare la superficie di contatto tra l'idrogel e il solvente. Rilevare il prodotto della HRP e il colorante di tipo indofenolo prelevando campioni del solvente a diversi intervalli di tempo e misurando l'assorbanza ottica a 546 nanometri in un lettore di piastre. La miscelazione di N e C purificati in presenza dell'agente riducente DTT induce la formazione di una terza proteina, il prodotto legato J, individualmente. I costituenti dell'idrogel n NC esistono come fluidi viscosi; la miscelazione di n NC produce un materiale semisolido trasparente che rimane sul fondo di una provetta di vetro dopo l'inversione, indicativo della formazione di un idrogel.Questo idrogel proteico mediato dall'ene presenta un'elevata stabilità in soluzione. Dopo 21 giorni a 22 gradi Celsius in tampone DPBS, si osserva una perdita minima o nulla dello scaffold idrogelico reticolato. Poiché la quantità totale di proteina rilasciata nel tampone DPBS supera solo leggermente la quantità teorica dell'ene scisso dall'idrogel, la citometria densa ha rivelato che durante la formazione dell'idrogel le reazioni di splicing trans erano circa all'80% efficienti.L'analisi del gel SDS-PAGE ha mostrato che solo tracce del prodotto trans-splicing erano presenti nel tampone circostante l'idrogel, confermando che la perdita dello scaffold idrogelico reticolato a causa dell'erosione è minima. La principale proteina presente nel tampone circostante l'idrogel è l'intein scisso.Non sono stati osservati segni visibili di erosione in un idrogel non disturbato, immerso in soluzione acquosa a temperatura ambiente per oltre tre mesi. L'idrogel è inoltre altamente stabile a 37 gradi Celsius e in tamponi sia acidi che basici. Per facilitare l'immobilizzazione delle proteine, una proteina e il suo ligando peptidico sono stati utilizzati per ancorare le proteine di interesse all'interno della matrice dell'idrogel.Abbiamo scelto la proteina SH3, un dominio di omologia SAR3 proveniente dalla proteina adattatrice CRK, come proteina di ancoraggio per la fusione a una proteina di interesse, e il suo ligando come peptide di stazione di ancoraggio per l'inserimento nello scaffold idrogel. Questa coppia di interazione è stata scelta a causa delle ridotte dimensioni molecolari e dell'elevata affinità. Il ligando SH3 è stato inserito tra NPUC e CutA per formare CSH3 ligando.La proteina S SH tre è stata fusa al terminale C di una proteina globulare modello, la GFP. Il processo descritto nel protocollo produce un idrogel contenente 1,2 millimolare di blocchi costitutivi del reticolo idrogelificato con splicing trans e 1,2 millimolare di GFP. L'idrogel contenente la GFP ha mostrato una stabilità simile a quella dell'idrogel privo di GFP, con una perdita totale di proteine pari a circa il 35% dopo 21 giorni.Nel tampone DPBS, la maggior parte delle proteine presenti nel tampone di erosione era costituita dai frammenti tagliati negli anni dieci. Il rilascio di SH 3G FP da un idrogel contenente il ligando S SH tre è di circa il 30% dopo tre settimane, significativamente inferiore rispetto a quello da un idrogel privo del ligando s sh tre, come mostrato qui nell'idrogel contenente il peptide della stazione di aggancio. Il ligando S SH tre mantiene la maggior parte della fluorescenza GFP.Dopo tre settimane, mentre l'idrogel privo del ligando SSH diventa essenzialmente non fluorescente. La densità di GFP immobilizzata in questo studio è circa il 33 percento molare dell'idrogel. Una densità di immobilizzazione più elevata potrebbe potenzialmente essere raggiunta quando più peptidi di stazionamento vengono incorporati nel blocco costitutivo dell'idrogel.Successivamente, l'enzima HRP è stato incorporato nell'idrogel proteico per dimostrare la sua capacità di sostenere biocatalizzatori in solventi organici. L'attività enzimatica è stata misurata monitorando nel tempo la coppia ossidativa di NN dimetil pph, diammina lenene e fenolo con idroperossido di turtile. L'ipotesi era che l'ambiente idratato dell'idrogel avrebbe protetto l'enzima legato dagli effetti denaturanti del solvente organico.Dopo l'immersione in un solvente organico, l'idrogel contenente la perossidasi di rafano (HRP) è stato frammentato manualmente in piccoli aggregati per aumentare l'area dell'interfaccia idrofila-idrofobica. L'HRP incorporata nell'idrogel ha catalizzato efficacemente la rapida reazione di ossidazione, producendo un composto colorimetrico. L'accumulo del prodotto segue un andamento lineare, indicando una minima o nulla inattivazione enzimatica.Durante l'esperimento, la HRP disciolta in A-D-P-B-S e successivamente aggiunta al solvente organico è stata in grado di catalizzare la conversione, ma con una velocità di reazione notevolmente ridotta. L'elevata riduzione della velocità di conversione degli enzimi disciolti nel DPBS è probabilmente dovuta alla piccola area interfaciale tra il DPBS e il solvente organico, che limita la velocità di diffusione del substrato e del prodotto. L'introduzione del frammento s fortemente idrofilo all'interno della struttura del gel, che intrappola efficacemente l'acqua all'interno del gel e impedisce al solvente organico di penetrare nell'interno del gel, consente al gel di resistere all'effetto denaturante del solvente organico.Questi risultati indicano che l'idrogel proteico mediato dall'ene può rappresentare un'efficace matrice per reazioni enzimatiche in solvente organico. La flessibilità strutturale e l'elevata stabilità di questo idrogel autoassemblante ne consentono l'utilizzo non solo nella proteina e nella mobilizzazione, ma anche in altre applicazioni, tra cui celle a combustibile biologiche, sistemi di somministrazione di farmaci iniettabili e matrici per l'ingegneria tissutale.

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