Name: Produzione efficiente e purificazione di ricombinante murino kindlina-3 da cellule di insetto per Biofisica Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: Scopri come produrre e purificare la kindlina-3 ricombinante da cellule di insetto con baculovirus per studi biofisici. Questo metodo aumenta la resa proteica di dieci volte rispetto ai sistemi batterici.

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Ringraziamo Weixan Lu per l&#39;assistenza tecnica nella cultura e nella manutenzione degli stock cellulari Sf9. LAY stato supportato da una Medical Research Council (MRC), laureato borsa di studio. RJCG era una Royal Society University Research Fellow. La Divisione Oxford di Biologia Strutturale è parte del Wellcome Trust Centre for Human Genetics, Wellcome Trust Nucleo concessione di una sovvenzione Numero 090532/Z/09/Z.

Questo protocollo presuppone che il mouse kindlina-3 gene (FERMT3) è stato clonato con successo in un vettore a valle del promotore molto tardi p10 e che il vettore possiede sequenze fiancheggianti baculovirus consentire ricombinazione con il bacmid BAC10 KO: 1629 sviluppato da IM Jones e colleghi 28. Per questo protocollo, il kindlina-3 gene è stato clonato in pOPINE 29 e gli inneschi e la strategia di clonazione utilizzati possono essere trovate descritto altrove 12. Il plasmide è stato progettato in modo che il gene FERMT3 (kindlina-3) è sotto il controllo del promotore p10 baculovirali e il vettore contiene 5 &#39;UTR/ORF603 e ORF il 1629 e codifica una C-terminale suo 6-tag per la purificazione a valle 29. 1. Coltura cellulare insetti e manutenzione <ol><li> Prima di baculovirus ricombinante amplificazione, cellule di Spodoptera frugiperda atto a coltura in sospensione (cellule Sf9) dovrebberoessere coltivate e mantenute. Cellule di insetto devono essere trattati con tecniche asettiche in un tessuto culturale cappa dedicato. </li><li> Colture in sospensione di cellule di insetto sono incubati in Sf-900 II (SFM) siero mezzo liquido libero supplementato con penicillina 100 pg / ml e 100 pg / ml di streptomicina in beute a 27 ° C con agitazione a 100 rpm. </li><li> Mantenere la gamma di densità di coltura cellulare di insetto tra 1 x 10 6 - 1 x 10 7 cellule / ml di scissione e diluendo la coltura cellulare con fresche Sf-900 II media. Nota: sano celle devono guardare dimensioni uniformi e devono essere di forma sferica. </li><li> Contare le cellule in un volume di campione con un emocitometro e microscopio ottico per calcolare la densità cellulare cultura. </li></ol> 2. Generazione di ricombinante Baculovirus <ol><li> Cultura e mantenere le cellule Sf9 in sospensione utilizzando Sf-900 II multimediale integrato con 100 pg / ml penicillin e 100 pg / ml streptomicina. Per la generazione baculovirus, cellule di insetto dovrebbero essere coltivati ​​per una gamma di densità di 5 x 10 5 - 1 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Seme di circa 1 x 10 6 cellule Sf9 per pozzetto di un tessuto 6 pozzetti piastra di coltura sterile in 2 ml di Sf-900 II supporto integrato con penicillina 100 pg / ml e 100 pg / ml streptomicina. Lasciare le cellule Sf9 a temperatura ambiente sotto cappa di aderire alla base dei pozzetti di plastica e quindi formare un monostrato. </li><li> Eseguire ricombinante generazione baculovirus da cotransfecting bacmid DNA e DNA plasmidico sulla cultura monostrato. <ol><li> Per ogni trasfezione, mescolare 1-2 mg di purificato pOPINE-mFERMT3, che possiede le ORF1629 elementi baculovirus, con 0,5 mg di purificato BAC10 KO: 1629 in 100 ml di Sf-900 II SFM senza antibiotici (soluzione A). </li><li> In un tubo separato, diluire 6 ml di Cellfectin II reagente con 100 ml di Sf-900 II SFM senza lottaantibiotici per ciascuna reazione trasfezione (Soluzione B). A &#39;master mix&#39; può essere creato qui, per la manipolazione dei liquidi ridotta, se sono necessarie molte transfezioni. </li><li> Mescolare le due soluzioni (A e B, di circa 200 microlitri) e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per formare un complesso lipide-DNA. </li><li> Diluire i complessi lipide-DNA con 800 microlitri Sf-900 II SFM senza antibiotici. Con attenzione aspirare i media monostrato cellulare Sf9 e pipetta con attenzione la soluzione A / B e dei media sulla parte superiore del monostrato Sf9. </li><li> Incubare le cellule trasfettate in un incubatore umidificato a 27 ° CO / N e aggiungere altre 1 ml di Sf-900 II SFM senza antibiotici ad ogni coltura monostrato il giorno seguente. Incubare le cellule a 27 ° C per altri 5 giorni. </li></ol></li><li> Raccogliere il baculovirus ricombinante direttamente dal terreno di coltura (circa 2 ml in totale) e trasferire in una provetta da centrifuga pulita (ad esempio un tubo Falcon 15 ml). <ol><li> Chiarire qualsiasi debr cella Sf9è per centrifugazione a 1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Trasferire il virus, che è nel supernatante risultante e denotato P1, in una provetta pulita e conservare a 4 ° C al buio fino al momento dell&#39;uso. In questa fase il restante monostrato Sf9 può essere utilizzato per valutare generazione virus ricombinante per valutare la presenza di ricombinante kindlina-3 nelle cellule di insetto. </li></ol></li><li> Risospendere il monostrato con 0,5 ml di PBS e diluire un campione di 10 ml con volumi uguali di 2x tampone SDS-PAGE carico. Riscaldare i campioni a&gt; 95 ° C per almeno 10 min. <ol><li> Sonicare il campione per 1 sec al 10% di ampiezza con una punta di micro-sonicator se è troppo viscoso per il corretto caricamento del gel. </li></ol></li></ol> 3. Amplificazione del ricombinante Baculovirus <ol><li> Per l&#39;amplificazione del virus in sospensione, utilizzare una densità cellulare di 1,4 x 10 6 cellule / ml e questo dovrebbe occupare a 1/20 del volume totale pallone (cioè 50 ml in culturaun pallone da 2 L). </li><li> Conseguire l&#39;amplificazione del virus ricombinante infettando la coltura cellulare di insetto con lo stock virale P1 ad una molteplicità di infezione (MOI) di 0,1 utilizzando la seguente formula; <img alt="" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51206/51206eq1.jpg" width="400" /> Nota: generazione di virus P1 può presumere di avere un titolo virale previsto di 1 x 10 7 pfu / ml. Tuttavia, un saggio di placca può essere eseguito prima di questa fase. </li><li> Incubare la cultura P1 insetto infettate a 27 ° C con agitazione a 100 rpm per 3 giorni (72 ore). </li><li> Raccogliere il virus separando le cellule dal supporto mediante centrifugazione a 1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Salvare il pellet cellulare risultante in questa fase per la conferma della produzione di virus ricombinante valutando kindlina-3 espressione proteica mediante SDS-PAGE e western blotting. </li><li> Trasferire i mezzi di virus arricchita chiarito in una provetta pulita e conservare a 4 ° C inbuio fino al momento dell&#39;uso. Questo stock virale è indicata come P2. Nota: Un titolo virale di 2 x 10 8 pfu / ml (o un tasso di amplificazione di 100 pfu / cell) può essere previsto. </li></ol> 4. Espressione di kindlina-3 in Baculovirus-Infected Sf9 <ol><li> Crescere un volume adeguato di cellule Sf9 colture in sospensione in Sf-900 II SFM supplementato con 100 pg / ml di penicillina e 100 pg / ml streptomicina, prima larga scala ricombinante kindlina-3 espressione per la purificazione. Incubare le colture in sospensione a 27 ° C con agitazione a 100 rpm e con un volume totale cultura: pallone rapporto in volume di 1:5. </li><li> Infect colture in sospensione di Sf9 ad una densità di 2 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Supplemento culture Sf9 con una concentrazione finale di 1% (v / v) di siero fetale bovino (FBS) seguita da virus ricombinante amplificato (P2-virale magazzino) invia un MOI di 1. Incubare le colture infettate a 27 ° C con agitazione a 100 rpm. </li><li> Harvest ricombinazionent kindlina-3-6-CHIS cellule esprimenti Sf9 72 ore dopo l&#39;infezione mediante centrifugazione a 1000 xg &#160; e il pellet cellulare risultante conservato a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso, o -80 ° C per una conservazione a lungo termine. </li></ol> 5. Purificazione di ricombinante kindlina-3 <ol><li> Scongelare congelati cellule di insetto baculovirus infettate (Sf9) Pellets esprimono ricombinante kindlina-3 sul ghiaccio. </li><li> Risospendere il pellet cellulare scongelato con tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 500 mM, 1% (v / v) Tween-20), supplementato con libero-EDTA cocktail inibitore di proteasi e 1.000-2.000 U di DNase1. Nota: In alternativa, tampone fosfato modificato (PBS) può anche essere utilizzato, dove la concentrazione di NaCl viene regolata a 500 mM per evitare interazioni aspecifiche tra endogeni proteine ​​cellulari Sf9 e la colonna di affinità metallo immobilizzato utilizzato per la purificazione a valle (vedi sotto). </li><li> Lisare le cellule incubando le cellule risospese con il detersivo e vortexing. Sonicare (40% di ampiezza, 10 cicli di 10 sec impulsi seguita da raffreddamento 10 sec) il campione per ulteriore distruzione cellulare in un bagno di ghiaccio o in alternativa utilizzare un omogeneizzatore Dounce. </li><li> Chiarire il lisato tramite centrifugazione a 48,000 xg per 1 ora a 4 ° C. Caricare il supernatante risultante su una colonna HisTrap (5 ml volume della colonna), pre-equilibrata con tampone di lisi, a 4 ° C ad una velocità di 1 ml / min. Nota: In alternativa, il lisato chiarificato può essere incubato con un 1-5 ml volume del letto di pre-equilibrata sefarosio perline di nichel (Ni es Sepharose 6 Fast Flow) a 4 ° C per 1-2 ore. Una colonna di Ni sefarosio può essere formato dopo la fase di legame utilizzando una colonna a gravità. </li><li> Lavare la colonna con 10 volumi di colonna di tampone di lavaggio (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazolo 10 mM) per rimuovere il materiale non legato. </li><li> Utilizzare un gradiente di imidazolo lineare 10-500 mm ad una velocità di 10 mm / ml (o in 10 volumi di colonna) utilizzando un ÄKTA FPLC eluirela kindlina-3-CHIS ricombinante legato 6. </li><li> Frazionare l&#39;eluizione in 0,5-1 ml frazioni utilizzando la ÄKTA FPLC, con le frazioni contenenti kindlina-3-6 CHIS solito eluizione ad una concentrazione di 300 mM imidazolo. </li><li> Valutare la composizione proteica dell&#39;eluente mediante SDS-PAGE e purificazioni per la prima volta confermare mediante Western blotting utilizzando un anti-His 6 o anticorpo anti-topo kindlina 3-anticorpo. </li><li> Si riuniscono le frazioni contenenti kindlina-3 e buffer di scambio in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM tramite una serie di diluizioni in tampone e concentrazioni del campione utilizzando una proteina concentratore centrifugo con un peso molecolare di 50 kDa cut-off (MWCO) a 4 ° C. Nota: In alternativa, Dializzare soluzione proteica utilizzando Slide-A-lizzatore dialisi cassette con un MWCO di 30 kDa a 4 ° C per 4 ore a O / N in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM. Nota: per scambio ionico (vedi sotto) una minore concentrazione di NaCl, <em&gt; ie 50 mM, può essere ed è stato utilizzato per questo passo. </li><li> Applicare la soluzione tampone proteina a scambio su una colonna HiTrap eparina HP pre-equilibrata (5 volumi colonna ml) usando un ÄKTA FPLC ad una velocità di 0,5 ml / min. Nota: Il kindlina-3 legato viene eluito con un gradiente lineare di NaCl (0,2 M NaCl 1 M NaCl) nello stesso tampone, aumentando a una velocità di 10 mm / ml. Kindlina-3-CHIS6 dovrebbe eluire a ~ 0,6 M NaCl. </li><li> Frazionare l&#39;eluizione in 0,5-1 ml frazioni e valutare la composizione delle proteine ​​mediante SDS-PAGE e western blotting, se del caso. Nota: ci si può aspettare una purezza della proteina di quasi il 95%, come valutato mediante SDS-PAGE. </li><li> Frazioni piscina contenente kindlina-3 e concentrare utilizzando un concentratore proteina centrifuga con una kDa MWCO 50 ad un volume finale di 0,5-2 ml. </li><li> Nella fase finale, lucidare il proteica concentrata e buffer scambiare la proteina mediante cromatografia di esclusione dimensionale (SEC). <ol><li> Applicare la proteina purificata su un Superdex S200 (16/60) o (10/30) pre-equilibrata in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM, DTT 1 mM ad una velocità di 1 ml / min o 0,5 ml / min a seconda delle dimensioni della colonna utilizzato. Nota: cromatografia di esclusione dimensionale può essere eseguita anche in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), se necessario. </li><li> Purificare le proteine ​​secondo la dimensione del buffer applicando sulla colonna ad una velocità di 1 ml / min o 0,5 ml / min, a seconda delle dimensioni della colonna utilizzata. Nota: La proteina eluizione dalla colonna è frazionato e monitorata usando l&#39;assorbanza a 280 nm. </li><li> Un singolo picco di assorbanza deve essere previsto dal SEC, che è frazionato e valutata mediante SDS-PAGE per determinare omogeneità, ed è tipicamente&gt; 95% puro dopo questo passaggio. </li></ol></li><li> Concentrare il purificato kindlina-3-CHIS 6 usando un concentratore proteina centrifuga con una kDa MWCO 50 a ~ 15 mg / ml, valutata spettrofotometricamente utilizzando un coefficiente di estinzione calcolato (ε) di 109.320 M -1 cm -1 &lt;/ Sup&gt; (supponendo che tutti i residui di cisteina sono ridotti). </li><li> Per la conservazione a -20 ° C e conservare a lungo a -80 ° C, la proteina aliquota in provette per PCR e flash congelare i campioni in azoto liquido. In alternativa, la proteina può essere utilizzato direttamente per indagini utilizzando un numero di tecniche biochimiche e biofisiche. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Sistemi di espressione baculovirus stanno diventando sempre più popolare e uno strumento importante per la produzione di quantità milligrammo di proteina ricombinante per la caratterizzazione di proteine ​​mediante studi biofisici, tra cui cristallografia a raggi X. Pur essendo più esigenti sperimentalmente i sistemi di espressione baculovirus offrono diversi vantaggi rispetto E. coli uno dei quali è un ambiente quasi nativa per le proteine ​​di origine eucariotica esempio la presenza di accompagnatori e opportunità per modificazione post-traduzionale appropriate. Nei nostri sforzi per esprimere kindlina-3, padroni di espressione alternativi sono stati usati tra cui linee cellulari di mammifero e ceppi batterici di espressione (osservazioni non pubblicate). Generalmente, il numero E. coli ceppi testati prodotte piccole quantità di ricombinante kindlina-3 (~ 0,5 mg / L di cultura, osservazioni non pubblicate). Tuttavia, l&#39;espressione baculovirus-driven in cellule di insetto è stato particolarmente efficace e, in comparison di espressione transiente in cellule di mammifero, più suscettibili di generare la grande biomassa necessaria per isolare una milligrammi di proteine ​​ricombinanti citoplasmatici (osservazioni non pubblicate). Noi ipotizziamo che la presenza accompagnatori eucariotiche possono consentire la produzione efficiente di kindlina-3. Le Baculoviridae infettare cellule di insetto e per l&#39;espressione della proteina ricombinante baculovirus utilizzato in questo lavoro è basata sul Autographa californica virus della poliedrosi nucleare (AcNPV). In natura il AcNPV, che infetta il Autographa californica (erba medica lopper) larve di insetti, richiede la proteina poliedrina per formare occlusioni cui i virons sono incapsulati in una matrice proteica cristallina fornendo così la protezione necessaria per il loro rilascio. In cellule in coltura non è necessaria la formazione di organi di occlusione per la replica ed è quindi superfluo. Nel caso di esprimere proteine ​​estranee gene della proteina poliedrina può essere replaced in un AcNPV ricombinante con il gene per la proteina di interesse. AcNPV può infettare altre specie di lepidottero e ai fini della proteina ricombinante espressione esercito verme Spodoptera frugiperda vengono utilizzati cellule ovariche di pupa. Nell&#39;approccio qui delineato, il bacmid AcNPV (BAC10) è progettato in modo che un gene virale essenziale, ORF1629, è inattivata mediante l&#39;inserimento di cloramfenicolo acetil transferasi conseguente bacmid knock-out (BAC10: KO 1629), tale che sia incapace di formare baculovirions infettive 28. Cotrasfezione di cellule Sf9 con BAC10 linearizzato: KO il 1629 e il FERMT3 contenenti trasferimento vettoriali ripara il ORF1629 inattive, attraverso il recepimento, risultando in un genoma vitale che ha anche incorporato il gene FERMT3 sotto il controllo del promotore poliedrina 28. Descriviamo un protocollo di purificazione per l&#39;isolamento di elevata purezza topo ricombinante kindlina-3 tramite un three passo approccio cromatografico. I metodi utilizzati qui possono essere facilmente applicati ad altre proteine ​​His-tagged. Abbiamo impiegato un passo scambio ionico per purificare ulteriormente kindlina-3 ma riteniamo che questo è un ulteriore passo pseudo-affinità come kindlina-3 presenta un gran numero di residui basici, compreso un tratto di poli-lisina nel suo dominio F1. Inoltre, è considerato kindlina-3 di legarsi e interagire con la faccia citoplasmatica della membrana plasmatica, dove funziona, e quindi si prevede che il raggruppamento di residui di base consentirà la proteina per contrastare la membrana carica negativa. I buffer descritti nei protocolli di purificazione sono considerati standard e sono spesso utilizzati in biologia strutturale. Il saggio thermofluor (Figura 5) dimostra che kindlina-3 è stabile in condizioni di eccessiva suddetto tampone pH 6.0. Questo è stato particolarmente utile e importante per informare i nostri esperimenti nello studio kinldin-3: β1Una interazione coda mediante NMR, che ha dato ottimi spettri a pH 6.1 con basse concentrazioni di NaCl 12. Prima di ogni studio biofisico può essere intrapreso, è importante dimostrare che la proteina purificata di interesse è infatti piegata correttamente ed è funzionalmente attiva. In una precedente pubblicazione abbiamo dimostrato che la kindlina-3 ricombinante espressa e purificata con questo metodo è stato un monomero e monodisperso in soluzione, come valutato mediante cromatografia dimensione esclusione, dispersione della luce dinamica, ultracentrifugazione analitica e piccolo X-ray scattering angolo, ed era anche in grado di legare e riconoscere il NPxY membrana-distale e monte serina / treonina grappolo di β 1A code citoplasmatiche 14, confermando così che si comporta come proteina nativa, che è in linea con precedenti studi cellulari e fisiologici 14,20,22. L&#39;uso di un saggio di stabilità termica è un ulteriore modo di suggerire the corretto ripiegamento di una proteina di interesse, come proteina correttamente ripiegata si tradurrà in un fondo elevato fluorescenza a causa di residui idrofobici esposti. La famiglia kindlina delle proteine ​​è stato al centro di molta attenzione in quanto il loro ruolo inatteso come coactivators essenziali di integrine in vivo è stato scoperto. Questo ha innescato molto sforzo per esprimere loro ricombinante e risolvere le loro strutture. Fino ad oggi un successo limitato è stata riportata ad esprimere quantità milligrammi di piena lunghezza proteina ricombinante ma abbiamo qui descritto l&#39;uso di un sistema di baculovirus che permette l&#39;espressione larga scala a livelli dove studi strutturali diventano fattibili. Generando grandi quantità di ricombinante kindlina-3 possiamo anticipare che questo sarà di aiuto ulteriori studi su questa proteina. Il metodo e la purificazione workflow baculovirus-driven qui descritta per ricombinante murino kindlina-3 potrebbe anche essere usato per esprimere e purificare le altre isoforme kindlina, Che sono anche difficili da esprimere e anche possedere tratti poli-lisina, e può essere ulteriormente adattato per altre proteine ​​citoplasmatiche, quali le proteine ​​di legame di acido nucleico, che non riescono ad esprimere in ceppi batterici.

Le proteine ​​della famiglia kindlina sono una componente fondamentale di montaggio adesione focale, e quindi essenziale per la vita complessa. Kindlins, di cui ci sono tre isoforme di mammiferi (kindlina-1, kindlina-2, e kindlina-3), sono considerati coactivators dei recettori extracellulari integrine accanto Talin 1. Integrina-mediata adesione cellulare collega la superficie cellulare alla matrice extracellulare (ECM) in eucarioti superiori. Si tratta di un processo critico e comune in una pletora di fenomeni fisiologici, che includono l&#39;integrità dei tessuti, embriogenesi, metabolismo osseo, emostasi, e l&#39;immunità. Integrin mediata adesione cellulare si attiva tramite inside-out trasduzione del segnale tramite il legame di Talin e kindlina le integrine β-subunità code citoplasmatici (TA) presso i loro motivi NPxY conservati. L&#39;importanza biomedica di proteine ​​kindlina estende tuttavia fino al nucleo, dove kindlina-2 è stato dimostrato in diversi rapporti recenti per essere coinvolti nella trascrizioneal controllo 2,3. Kindlins sono proteine ​​multidominio di circa 75 kDa, caratterizza per il possesso di un FERM bipartito C-terminale (4.1 band, ezrina, radixina, moesina) del dominio, che viene interrotto da una omologia pleckstrin (PH) dominio al centro del suo sottodominio F2 4,5. Gli studi dei domini kindlina-2 e kindlina-3 PH hanno dimostrato che si lega al secondi messaggeri lipidici fosfatidilinositolo-(3,4,5)-trifosfato e fosfatidilinositolo-(4,5)-bisfosfato 6-8. Tuttavia, studi del dominio kindlina-1 PH mostrano che si lega a PtdIns (3,4,5) P 3 con un&#39;affinità molto inferiore, che può essere spiegato in kindlina-1 da un ponte salino specifico isoforma impedendo lipidi di legarsi 9. Inoltre, vi è un loop ~ 100 aminoacidi inserito nel dominio F1 dei kindlins che è previsto per essere spiegato ma si lega alla fosfatidilserina nel foglietto interno della membrana plasmatica 10,11. Il FERM kindlinadominio è considerata omologa al dominio FERM Talin, sebbene il dominio FERM Talin non possiede un dominio pleckstrin omologia. Entrambi kindlins e talin interagiscono con motivi NPxY sulle integrine β-code attraverso la regione F3 del loro dominio FERM, ma kindlina si lega alla membrana motivo distale, mentre talin rivolge prossimale membrana quella 12-16. Kindlins e talin sia in aggiunta possiedono un dominio F0 N-terminale con una piega ubiquitina-simile che non si trova in altre proteine ​​FERM 11,17. Studi sul dominio F0 di kindlina-2 hanno dimostrato che si lega in modo indipendente per fosfatidilinositolo-(4,5)-bisfosfato membrane arricchite 17. I kindlins presentano pattern di espressione dei tessuti specifici paralogo-e le funzioni fisiologiche non ridondanti. Kindlina-1 è espresso principalmente nell&#39;epidermide, ma anche in misura minore i colon, stomaco e reni; kindlina-2 è espresso ubiquitariamente ma è concentrata in striato e lisciomuscolare ed è l&#39;unico kindlina espressa nello sviluppo embrionale 4 e kindlina-3 è espresso nei tessuti ematopoietici con la più alta concentrazione di kindlina-3 trovati nei megacariociti 18. Tuttavia, studi più recenti hanno suggerito che la proteina funzionale è espressa in tessuti endoteliali e 19. Kindlina-3 è di interesse medico acuta dovuta al suo importante ruolo fisiologico nel sangue. E &#39;fondamentale per l&#39;aggregazione piastrinica e la diffusione durante la formazione di trombi 20, leucociti laminazione in risposta alle infezioni e infiammazioni 21,22 e la formazione di osteoclasti podocita nel riassorbimento osseo 23. Inoltre, l&#39;esaurimento delle kindlina-3 in esseri umani porta a deficit di adesione leucocitaria di tipo III - una malattia caratterizzata da disturbi emorragici potenzialmente letali e infezioni batteriche ricorrenti 20,24,25. Kindlina-3 studi knock-out nei topi hanno mostrato la funzione essenziale della proteina inl&#39;adesione cellulare KIND3 -. / - mice visualizzare fenotipi distinti, come sanguinamento grave a causa di integrine inattivi piastrine, grave osteopetrosi, e alterata adesione dei leucociti 20,22, simile a sintomi nell&#39;uomo manca kindlina-3. Dati strutturali ad alta risoluzione sui kindlins, ad oggi, è stato limitato a sottodomini individuali come l&#39;omologia pleckstrin (PH) dominio del kindlina-1 9 e kindlina-2 26,27 e il dominio F0 di kindlina-1 11 e kindlina -2 17. La maggior parte dei sottodomini di ogni polipeptide kindlina hanno comunque resistito clonazione e analisi strutturale (Yates e Gilbert, osservazioni non pubblicate), e gli studi delle proteine ​​full-length sono stati ostacolati dalla difficoltà di esprimere e purificante quantità sufficienti con E. coli (osservazioni non pubblicate e Harburger et al. 14). C&#39;è un notevole interesse medico in kindlina-3 e la sua function, accanto agli altri due membri della famiglia, e di recente abbiamo generato quantità milligrammi di esso mediante espressione ricombinante in cellule di Spodoptera frugiperda guidati da infezione baculovirus 12. Abbiamo quindi qui descrivere i metodi per la produzione di quantità milligrammo di topo ricombinante kindlina-3 in coltura cellulare di insetto, adatto per lunghi studi strutturali e analisi biochimica. In questo protocollo ci avvaliamo di un bacmid knockout allestita (BAC10 KO: 1629) cioè, da solo, in grado di produrre virioni vitali 28. Il DNA virale viene quindi salvato da ricombinazione con un vettore di trasferimento che in questo caso comprende anche la kindlina-3 gene (FERMT3) e risultati nel gene FERMT3 sostituendo il virus molto tardi gene, che è altamente espressa ma ridondante, risultando in un ricombinante virus che esprime topo kindlina-3 come parte del ciclo vitale del virus 28. Abbiamo identificato questaProcedimento per la produzione di kindlina-3 dopo i tentativi di esprimere e purificare in altri host di espressione dimostrato proibitivo (osservazioni non pubblicate), ma anche grazie alla versatilità della suite vettore Popin, che abbiamo usato per la clonazione e che possono distribuito in molti espressione ospita 29.

<table><tbody><tr><td>Sf-900 II terreno privo di siero (SFM) 1x liquido</td><td>Life Technologies</td><td>10902-096</td><td>conservare a 4 ° deg; C e riscaldare a RT prima dell'uso</td></tr><tr><td>Reagente Cellfectin II</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>In alternativa, è possibile utilizzare il reagente di trasfezione GeneJuice (EMD)</td></tr><tr><td>Solfato di streptomicina (solido)</td><td>Melford</td><td>S0148</td><td>Filtro sterilizzante (0,22 &mu; m filtro) prima dell'uso</td></tr><tr><td>Penicillina G, sale di potassio (solido)</td><td>Melford</td><td>P0580</td><td>Sterilizzare il filtro (0,22 &mu; prima dell'uso</td></tr><tr><td>CELLSTAR Piastra di coltura sterile a 6 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10100-147</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi Sigma</td><td></td><td>P8849</td><td>Attenzione: gli inibitori della proteasi sono disciolti nel DMSO</td></tr><tr><td>Desossiribonucleasi pancreatica bovina (Dnase)</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap FF (5 ml)</td><td>GE Heathcare</td><td>17-5286-01</td><td>Richiede un &Auml; kta FPLC macchina</td></tr><tr><td>HiTrap Eparina (5 ml)</td><td>GE Heathcare</td><td>17-0407-01</td><td>Richiede un &Auml; Macchina FPLC kta</td></tr><tr><td>Unità filtranti centrifughe Amicon Ultra-15 (con membrana Ultracel-50)</td><td>Millipore</td><td>UFC905024</td><td>capacità di 15 ml e un MWCO di 50 kDa concentratore di proteine</td></tr></tbody></table>

produzione efficiente e purificazione di ricombinante murino kindlina-3 da cellule di insetto per biofisica studies

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins coattivatori sono essenziali, con talin, dei recettori di superficie cellulare integrine e anche partecipare integrina outside-in di segnalazione, e il controllo della trascrizione genica nel nucleo della cellula. I kindlins sono ~ 75 kDa proteine ​​multidominio e si legano ad un motivo NPxY e monte T / S grappolo della integrina β-subunità coda citoplasmatica. Il hematopoietically importante isoforma kindlina, kindlina-3, è fondamentale per l&#39;aggregazione piastrinica durante la formazione di trombi, leucociti a rotazione in risposta alle infezioni e l&#39;infiammazione e la formazione di osteoclasti podocita nel riassorbimento osseo. Il ruolo di kindlina-3 in questi processi ha portato in ampi studi cellulari e fisiologici. Tuttavia, vi è la necessità di un metodo efficace di acquisire quantitativi milligrammi di alta qualità della proteina per ulteriori studi. Abbiamo sviluppato un protocollo, qui descritto, per l&#39;espressione efficiente e purificazione di ricombinante kindlina-3 murina mediante uso di un baculovirus-driven sistema di espressione in cellule Sf9 cedendo una quantità sufficiente di elevata purezza proteina intera per consentire la sua caratterizzazione biofisica. Lo stesso approccio potrebbe essere presa nello studio delle altre isoforme kindlina mammiferi.

L&#39;espressione larga scala di topo ricombinante kindlina-3 utilizzando cellule Sf9 baculovirus-infette può richiedere meno di due settimane per ottenere quantità milligrammo, come illustrato nello schema Figura 1A e richiede soltanto una piccola quantità di DNA plasmidico da un kit QIAprep Miniprep, per esempio. La generazione di baculovirus ricombinante si ottiene cotransfecting cellule Sf9 con il mouse kindlina-3 (FERMT3) contenenti plasmide con un bacmid linearizzato ingegnerizzato (BAC10: KO 1629) e raccogliendo i virioni neoformati dopo 5-7 giorni, come mostrato nella Figura 1A. Questo metodo di generazione baculovirus risultati in 100% virus ricombinanti e sostanzialmente eroga la necessità di purificazione di placca 28,30. Una cultura rappresentante piccola scala (2 ml monostrato) genererà una soluzione contenente il virus ricombinante con un titolo virale previsto di unità formanti 1 x 10 7 placca (pfu) per ml dicultura. Si può eseguire un saggio di placca per determinare il titolo virale reale, ma questo è forse troppo alta intensità di manodopera, quando un elevato numero di costrutti sono testati per studi strutturali. Il successo della fase di generazione di virus può essere valutato utilizzando un plasmide contenente eGFP in parallelo, o, per questo kindlina-3 costrutto, il monostrato Sf9 può essere risospeso in PBS e valutata mediante SDS-PAGE e western blotting, che dimostra tipicamente una netta banda corrispondente ad un 75 kDa proteina His-tag, come mostrato nella Figura 1B. Il virus viene successivamente amplificato per generare quantità sufficienti per larga scala (volumi litri) infezione di cellule di insetto e l&#39;isolamento della proteina ricombinante. Il secondo virus passaggio (P2) è generato da infettare colture in sospensione con un MOI approssimativo di 0,1 (vedi protocollo). E &#39;fondamentale che l&#39;amplificazione Sf9 coltura in sospensione occupa solo un ventesimo del volume totale pallone. Questo aerazione supplementare assicura che il vir risultanteci contenenti supporti, raccolto dopo 3 giorni (72 ore) post-infezione, genererà una quantità sufficiente di kindlina-3 nella cultura espressione successiva. Lo stock del virus amplificato (P2) si presume di possedere un titolo virale previsto di 2 x 10 8 pfu / ml in base a una stima prudente di 100 pfu / cella utilizzando una densità cellulare di 2 x 10 6 cellule / ml durante l&#39;amplificazione 31. Generalmente, per l&#39;amplificazione ottimale baculovirus e la produzione di proteine, le cellule Sf9 devono essere uniformi per dimensioni e sferica, come mostrato nella Figura 1C. Inoltre, l&#39;amplificazione e la proteina espressione virale è massima in 72 ore post infezione, ed entrambi sono significativamente ridotti in 96 ore post infezione. Una volta che il virus è stato amplificato e utilizzato per infettare cellule Sf9 in esperimenti su larga scala ricombinante kindlina-3 è parzialmente purificato in virtù della sua ingegnerizzato C-terminale suo 6-tag mediante cromatografia di affinità metallo immobilizzatofase gassosa, come mostrato nella Figura 2. È importante effettuare la purificazione a 4 ° C e sono stati aggiunti che gli inibitori della proteasi sufficienti per impedire proteolisi. Il kindlina-3 parzialmente purificato viene ulteriormente purificato per quasi omogeneità mediante scambio cromatografia ionica (IEC) usando una colonna di eparina, come mostrato nella Figura 3. Abbiamo impiegato l&#39;uso di una colonna di eparina invece di una colonna di scambio ionico convenzionale, come abbiamo previsto che il gran numero di residui basici, compreso un tratto di poli-lisina all&#39;interno del dominio kindlina-3 F1, sarebbe interagire fortemente con i gruppi solfato carica negativa della colonna. Questa strategia è particolarmente utile per RNA-binding proteins-DNA e con le zone di base di acido nucleico vincolante, ad esempio il terminale-RNA vincolante uridylyltransferase Cid1 32. Infine kindlina-3 purezza è &quot;lucido&quot; di dimensioni cromatografia ad esclusione per rimuovere aggregati e omogeneizzazione, come mostrato nellaFigura 4. I buffer specificati nei protocolli sono tamponi standard frequentemente utilizzati nella purificazione della proteina per l&#39;analisi strutturale. Generalmente, tamponi a base di fosfati sono evitati per la purificazione di proteine ​​per studi strutturali, soprattutto cristallizzazione di screening a causa della formazione di cristalli di fosfato nelle gocce di cristallizzazione (in particolare per esperimenti a 4 ° C). Tuttavia, abbiamo eseguito un saggio di spostamento termico basato Thermofluor per determinare quali tamponi sono stati stabilizzati per kindlina-3, come illustrato nella Figura 5. In breve, una soluzione di proteina purificata è diluita nel buffer che coprono un range di pH e sodio cloruri, quindi formando uno schermo da 2-dimensionale. La fusione della proteina viene misurata osservando la fluorescenza da Sypro colorante arancio (sonde molecolari), che si lega ai residui idrofobici all&#39;interno del nucleo proteina ripiegata, per il range di temperatura 20-95 ° C (293-368 K). La temperatura media punto in cui the la proteina svolge (temperatura di transizione, T m) è stato calcolato utilizzando il software Opticon Monitor ed è descritto altrove 33. Kindlina-3 è stata osservata per essere stabile a concentrazioni di cloruro di sodio alta (500 mm) entro l&#39;intervallo di pH 7,0-9,0, con una temperatura di transizione coerente (T m) di 55 ° C. Inoltre è stato osservato che la T m di kindlina-3 era di circa 55 ° C nell&#39;intervallo di pH 7.0-7.5 indipendentemente dalla concentrazione di cloruro di sodio. Abbiamo scoperto che c&#39;era proteolisi limitata di kindlina-3 durante la purificazione ma l&#39;analisi SDS-PAGE delle proteine ​​altamente concentrata (~ 15 mg / ml) ha dimostrato contaminazione limitata con due polipeptidi addizionali di uguale intensità. Stranamente, tuttavia non vi è alcuna indicazione di altre specie mediante cromatografia ad esclusione dimensionale, come mostrato in Figura 4. Si è quindi pensato che la proteina viene scalfito da proteasi ma rimane piegato e hydrodynamically indistinguibile dalla proteina full-length. È interessante notare, Calpain è una proteasi noto che scinde kindlina-3 a Tyrosine373, che è nel loop β1-β2 dell&#39;omologia pleckstrin (PH) dominio 34 e possono spiegare le nostre osservazioni. Inoltre, western blotting rivela che uno dei doppietti polipeptidiche possiede un C-terminale His-tag e il peso molecolare apparente del doppietto, quando sommati, uguale a 75 kDa, lo stesso peso molecolare della proteina nativa. La resa di purificato kindlina-3 ricombinante per litro di cellule Sf9 (~ 2 g di peso cellulare) è, nella migliore delle ipotesi, 5 mg. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1.jpg" /> Figura 1. Panoramica Panoramica delle cellule di insetto espressione della proteina eterologa baculovirus-infettati. (A) Un schematizzata di generatio baculovirusn ed espressione di kindlina-3 in cellule Sf9. Negli schemi vettore DNA, 5&#39;UTR / ORF603 è colorato in rosso, il ORF1629 è colorata in verde e, il gene della proteina di interesse (POI) è di colore blu. (B) Western Blot, utilizzando un anti-His anticorpo 6, di sei piccoli (2 ml monostrato) culture (corsie etichettati secondo la cultura) di cellule che producono Sf9 baculovirus ricombinante e ricombinante kindlina-3 murino. (C) Immagine luce microscopia di cellule Sf9 sane coltivate in sospensione in Sf-900 II SFM integrato con antibiotici e trasferito in un piatto di coltura di tessuti e 35 mm (vedi protocollo). L&#39;immagine è 20X di ingrandimento. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2.jpg" /> Figura 2. RAPPRESEpurificazione ntative di kindlina-3 da immobilizzato cromatografia di affinità metallo (IMAC). SDS-PAGE di nichel purificato per affinità ricombinante murino kindlina-3 espressa in baculovirus infettate cellule Sf9 (~ 2 g di peso cella). Proteina adsorbita è stata eluita con un gradiente di imidazolo (mostrato sopra il gel). Lanes sono etichettati come segue: MW, marcatore di peso molecolare; Lys, tutta lisato cellulare, FT, il flusso attraverso (non legato), WI, lavare 1; WII, lavare 2. Analisi Western blot (sotto) è stato effettuato anche utilizzando le frazioni di eluizione per confermare la presenza di ingegneria His-tag sulla proteina ricombinante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3.jpg" /> Figura 3. Rappresentantidepurazione rappresentativo del kindlina-3 da eparina affinità e cromatografia. (A) profilo di eluizione osservata a 280 nm (blu) la visualizzazione di un singolo picco simmetrico eluizione sotto un gradiente di cloruro di sodio lineare (verde) utilizzando l&#39;intervallo di concentrazione di NaCl di 0,05-1,0 M. ( B) analisi SDS-PAGE della eluizione frazionata dimostrare la presenza della proteina 75 kDa, kindlina-3 (K3 etichetta). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4.jpg" /> Figura 4. Rappresentativa cromatografia di gel filtrazione e concentrato kindlina-3. (A) gel filtrazione profilo di eluizione purificato kindlina-3 usandoun Superdex S200 (16/60) in Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM e 1 mM DTT a 20 ° C. Sulla base del volume di eluizione, kindlina-3 migra come previsto per una proteina di 75 kDa, suggerendo che è prevalentemente monomerico. (B) SDS-PAGE altamente concentrato ricombinante purificata kindlina-3 a 14,5 mg / ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5.jpg" /> Basato Thermofluor Figura 5. Saggio di spostamento termico per Buffer Screening. Kindlina-3 è stato diluito in vari buffer comprendenti uno schermo bidimensionale del pH rispetto alla concentrazione di cloruro di sodio. Temperature di transizione (temperatura punti medi) sono stati osservati per fluorescenza dellacolorante idrofobicamente legato, Sypro arancione (sonde molecolari) e calcolati utilizzando il software Opticon Monitor. (A) Un istogramma 3D delle temperature di transizione è tracciata con (B) il cambiamento della temperatura di transizione dalla media calcolata di 50,4 ° C. Per chiarezza, le barre sono colorate secondo la gamma di temperature a cui corrispondono. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Kindlins sono fondamentali per l&#39;adesione cellulare tramite integrine ma gli studi di loro sono stati ostacolati dalla difficoltà incontrata ad esprimere loro ricombinante in ospiti batterici. Descriviamo qui metodi per la loro produzione efficiente in cellule di insetto baculovirus-infette.

Produzione efficiente e purificazione di ricombinante murino kindlina-3 da cellule di insetto per Biofisica Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

L'obiettivo generale dei seguenti esperimenti è produrre in modo efficiente quantità nell'ordine del milligrammo di Miran Kinlin tre mediante colture di cellule di insetto, che non possono essere prodotte in altri sistemi di espressione. Questo risultato si ottiene mediante la co-trasfezione di un vettore di trasferimento KINLIN tre insieme a un baculovirus modificato per generare un baculovirus ricombinante portatore del gene KINLIN tre. Come secondo passaggio, il virus viene amplificato all'interno di cellule di insetto per produrre una quantità sufficiente di virioni per i passaggi successivi.In seguito, le cellule di insetto vengono infettate per produrre elevate quantità della proteina Kinlin tre, al fine di consentire la sua purificazione mediante cromatografia liquida rapida. I risultati ottenuti mostrano che è possibile produrre Kinlin tre funzionale ad alta purezza in quantità dell'ordine del milligrammo, come dimostrato dall'analisi tramite SDS-PAGE e cromatografia di esclusione molecolare. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'espressione di Kindling tre in batteri, è che l'espressione in cellule di insetto infettate da virus baculoviridi aumenta la resa di proteina ricombinante di dieci volte.Le cellule SF nine per questa procedura vengono coltivate e mantenute in sospensione utilizzando il mezzo SF 902 integrato con 100 microgrammi per millilitro di penicillina e 100 microgrammi per millilitro di streptomicina. Per la generazione del virus bao, le cellule devono essere coltivate fino a una densità compresa tra cinque volte 10 alla cinque e una volta 10 alla sei cellule per millilitro. Per preparare le cellule SF nine per la trasfezione, si seminano circa una volta 10 alla sei cellule per pozzetto di una piastra sterile per colture cellulari a sei pozzetti in due millilitri di mezzo SF 902 integrato con penicillina e streptomicina; si lasciano le cellule SF nine a temperatura ambiente nell'armadio a flusso laminare per circa 20 minuti affinché aderiscano alla base dei pozzetti di plastica e formino così un monolayer. La generazione del virus balo ricombinante si ottiene mediante cotrasfezione di DNA plasmidico e DNA BMid su una coltura monolayer di SF nine.Il vettore di espressione papina neurone firmato T tre contiene il gene murino KINLIN tre sotto il controllo del promotore virale P 10 BAO. Possiede sequenze virali BAO flanking che consentono il ricombinamento con il B mid e codifica un marcatore C-terminale hiss sei per la purificazione successiva. Per ogni trasfezione, preparare una soluzione A in un tubo separato, composta da uno a due microgrammi di MFI T tre purificato, 0,5 microgrammi di B mid purificato e 100 microlitri di SF 902 SFM senza antibiotici. In un altro tubo, diluire sei microlitri del reagente cell effect in due con 100 microlitri di SF 902 SFM senza antibiotici.Per ogni reazione di trasfezione, è possibile preparare una miscela madre qui per ridurre le operazioni di manipolazione dei liquidi, qualora siano necessarie molte trasfezioni. Questa è la soluzione B. Mescolare le due soluzioni A e B utilizzando circa 200 microlitri di ciascuna per ogni trasfezione e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per formare i complessi lipidici di DNA. Dopo 20 minuti, diluire i complessi lipidici di DNA con 800 microlitri per trasfezione di SF 902 SFM privo di antibiotici. Successivamente, aspirare con attenzione il mezzo della monocellulare di cellule SF nine e aggiungere delicatamente con una pipetta la miscela della soluzione AB e del mezzo sopra il monostrato di cellule SF nine.Incubare le cellule trasfettate durante la notte in un incubatore umidificato a 27 gradi Celsius, in modo da creare un ambiente umidificato che impedisca alle cellule di seccarsi. Posizionare la piastra a sei pozzetti all'interno di un contenitore di plastica provvisto di coperchio, insieme a un tovagliolo di carta inumidito. Nel giorno successivo, aggiungere un ulteriore millilitro di SF 900 al mezzo SFM senza antibiotici per ogni coltura a monolayer e incubare le cellule a 27 gradi Celsius per altri cinque giorni.Dopo cinque giorni, raccogliere il virus ricombinante bao direttamente dal mezzo di coltura e trasferirlo in un tubo da centrifuga pulito. Rimuovere qualsiasi detrito cellulare SF nine mediante centrifugazione a 1000 G per cinque minuti. A temperatura ambiente, trasferire il virus, presente nel sopranatante ottenuto e indicato come P1, in un tubo pulito. Si può presumere che la generazione del virus P1 abbia una titolazione virale attesa di 1 × 10⁷ PFU/mL.Sebbene sia possibile eseguire un'analisi di piastramento SA se necessario, conservare il ceppo virale P a quattro gradi Celsius al buio fino all'uso. Le cellule SF nine utilizzate per l'amplificazione del virus ricombinante balo in sospensione devono avere una densità di 1,4 × 10⁶ cellule per millilitro e la coltura deve occupare un ventesimo del volume totale della fiasca. Ad esempio, 50 millilitri in una fiasca da due litri. Generalmente, per un'ottimale amplificazione del virus vao e produzione proteica, le cellule SF nine devono essere uniformi per dimensione e sferiche.Infetta la coltura cellulare SF9 con il ceppo virale P1 a una molteplicità di infezione (MOI) di 0,1 utilizzando la seguente formula. Incuba la coltura di insetto infettata con P1 a 27 gradi Celsius con agitazione a 100 giri al minuto per 72 ore. Tre giorni dopo, raccogli il virus separando le cellule dal mezzo mediante centrifugazione a 1000 ×g per cinque minuti.Trasferire a temperatura ambiente il mezzo arricchito in virus, dopo chiarificazione, in un tubo pulito. Questo ceppo virale è indicato come P due e il titolo virale previsto è di due volte 10 alla otto PFU per millilitro. Conservare questo ceppo virale a quattro gradi Celsius al buio fino al momento dell'uso; conservare i pellet cellulari risultanti a meno venti gradi Celsius per la successiva conferma della produzione del virus ricombinante.Per iniziare questa procedura, coltivare un volume adeguato di colture cellulari di SF nine in sospensione in SF 902 s fm, integrato con 100 microgrammi per millilitro di penicillina e 100 microgrammi per millilitro di streptomicina. Il rapporto tra il volume totale della coltura e il volume della fiasca deve essere di uno a cinque.Incubare le colture in sospensione a 27 gradi Celsius con agitazione a 100 giri al minuto fino al raggiungimento di una densità cellulare di due volte 10 alla sesta cellule per millilitro. Quando le colture SF nine raggiungono una densità di due volte 10 alla sesta cellule per millilitro, sono pronte per l'infezione con il virus balo. Introdurre nelle colture un'ultima concentrazione pari all'1% di siero fetale bovino, seguita dal ceppo virale P due.Per ottenere un MOI di uno, incubare le colture infette a 27 gradi Celsius con agitazione a 100 giri al minuto. Dopo 72 ore dall'infezione, raccogliere le cellule SF9 che esprimono la lin tre ricombinante con marcatura poli-istidina mediante centrifugazione a 1000 ×g per 20 minuti a temperatura ambiente. Conservare il pellet cellulare ottenuto a meno 20 gradi Celsius fino all'uso oppure a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Questa procedura inizia scongelando il campione sul ghiaccio.I pellet congelati di virus vao infettati SF nine che esprimono kinlin tre ricombinante e Resus, sospesi i pellet con buffer di lisi. Dopo aver incubato le cellule risospese con il buffer di lisi per cinque-dieci minuti, vortexare fino a ottenere una sospensione risospesa omogenea per ulteriore rottura cellulare. Sonicare il campione in un bagno di ghiaccio.Clarificare il lisato mediante centrifugazione a 48.000 ×g per un'ora a quattro gradi Celsius. Caricare il sopranatante risultante su una colonna HisTrap di volume pari a cinque millilitri, pre-equilibrata con tampone di lisi a quattro gradi Celsius, a un flusso di un millilitro al minuto. I passaggi successivi relativi allo scambio del tampone di eluizione delle proteine e alla concentrazione proteica non verranno mostrati qui, ma sono descritti dettagliatamente nel manoscritto allegato.Una volta ottenuta la soluzione proteica con scambio di tampone, applicarla su una colonna Heparin HP High Trap da cinque millilitri, pre-equilibrata, utilizzando un sistema ACTA FPLC a una velocità di 0,5 millilitri al minuto. Il KINLIN tre legato viene eluito mediante un gradiente lineare di cloruro di sodio nello stesso tampone, con un incremento di 10 millimolari per millilitro di ricombinanti con tag di istidina. Ci si aspetta che il KINLIN tre eluisca a circa 0,6 molarità di cloruro di sodio; dopo aver concentrato la proteina, l'ultimo passaggio consiste nello scambiare il tampone della proteina mediante cromatografia a esclusione dimensionale: applicare la proteina purificata su una colonna SUEx S 210 30 ed eluire le proteine in base alle dimensioni, applicando il tampone sulla colonna a una velocità di 0,5 millilitri al minuto.La proteina eluita dalla colonna viene frazionata e monitorata utilizzando l'assorbanza a 280 nanometri. Il successo della generazione del virus ricombinante è stato verificato valutando la presenza di Kinlin ricombinante tre e delle cellule SF nove cotrasfettate mediante analisi SDS-PAGE e Western blot, come mostrato in questo esempio rappresentativo di un'analisi Western di sei colture su piccola scala di cellule SF nove, utilizzando un anticorpo anti-his sei. Una banda nitida corrispondente a una proteina marcativa his di 75 kilodalton era visibile in ciascun campione una volta che il virus era stato amplificato e utilizzato per infettare le cellule SF nove in esperimenti su larga scala. KINLIN ricombinante tre è stato parzialmente purificato mediante cromatografia di affinità con metalli immobilizzati.L'immagine principale del gel in questa figura mostra una SDS-PAGE di una proteina ricombinante murina di kinlin tre purificata mediante affinità per nichel, espressa in cellule SF9 infettate dal virus BAO. La proteina assorbita è stata eluita utilizzando un gradiente di imidazolo mostrato sopra l'immagine del gel. MW indica il marcatore di peso molecolare, LYS è il lisato cellulare totale, FT è il flusso iniziale, WI è il primo lavaggio e WII è il secondo lavaggio. È stata inoltre eseguita un'analisi mediante Western blot utilizzando le frazioni di eluizione per confermare la presenza del tag his ingegnerizzato sulla proteina ricombinante.Successivamente, la KINLIN tre parzialmente purificata è stata ulteriormente purificata fino a una condizione quasi omogenea mediante cromatografia a scambio ionico utilizzando una colonna di eparina. Questo pannello mostra il profilo di eluizione osservato a 280 nanometri in blu, che presenta un singolo picco simmetrico eluito sotto un gradiente lineare di cloruro di sodio indicato in verde, utilizzando un intervallo di concentrazione di cloruro di sodio compreso tra 0,05 molare e 1,0 molare. Il pannello inferiore mostra i risultati dell'analisi SDS-PAGE delle frazioni eluite, che dimostrano la presenza della proteina Kinlin tre di 75 kilodalton.Come passaggio finale, la purezza di Kinlin tre è stata perfezionata mediante cromatografia di esclusione dimensionale per rimuovere gli aggregati e ottenere omogeneità. Questo profilo rappresentativo di filtrazione su gel è relativo a Kinlin tre purificato, ottenuto utilizzando una colonna SUEx S 200 in Tris HCl pH 7,5, 150 millimolare di cloruro di sodio e 1 millimolare di DTT a 20 gradi Celsius. Sulla base del volume di eluizione, Kinlin tre migra come previsto per una proteina di 75 kilodalton, suggerendo che è prevalentemente monomerica.La prossima figura mostra i risultati dell'elettroforesi SDS-PAGE di kinlina ricombinante altamente purificata, denominata K3, a una concentrazione di 14,5 milligrammi per millilitro. La produzione di quantità nell'ordine del milligrammo di kinlina murina completa e ad alta purezza, espressa in colture di cellule di insetto, permetterà approfonditi studi strutturali e analisi biochimiche della proteina. In questo studio è stato inoltre eseguito un saggio termo-shift basato su termofluorescenza per determinare quali tamponi stabilizzassero la kinlina tre.KINLIN tre è stato diluito in vari tamponi, costituendo una schermata bidimensionale di pH rispetto alla concentrazione di cloruro di sodio. Il pannello superiore mostra un istogramma tridimensionale delle temperature di transizione, mentre il pannello inferiore mostra la variazione della temperatura di transizione rispetto alla media calcolata di 50,4 gradi Celsius. Le barre sono colorate in base all'intervallo di temperature a cui corrispondono.KINLIN tre è risultato stabile a concentrazioni elevate di cloruro di sodio nell'intervallo di PA compreso tra 7,0 e 9,0, con una temperatura di transizione costante di 55 gradi Celsius. È stato inoltre osservato che la temperatura di transizione di Kinlin tre era approssimativamente di 55 gradi Celsius nell'intervallo di PA compreso tra 7,0 e 7,5, indipendentemente dalla concentrazione di cloruro di sodio.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre una ricombinante chinasi altamente pura e funzionale, da utilizzare per caratterizzazioni biofisiche approfondite e ulteriori indagini. Approcci simili possono essere applicati ad altri campioni proteici difficili da preparare, e ne raccomandiamo l'utilizzo in tali casi.

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