Produzione efficiente e purificazione di ricombinante murino kindlina-3 da cellule di insetto per Biofisica Studies

L'obiettivo generale dei seguenti esperimenti è quello di produrre in modo efficiente quantità di milligrammi di Miran Kinlin 3 e coltura di cellule di insetti, che non possono essere prodotte in altri ospiti di espressione. Ciò si ottiene mediante transsezione COT, un vettore di trasferimento KINLIN tre insieme a un virus bao ingegnerizzato nella parte centrale per creare un virus bao ricombinante che trasporta il gene KINLIN tre. In una seconda fase, il virus viene amplificato all'interno delle cellule degli insetti per produrre una quantità sufficiente di virioni per le fasi successive.

Successivamente, le cellule degli insetti vengono infettate per produrre grandi quantità di proteina Kinlin 3 al fine di consentirci la purificazione tramite cromatografia liquida veloce. Si ottengono risultati che dimostrano che la kinlin tre funzionale di elevata purezza può essere prodotta in quantità di milligrammi sulla base dell'analisi della pagina SDS e della cromatografia ad esclusione dimensionale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'accensione dell'espressione di tre nei batteri è che l'espressione delle cellule di insetto infettate da virus maculari aumenta di dieci volte la resa proteica ricombinante.

Le nove cellule SF per questa procedura vengono coltivate e mantenute in sospensione utilizzando terreni SF 902 integrati con 100 microgrammi per millilitro di penicillina e 100 microgrammi per millilitro di streptomicina. Per la generazione del virus bao, le cellule devono essere coltivate a un intervallo di densità di cinque volte 10 a cinque a uno volte 10 a sei cellule per millilitro. Per preparare le nove cellule SF per la trasfezione, vedere circa una volta 10 alle sei cellule per pozzetto di una piastra di coltura tissutale sterile a sei pozzetti in due millilitri di terreno SF 902 integrato con penicillina e streptomicina, lasciare le nove cellule SF per circa 20 minuti a temperatura ambiente nella cappa aspirante per aderire alla base dei pozzetti di plastica e formare così un monostrato ricombinante balo virus si ottiene la generazione mediante transsezione in culla di plasmidi, DNA e DNA BMid su una coltura monostrato di SF nove.

Il vettore di espressione papina neurone azienda T tre ha il topo KINLIN tre gene azienda T tre. Sotto il controllo del P 10, il promotore virale BAO possiede sequenze virali bao laterali per consentire la ricombinazione con il centro posteriore e codifica un sibilo terminale C, sei tag per la purificazione a valle per ogni trasfezione, effettua da uno a due microgrammi di MFI T purificato, tre con 0,5 microgrammi di B mid purificato e 100 microlitri di SF 902 SFM senza antibiotici. Questa è la soluzione A in un tubo separato, diluire sei microlitri di effetto cellulare in due reagenti con 100 microlitri di SF 902 SFM senza antibiotici.

Per ogni reazione di trasfezione, è possibile creare una miscela master per ridurre la gestione del liquido se sono necessari molti trasfetti. Questa è la soluzione B.Mescolare le due soluzioni A e B utilizzando circa 200 microlitri di ciascuna per trasfezione e incubato a temperatura ambiente per 20 minuti per formare complessi di DNA lipidico dopo 20 minuti, diluire i complessi di DNA lipidico con 800 microlitri per trasfezione di SF 902 SFM senza antibiotici. Quindi, aspirare con cura il terreno monostrato SF a nove cellule e pipettare con cura la soluzione AB e la miscela di terreno sopra il monostrato SF a nove cellule.

Incubare le cellule trasfettate in un incubatore umidificato a 27 gradi Celsius durante la notte per creare un ambiente umidificato per evitare che le cellule si secchino. Metti il piatto a sei pozzetti in un contenitore di plastica acceso insieme a un tovagliolo di carta umido. Il giorno successivo, aggiungere un ulteriore millilitro di SF 900 alla SFM senza antibiotici Per ogni coltura monostrato, incubare le cellule a 27 gradi Celsius per altri cinque giorni.

Dopo cinque giorni, prelevare il virus bao ricombinante direttamente dal terreno di coltura e trasferirlo in una provetta da centrifuga pulita. Chiarificare eventuali detriti di SF nove cellule mediante centrifugazione a 1000 Gs per cinque minuti. A temperatura ambiente si può presumere che il virus, che si trova nei supernomi risultanti e indicato come P uno, in una provetta pulita La generazione del virus P uno abbia un titolo virale atteso di una volta 10 per sette PFU per millilitro.

Sebbene sia possibile eseguire una placca SA se necessario, conservare il ceppo virale P one a quattro gradi Celsius al buio fino all'uso delle nove cellule SF utilizzate per l'amplificazione del virus balo ricombinante in sospensione dovrebbe avere una densità di 1,4 volte 10 per le sei cellule per millilitro e la coltura dovrebbe occupare un 20 ° del volume totale del pallone. Ad esempio, 50 millilitri in un pallone da due litri. Generalmente per un'amplificazione ottimale del virus vao e la produzione di proteine, le nove cellule SF dovrebbero essere di dimensioni uniformi e sferiche.

Infettare la coltura cellulare SF nine con il ceppo virale P one a una molteplicità di infezione o MOI di 0,1 utilizzando la seguente formula. Incubare la coltura di insetti infetti da P one a 27 gradi Celsius con agitazione a 100 giri/min per 72 ore. Tre giorni dopo, raccogliere il virus separando le cellule dal terreno mediante centrifugazione a 1000 Gs per cinque minuti.

Al trasferimento a temperatura ambiente, il terreno arricchito con virus chiarificato in una provetta pulita. Questo stock virale è indicato come P due e il titolo virale previsto è due volte 10 per otto PFU per millilitro. Conservare questo stock virale a quattro gradi Celsius al buio fino all'uso, conservare i pellet cellulari risultanti a 20 gradi Celsius negativi per una successiva conferma della produzione di virus ricombinante.

Per iniziare questa procedura, coltivare un volume adeguato di SF nove colture cellulari in sospensione e SF 902 s fm. Integrato con 100 microgrammi per millilitro di penicillina e 100 microgrammi per millilitro di streptomicina. Il rapporto tra il volume totale della coltura e il volume del pallone deve essere di uno a cinque.

Incubare le colture in sospensione a 27 gradi Celsius agitando a 100 giri/min fino a raggiungere una densità cellulare di due volte 10 per sei cellule per millilitro. Quando le nove colture di SF hanno una densità di due volte 10 per sei cellule per millilitro, sono pronte per l'infezione da virus balo. Integrare le colture con una concentrazione finale dell'1% di siero fetale bovino seguito dal ceppo virale P 2.

Per ottenere un MOI di uno, incubare le colture infette a 27 gradi Celsius con agitazione a 100 RPM 72 ore dopo l'infezione, raccogliere poliistamina ricombinante marcata lin tre che esprime SF nove cellule mediante centrifugazione a 1000 GS per 20 minuti a temperatura ambiente. Conservare il pellet di cella risultante a una temperatura di -20 gradi Celsius fino all'uso o a una temperatura di -80 gradi Celsius per una conservazione a lungo termine. Questa procedura inizia con lo scongelamento su ghiaccio.

I pellet congelati del virus vao hanno infettato SF nine che esprime la kinlin tre ricombinante e Resus che sospende i pellet con il tampone di lisi. Dopo aver incubato le cellule risospese con il tampone di lisi per cinque-10 minuti, agitare fino a ottenere una sospensione di resus omogenea per un'ulteriore disgregazione cellulare. Sonicare il campione in un bagno di ghiaccio.

Chiarificare il lisato mediante centrifugazione a 48.000 GS per un'ora a quattro gradi Celsius. Caricare i super nomi risultanti su una colonna di trappola hist volume di cinque millilitri pre-bilanciata con tampone di lisi a quattro gradi Celsius a una velocità di un millilitro al minuto. I passaggi successivi per l'eluizione proteica, lo scambio di tamponi e la concentrazione proteica non saranno dimostrati qui, ma sono dettagliati nel manoscritto allegato.

Una volta ottenuta la soluzione proteica a scambio tampone, applicarla su una colonna HP di eparina ad alta trappola pre-bilanciata di cinque millilitri utilizzando un ACTA FPLC a una velocità di 0,5 millilitri al minuto. Il KINLIN 3 legato è alluso utilizzando un gradiente lineare di cloruro di sodio nello stesso tampone che aumenta ad una velocità di 10 millimolari per millilitro di ricombinanti le etichette di istamina. Si prevede che KINLIN 3 eluisca a circa 0,6 molari di cloruro di sodio dopo aver concentrato la proteina, il passaggio finale consiste nello scambio di tampone della proteina utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale, applicare la proteina purificata su una colonna SUEx S 210 30, purificare le proteine in base alle dimensioni applicando il tampone sulla colonna a una velocità di 0,5 millilitri al minuto.

La proteina che allude dalla colonna viene frazionata e monitorata utilizzando l'assorbente a 280 nanometri. Il successo della generazione di virus ricombinanti è stato verificato valutando la presenza di Kinlin 3 ricombinante e di COT TRANSFECTED SF nove cellule mediante SDS page e analisi Western come si vede in questo sangue occidentale rappresentativo di sei colture SF nine su piccola scala utilizzando un anticorpo anti hiss sei, una banda chiara corrispondente a una proteina marcata con hiss da 75 kilodalton era visibile in ogni campione una volta che il virus era stato amplificato e utilizzato per infettare SF nove celle in esperimenti su larga scala. Il KINLIN 3 ricombinante è stato parzialmente purificato mediante cromatografia di affinità con metalli immobilizzati.

L'immagine principale del gel in questa figura mostra la pagina SDS dell'affinità del nichel ricombinante purificato kinlin murino tre espresso nel virus BAO, nove cellule infettate da SF, nove cellule assorbite la proteina è stata allusa utilizzando un gradiente ole mostrato sopra l'immagine del gel. MW indica il marcatore di peso molecolare LYS è l'intero lisato cellulare, FT è il flusso attraverso WI è il lavaggio uno e WII è il lavaggio due. L'analisi del western blot è stata eseguita anche utilizzando le frazioni di eluizione per confermare la presenza del tag HIS ingegnerizzato sulla proteina ricombinante.

Successivamente, il KINLIN 3 parzialmente purificato è stato ulteriormente purificato fino a raggiungere quasi l'omogeneità mediante cromatografia a scambio ionico utilizzando una colonna di eparina. Questo pannello mostra il profilo eluciano osservato a 280 nanometri in blu, mostrando un singolo picco simmetrico che elude sotto un gradiente lineare di cloruro di sodio indicato in verde, utilizzando un intervallo di concentrazione di cloruro di sodio da 0,05 molare a 1,0 molare. Il pannello inferiore mostra i risultati dell'analisi della pagina SDS dell'eluizione frazionata che dimostra la presenza della proteina Kinlin three da 75 kilodalton.

Come passaggio finale, la purezza KINLIN three è stata lucidata mediante cromatografia ad esclusione dimensionale per rimuovere gli aggregati e ottenere l'omogeneità. Questo profilo eluciano di filtrazione su gel rappresentativo è di Kinlin tre purificato utilizzando un SUEx S 200 in Tris HCL pH 7.5, 150 millimolari di cloruro di sodio e un millimolare DTT a 20 gradi Celsius. Sulla base del volume di eluizione, KINLIN three migra come previsto per una proteina da 75 kilodalton, suggerendo che sia prevalentemente monomerica.

La figura seguente mostra i risultati della pagina SDS di kinlin tre ricombinante purificato altamente concentrato, marcato K tre, a 14,5 milligrammi per millilitro. La produzione di quantità in milligrammi di kinlin di topo a lunghezza intera ad alta purezza e colture cellulari di insetti consentirà studi strutturali approfonditi e analisi biochimiche della proteina. In questo studio è stato eseguito anche un test di spostamento termico basato sul pavimento per determinare quali tamponi si stabilizzavano per KINLIN tre.

KINLIN 3 è stato diluito in vari tamponi, comprendenti uno screening bidimensionale del pH rispetto alla concentrazione di cloruro di sodio. Il pannello superiore è un istogramma 3D delle temperature di transizione e il pannello inferiore mostra la variazione della temperatura di transizione rispetto alla media calcolata di 50,4 gradi Celsius. Le barre sono colorate in base al range di temperature a cui corrispondono.

È stato osservato che KINLIN 3 è stabile ad alte concentrazioni di cloruro di sodio nell'intervallo PA da 7,0 a 9,0 con una temperatura di transizione costante di 55 gradi Celsius. È stato anche osservato che la temperatura di transizione di Kinlin 3 era di circa 55 gradi Celsius all'interno dell'intervallo PA da 7,0 a 7,5. Indipendentemente dalla concentrazione di cloruro di sodio.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre legna da ardere ricombinante funzionale altamente pura. Tre per una caratterizzazione biofisica approfondita e ulteriori indagini. Approcci simili possono essere utilizzati con altri campioni proteici difficili da preparare e in questi casi se ne consiglia l'applicazione.