Name: Valutare linnato rilevamento dellinfezione da HIV-1 CD4 infetti + Cellule T dalle cellule dendritiche plasmacitoidi Utilizzando un Ex vivo Sistema di co-coltura. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Scopri come valutare il rilevamento innato di cellule T CD4+ infette da HIV-1 da parte delle cellule dendritiche plasmacitoidi utilizzando un sistema di co-coltura ex vivo. Questo metodo misura la produzione di interferone di tipo I.

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Ringraziamo E. Massicotte e J. Signore per l&#39;assistenza tecnica di esperti durante citometria a flusso e gli esperimenti di separazione delle cellule. Inoltre, vorremmo ringraziare il personale della clinica IRCM e tutti i donatori per la fornitura di campioni di sangue. Campioni di sangue periferico sono stati ottenuti da donatori adulti sani, che hanno firmato un consenso informato in accordo con la Dichiarazione di Helsinki sotto protocolli di ricerca approvati dal etica della ricerca board review del Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM). I seguenti reagenti sono stati ottenuti attraverso il Programma reagente NIH AIDS, Divisione di AIDS, NIAID, NIH: cellule MT4 del dottor Douglas Richman; e rIL-2 umane del dottor Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc. Il dottor Cohen è il destinatario del Canada Research Chair in Retrovirology umana. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal CIHR (CIHR 111.226) per il dottor Cohen e dal Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) rete AIDS Dr. Bego e il dottor Cohen.

Note generali È importante mantenere cellule in coltura senza antibiotici, poiché le infezioni batteriche anche controllati possono essere percepiti da PBMC. Tale rilevazione di componenti batteriche indurrà uno sfondo la produzione di interferone, che non può essere distinto da quello innescato da specifici HIV-1 di rilevamento. Inoltre, tutte le cellule devono essere regolarmente testato per l&#39;assenza di contaminazione da micoplasma. Usare sempre soluzioni senza endotossine quando possibile. Citometria a flusso caratterizzazione delle diverse cellule da utilizzare in co-colture (PBMC, pDCs, MT4 e cellule T CD4 +) è un passaggio facoltativo, ma altamente consigliata dato che può fornire preziose informazioni necessarie per la corretta interpretazione di un dato esperimento. 1. Preparazione di cellule bersaglio infette <ol><li> Mantenere umano linea di cellule CD4 + T MT4 in RPMI 1640 mediun addizionato con siero fetale bovino 10% (FBS), cui d&#39;ora in poi come RPMI-1640 terreno completo. </li><li> L&#39;isolamento di cellule T CD4 + primaria. <ol><li> Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico umano mediante centrifugazione a gradiente di densità. </li><li> Isolare linfociti T CD4 + utilizzando un kit di selezione negativa cellule T CD4 +, seguendo le raccomandazioni del costruttore. </li><li> Attiva linfociti T CD4 + con PHA-L (5 mg / ml) per 48 ore e poi mantenere cellule in RPMI-1640 integrato con terreno completo ricombinante IL-2 (100 U / ml). Infettare primaria cellule T 5 giorni dopo l&#39;isolamento. </li></ol></li><li> L&#39;infezione di cellule bersaglio (linea di cellule MT4 T o cellule eterologhe primarie T CD4 +). <ol><li> Due giorni prima di co-coltura, infettare le cellule T con virus HIV-1. Nell&#39;esempio specifico qui descritto sono stati utilizzati pNL4.3-GFP_ires_Nef wild type (WT) o pNL4.3-GFP_ires_Nef delta Vpu (dVpu) virus. Questi ceppi virali rappresentano greit proteina fluorescente (GFP) segnata con cloni molecolari infettivi isogeni che differiscono solo per la capacità di esprimere Vpu. </li><li> Utilizzare diverse molteplicità di infezione (MOI) e selezionare colture con livelli simili di infezione per i co-culture. Il giorno della co-coltura, determina la percentuale di GFP + cellule mediante citometria a flusso come marcatore di infezione. Utilizzare solo le culture, con un intervallo di 20-50% cellule infette per co-culture. </li></ol></li></ol> Passaggi facoltativi: Eseguire citometria a flusso colorazione a questo punto per valutare l&#39;espressione superficiale di molecole / ligandi di interesse come BST2, e CD4. Per la colorazione della superficie cellulare, risospendere 0,5 x 10 6 cellule T in 100 ml di soluzione di lavaggio, aggiungere 1 ml di anti-CD4_PerCP / Cy5.5 e 1 ml di anti-BST2_A660. Incubare le provette per 45 min a 4 ° C, prima di lavare con citofluorimetria soluzione di lavaggio. Se gli studi sono volti a valutare il ruolo di Vpu mediata antagonismo BST2, eseguire un HIV-1 particellasaggio di rilascio in questo momento come descritto in precedenza 15. 2. Isolamento e arricchimento delle celle sensorie (PBMC intere o pDCs arricchito) Nota: quando PBMC vengono utilizzati per il rilevamento, avviare isolamento all&#39;interno mezz&#39;ora dopo la raccolta del sangue e condotta in modo tempestivo. Utilizzare immediatamente PBMC per co-culture o pDC arricchimento. <ol><li> Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico umano mediante centrifugazione a gradiente di densità. Passaggio facoltativo: Eseguire multi-parametrica citometria a flusso colorazione a confermare che i PBMC appena isolate contengono le diverse linee cellulari a rapporti fisiologici. Per la colorazione della superficie cellulare, risospendere 10 6 PBMC in 100 ml di soluzione di bloccaggio Fc, e incubare per 15 minuti a 4 ° C. Dopo il blocco, aggiungere 1 ml di anti-CD3_Pacific blu (per le cellule T), 1 ml di anti-CD14-PE_Texas rosso (per le cellule mieloidi), 4 ml di anti-BDCA2_APC e 1 ml di anti-ILT7_PE (per pDCs). Covaretubi per 45 minuti a 4 ° C, prima di lavare con citometria a flusso soluzione di lavaggio. </li><li> Arricchisci pDCs utilizzando un kit di selezione negativa pDC, seguendo le raccomandazioni del costruttore. Si raccomanda di lavorare velocemente, mantenere le cellule freddo, e utilizzare soluzioni pre-raffreddati. Questo consentirà di evitare il livellamento di anticorpi sulla superficie delle cellule e l&#39;etichettatura delle cellule non specifici e garantendo massima attività PDC. <ol><li> Eseguire multi-parametrica citometria a flusso delle pDCs appena isolate per confermare la purezza, la percentuale di arricchimento, e quantità relative di pDC- marcatori di superficie specifici (come ILT7 e BDCA2). Per la colorazione della superficie cellulare, risospendere 10 4 pDCs in 100 ml di soluzione di bloccaggio Fc, e incubare per 15 minuti a 4 ° C. Dopo il blocco, aggiungere 1 ml di anti-CD3_Pacific Blu, 1 ml di anti-CD14_PE_Texas Rosso, 4 ml di anti-BDCA2_APC e 1 ml di anti-ILT7_PE. Incubare le provette per 45 minuti a 4 ° C, prima di lavare con citometria a flusso soluzione di lavaggio (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS). Si raccomanda un minimo di 40% di purezza PDC (se il materiale di partenza è lo 0,4% pDC, questo sarebbe equivalente a un arricchimento 100 volte). </li></ol></li></ol> 3. Co-coltura di cellule infettate T CD4 + e celle sensorie (PBMC intere o pDCs arricchito) <ol><li> Miscelare 220 ​​ml di PBMC (diluito a 850.000 cellule / ml) o 220 ml di pDC (ad una concentrazione compresa tra 100.000 a 500.000 cellule / ml) con 30 ml di cellule T infettate (diluiti a 10 6 cellule / ml) per pozzetto in una piastra ben U-bottom 96. <ol><li> Come controlli, PBMC piastra o pDCs e cellule T da solo. Regolare il volume in ben 250 microlitri con RPMI 1640 terreno completo. </li><li> Valutare risposte cellulari agonisti nota dei percorsi TLR7 e TLR9. A tal fine, piastra 220 ml di PBMC (diluito a 850.000 cellule / ml) o 200 ml di pDC (ad una concentrazione compresa tra 100.000 a 500.000 cellule / ml) per pozzetto in una U-bottom 96 pozzetti e aggiungere TLR7 agonisti ( Imiquimod, concentrazione finale: 2,5 mg / ml) o TLR9 agonisti (ODN 2216 CpG-A, concentrazione finale: 5 micron). Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 18-22 ore ed elaborarli in un modo simile a co-colture di seguito descritte. </li></ol></li><li> Incubare co-colture a 37 ° C e 5% di CO 2 per 18-22 ore, e poi trasferirli su un piatto ben 96 V-parte inferiore. Centrifugare per 5 min a 400 x g. <ol><li> Trasferimento surnatanti di una piastra ben a fondo piatto 96. Supernatanti possono essere conservati a -80 ° C o utilizzati per il rilevamento di tipo I IFN subito. </li><li> Risospendere le cellule co-coltivate in 2% paraformaldeide e analizzarli in citometria a flusso. A causa delle differenze in termini di dimensioni e di granulazione, le cellule MT4 sono facilmente distinguibili da PBMC o pDCs in base al loro fianco scatter (SS) rispetto forward-scatter (FS) profili. Se le cellule T primarie sono utilizzate come cellule bersaglio infettate, questi possono essere colorati con il colorante inseguitore cellulare, quali CSFE, prima della co-coltura. </li></ol></li><li> Misura di bioattivo di tipo I IFN utilizzando cellule beta giornalista HEK-Blu-IFN alfa /. Nota: Queste cellule sono stati generati da trasfezione stabile di cellule HEK293 con i geni stat2 e IRF9 umane per ottenere un tipo completamente attivo IFN percorso di segnalazione. Essi contengono anche la fosfatasi alcalina secreta (SEAP) gene reporter sotto il controllo di IFN-α / ß inducibile ISG54 promotore. La stimolazione di queste cellule di tipo I-IFN attiva la JAK / STAT / ISGF3 pathway e induce la produzione di SEAP. <ol><li> Mantenere le cellule HEK-Blue IFN-α / ß in DMEM supplementato con 10% FBS. Li piastra a una densità di 50.000 cellule per pozzetto in una piastra a fondo piatto ben 96, in un volume finale di 180 microlitri. </li><li> Aggiungere 20 ml di co-coltura supernatante in ciascun pozzetto in duplicato. Ciascuna piastra richiede anche una serie di controlli standard interno (IFNα umana, concentrazione finale da 100 U / ml a 2500 U / ml). Incubare le piastre a 37 ° C e 5% CO 2 per 18-22 Ore. </li><li> Determinare i livelli di attività di fosfatasi alcalina con soluzione QUANTI-Blue, che cambia dal rosa al viola / blu in presenza dell&#39;enzima. Preparare QUANTI-Blue seguendo le raccomandazioni del costruttore. Aggiungere 180 ml di questa soluzione in ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto ben 96. Per ogni bene aggiungere anche 20 l di HEK-Blue IFN-α / beta cellule sopranatanti indotti, e incubare la piastra a 37 ° C incubatore fino colore si sviluppa nei pozzetti di controllo IFN standard. </li><li> Valutare livelli di SEAP utilizzando uno spettrofotometro a 620-655 nm e determinare la concentrazione di IFN di tipo I per estrapolazione dalla parte lineare della curva standard IFN. </li></ol></li></ol>

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I protocolli descritti qui misurano rilevamento delle cellule T con infezione da HIV-1 virus GFP-tagged che differiscono solo per la capacità di esprimere Vpu, come descritto nella nostra recente relazione 18. Tuttavia, questi metodi possono essere facilmente modificati per studiare rilevamento di virus senza tag e virus privi altri geni virali che potrebbero potenzialmente modulare sensing innata. Se i virus usati non esprimono GFP, la percentuale di cellule bersaglio infette devono essere determinati da un altro mezzo prima di co-coltura, come il p24 (capside) colorazione intracellulare e citometria a flusso o p24 ELISA. Inoltre, questi protocolli possono essere usati con differenti cellule bersaglio T, tra cui una varietà di linee cellulari disponibili e cellule primarie. I metodi descritti in questo manoscritto hanno un numero di vantaggi rispetto ai primi metodologie utilizzate per studiare HIV-1 sensing. Innanzitutto è stato stabilito da una serie di gruppi che libera HIV-1 pgli articoli sono poveri induttori di tipo I IFN 2,13,14. Inoltre, i primi studi invocato più vecchi metodi basati-ELISA IFNα per quantificare la quantità di tipo I IFN prodotto. Un limite di questa tecnica di rilevamento è che la maggior parte dei vecchi kit ELISA IFNα misurare un solo tipo di IFNα, mentre si affaccia gli altri tipi di IFNα e Interferone beta. L&#39;utilizzo delle linee cellulari giornalista descritte supera questa limitazione come la concentrazione di tutte le forme bioattive di IFN di tipo I umano può essere misurato in una volta. La tecnica è molto sensibile, meno costoso di una nuova generazione di kit ELISA IFN e per molti donatori grandi quantità di IFN di tipo I possono essere facilmente individuati. Tuttavia, questo protocollo può essere facilmente adattato per l&#39;uso con altri di tipo I-IFN metodi di read-out, come ELISA. Passaggi critici: E &#39;importante che la qualità di tutti i componenti cellulari (sia di obiettivi che effettori) essere controllati strettamente. Potenziale contaminazione, anche quando asymptomatica, deve essere monitorato e controllato. Come abbiamo accennato in precedenza, antibiotico-controllato contaminazione batterica asintomatica, e potenzialmente di altri agenti patogeni intracellulari come micoplasma, in grado di generare risposte immunitarie simili a quelli osservati dopo da HIV-1, vale a dire la produzione di tipo I IFN. Inoltre, tutti i reagenti devono essere liberi di LPS o altri potenziali endotossine. Allo stesso modo, il monitoraggio di PBMC e pDCs è anche importante dal momento che i campioni umani possono spesso essere trattate da infezioni in corso sottostanti, che possono influenzare il rilevamento normale. Si consiglia sempre inclusi i controlli negativi proposte, quali l&#39;assenza di cellule bersaglio, nonché co-colture con cellule mock-infettate. La vitalità delle cellule infettate è importante anche per il corretto rilevamento pDC dal tipo I IFN non è prodotto a seguito della co-coltura con cellule apoptotiche 2,14. Una importante limitazione della tecnica è la necessità di cellule primarie appena isolate. Questa procedura non è statatestato con PBMC o pDCs che erano o precedentemente congelati o tenuti in coltura. L&#39;isolamento delle PBMC è laborioso e queste cellule hanno una durata di vita molto limitata. Inoltre, dovrebbero essere utilizzati protocolli standard per la protezione contro i patogeni ematica mentre si lavora con sangue umano. Ci sono spesso diverse fonti di variabilità associati con il lavoro che coinvolgono le cellule umane appena isolate. Tra loro ci sono le diverse procedure adottate per isolare queste cellule, e la variabilità ereditata incontrate dal donatore a donatore. Mentre è impossibile evitare variabilità tra donatore, l&#39;uso dei controlli positivi proposti, come la misurazione risposta agli agonisti conosciuti di TLR7 e TLR9 percorsi, fornirebbe un importante controllo interno per questi esperimenti. Abbiamo osservato che una risposta forte agli agonisti del percorso TLR9 potrebbe essere correlato con una risposta pDC sano, mentre è previsto un percorso reattivo TLR7 una risposta adeguata contro l&#39;HIV-1 3. altri 2, spesso non è necessario un arricchimento di pDCs da PBMC. Tuttavia, se il disegno sperimentale richiede (ad esempio nel contesto in cui è necessaria la deplezione di specifici marcatori di superficie PDC) selezione negativa è preferibile rispetto selezione positiva, come cellule restano liberi di anticorpo dopo il processo di selezione. Isolato pDCs subiscono una rapida apoptosi in coltura. Per gli esperimenti che richiedono queste cellule siano coltivate per lungo periodo di tempo, terreni di coltura possono essere integrati con IL-3. Questa citochina induce pDC proliferazione e inibisce la loro apoptosi 16. Tuttavia, IL-3 utilizzo deve essere strettamente controllato in quanto può portare a maturazione pDC o differenziazione. Il metodo qui descritto combina bersaglio da HIV-1 le cellule infettate con PBMC o pDCs appena isolate al fine di ricreare le fasi iniziali coinvolte durante il rilevamento innata. Questo metodo sarà senza dubbio utile per Explore eventi precoci immunitarie innate associate all&#39;infezione da HIV. Anche se i protocolli associati sono finalizzati a misurare tipo I IFN, potrebbero facilmente essere modificati per misurare altre molecole bioattive rilasciate da pDCs al momento della rilevazione delle cellule infette. Questi possono includere: Tipo III-IFN (IFN-λ), citochine pro-infiammatorie (TNF-come α e IL-6) e chemochine CXCL10, CCL4, e CCL5 17.

Tipo I IFN-produzione pDCs rappresentano la prima linea di difesa contro le infezioni virali, e come tale servire come un collegamento vitale tra innata e l&#39;immunità 1. Mentre privi di cellule HIV-1 particelle sono scarsamente riconosciuti dal sistema immunitario innato, cellule T CD4 + HIV-1-infetti siano effettivamente percepite dai pDCs 2. Il meccanismo di rilevamento richiede un contatto iniziale tra la glicoproteina virale (gp120) sulla superficie della cellula infettata T e molecole CD4 sulla pDC, che è poi seguita da cattura virus e internalizzazione dal pDC. Rilevazioni successive di trasferimento di HIV-1 RNA TLR7 determinerà l&#39;attivazione della MyD88 / IRF7 percorso e alla fine conduce al tipo-I produzione di IFN 3. È importante sottolineare che il secondo circuito di sensing presente in pDC, che è mediata da TLR9, è inibita dalla interazione della glicoproteina virale, gp120, con il PDC-specifico marcatore di superficie BDCA2 4. <p class="jove_content"&gt; I TLR7 e TLR9 rilevamento percorsi di pDC possono potenzialmente essere modulata negativamente l&#39;impegno di BST2 (anche designato teterina o CD317) con un altro recettore inibitorio superficie pDC-specifica denominata ILT7 5. BST2 è espresso ad alti livelli in superficie di pDC e alcune cellule tumorali, ma a livelli relativamente bassi in altri tipi di cellule, come le cellule B, macrofagi e cellule T. Importante, BST2 può essere indotta da IFN di tipo I in un certo numero di linee di cellule trasformate e in colture cellulari primarie di origini umane e murine 6. Oltre alla sua funzione immunitaria normativo, BST2 stato recentemente trovato per inibire il rilascio di HIV-1 e altri avvolto particelle virali da particelle virali nascenti reticolazione sulla superficie cellula infetta 7. In caso di HIV-1, la proteina accessoria virus codificato U (Vpu) ha dimostrato di agire come antagonista BST2. Si ritiene che Vpu downregulates BST2 dalla superficie cellulare delle cellule HIV-1-infetti, il sito della sua cavezzazione di attività e di conseguenza aumenta rilascio virale e diffondere 7, anche se questa nozione è stata contestata 8,9. In assenza di Vpu, un gran numero di completamente formati e progenie maturo HIV-1 particelle vengono trattenuti sulla superficie cellulare. Se queste particelle frenati potrebbero rappresentare obiettivi efficaci per il rilevamento immunitario rimane ancora una questione aperta. Inoltre, non è chiaro se Vpu potesse dysregulate tipo I la produzione di IFN da pDCs modulando superficie BST2 livelli. I primi studi disegnati per valutare l&#39;HIV-1 di rilevamento sono stati condotti utilizzando privi di cellule HIV-1 particelle, che sono generalmente considerati poveri induttori di tipo I IFN 3,10-12. Dato che gli studi recenti suggeriscono che PBMCs e pDCs efficiente percepiscono sieropositivo linfociti T CD4 + 2,13,14, descriviamo qui un metodo semplice per misurare le risposte innate innescati da pDCs accreditato in cellule HIV-1-infetti in vitro.

<table><tbody><tr><td>Cellule MT4</td><td>Programma di reagenti NIH AIDS</td><td>120</td><td>Questo reagente è stato ottenuto attraverso il programma di reagenti NIH AIDS, Divisione di AIDS, NIAID, NIH: MT-4 dal Dr. Douglas Richman.</td></tr><tr><td>HEK-Blu IFN-&alfa;/&beta; cellule reporter&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>HKB-IFNAB</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Wisent</td><td>350-000-CL</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Bisonte</td><td>080-150</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ficoll-P&acirc; que Plus</td><td>Myltenyi</td><td>17-1440-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di isolamento delle cellule T CD4+ II</td><td>Myltenyi</td><td>130-091-155</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di isolamento delle cellule dendritiche plasmacitoidi diamante II&nbsp;</td><td>Myltenyi</td><td>130-097-240</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PHA-L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O2769</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>Programma di <td>reagenti per l'AIDS NIH</td><td>136</td><td>Questo reagente è stato ottenuto attraverso il programma di reagenti per l'AIDS NIH, Divisione di AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 dal Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Imiquimod</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-IMQS</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ODN 2216 CpG-A</td><td>Hycult Biotec</td><td>HC4037</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IFN umano&alfa;</td><td>Fonte di interferone PBL</td><td>11100-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>QUANTI-Blu&nbsp;</td><td>Cedarlane</td><td>REP-QB2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Citometria a flusso (Anticorpi/reagenti)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione bloccante Fc (composizione sotto):</td><td></td><td></td><td>Nota: fare in soluzione di lavaggio (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS)</td></tr><tr><td>10% Siero di capra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G 9023</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>10% Siero di coniglio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R 9133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>10% Siero di</td><td>topo Sigma-Aldrich</td><td>M 5909</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2,5 mg/ml di IgG umane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I 4506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-CD3_Pacific Blu</td><td>Biolegend</td><td>300417</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-CD14_PE-TxRed</td><td>Life Technologie</td><td>MHCD1417</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-BDCA2_APC</td><td>Myltenyi</td><td>130-090-905</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-ILT7_PE</td><td>Biolegend</td><td>326408</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-CD4_PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>317427</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-BST2_Alexa 660</td><td>eBioscience</td><td>50-3179</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 6148</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtro cellulare</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Strumento ciano ADP&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>CY20030</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

valutare l&#39;innato rilevamento dell&#39;infezione da hiv-1 cd4 infetti<sup&gt; +</sup&gt; cellule t dalle cellule dendritiche plasmacitoidi utilizzando un<em&gt; ex vivo</em&gt; sistema di co-coltura.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 sensing innata richiede il contatto diretto delle cellule T CD4 + infettate con le cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC). Per studiare questo processo, i protocolli descritti usano appena isolate cellule umane mononucleari di sangue periferico (PBMC) o cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) per rilevare infezioni in entrambe le linee di cellule T (MT4) o di cellule eterologhe primarie T CD4 +. Al fine di garantire un corretto sensing, è essenziale che PBMC sono isolati immediatamente dopo il prelievo del sangue e quella percentuale ottimale di cellule T infettate vengono utilizzati. Inoltre, multi-parametrica citofluorimetrica colorazione può essere utilizzato per confermare che i campioni di PBMC contengono le diverse linee cellulari a rapporti fisiologici. Un certo numero di controlli può anche essere incluso per valutare la vitalità e la funzionalità di pDC. Tra questi, la presenza di marcatori di superficie specifici, valutando le risposte cellulari a agonisti nota di Toll-like receptors (TLR) percorsi, e confermando la mancanza di spontanea tipo I interferone (IFN) di produzione. In questo sistema, PBMC o pDCs appena isolate sono co-coltura con HIV-1 le cellule infettate in 96 pozzetti per 18-22 ore. I surnatanti di questi co-colture sono poi utilizzati per determinare i livelli di IFN di tipo I bioattivi monitorando l&#39;attivazione della via ISGF3 in IFN-alfa cellule / beta HEK-blu. Prima e durante condizioni di co-coltura, le cellule bersaglio possono essere sottoposti ad analisi citofluorimetrica per determinare un numero di parametri, tra cui la percentuale di cellule infettate, i livelli dei marcatori di superficie specifica e differenziale uccisione di cellule infette. Anche se, questi protocolli sono stati inizialmente sviluppati per seguire la produzione di tipo I IFN, che potrebbero essere utilizzati per studiare altre molecole imuno-modulatori rilasciati da pDCs e per ottenere ulteriori informazioni sui meccanismi molecolari che regolano l&#39;HIV-1 sensing innata.

Il sistema di co-coltura descritto nella figura 1 consente uno studio controllato di HIV-1 sensing innata. A causa della natura variabile di pile, è importante che le normali rapporti di cellule mieloidi e T (rispettivamente CD14 + e CD3 +) sono osservati, come nell&#39;esempio mostrato nella Figura 2A. Inoltre, solo un basso numero di cellule T attivate (FS superiori e livelli elevati CD3 rispetto alle cellule non attivati ​​T) sono desiderabili nelle PBMC appena isolate culture. PBMC con rapporti anomale tra i vari tipi di cellule sono spesso incapaci di montare una corretta risposta immunitaria innata in vitro, probabilmente a causa di un fenotipo già attivato a seguito di una infezione in corso. Soprattutto, la percentuale relativa di pDC deve essere valutata come mostrato nella Figura 2B. Sebbene tale percentuale può variare da 0,2 all&#39;1,2%, un rilevamento fenotipo anormale è anche osservata con entrambi extremes di questa gamma. Arricchimento di pDCs usando selezione negativa spesso cede 50-95% pDC di purezza, come si è visto nei due esempi nella Figura 2B (92% e 72%). Un esempio tipico per l&#39;esperimento complessiva è illustrata nelle figure 3 e 4. In questo esempio, le cellule sono state infettate con MT4 pNL4.3-GFP_ires_Nef WT o delta Vpu conseguire infezione 30% al momento della co-coltura (Figura 3A). Come descritto in precedenza, solo le infezioni da virus WT determinato un significativo down-regulation dei BST2 superficie (Figura 3B). A causa delle loro differenze di dimensioni e granularità, cellule MT4 possono essere facilmente distinguibili da PBMC mediante citometria di flusso (figura 4A). Dopo l&#39;incubazione co-coltura, solo PBMC in contatto con noti agonisti TLR7 o TLR9 e PBMC in contatto con l&#39;HIV-1 le cellule infettate rilasciate quantità significative di tipo I IFN (Figura 4B). No IFN è stato rilevato in PBMC da solo, in PBMC co-cultured con cellule MT4 mock-infettate, o solo in cellule MT4 infette (Figura 4B). Nell&#39;esempio qui presentato, rilevamento innata di cellule MT4 HIV-1-infetti da PBMC è risultato essere significativamente ridotta in presenza di Vpu. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1:. Schema di disegno sperimentale SUP: surnatante <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2: caratterizzazione fenotipica di PBMC isolati a fresco e enrpDCs iched. (A) la distribuzione normale di cellule mieloidi e cellule T osservate in PBMC isolati da un donatore sano (percentuale di cellule mieloidi dovrebbero variare tra il 10-20% e le cellule T tra il 55-65%). Campione PBMC erano macchiati con anticorpi coniugati fluoroforo che riconoscono CD14 superficie (marcatore linea mieloide) e CD3 (marker delle cellule T). (B) caratterizzazione fenotipica di pDCs. Prima di pDC arricchimento rappresentano tra 0.2-1.2% del numero totale di cellule nelle PBMC (0,99% nell&#39;esempio illustrato). Queste cellule possono essere identificati sulla base di espressione di marcatori specifici, come BDCA2 e ILT7, presenti sulla superficie cellulare. Selezione negativa può essere utilizzato per arricchire significativamente il numero di pDC ed eliminare contaminazioni potenzialmente dannosi, come CD14 + cellule mieloidi (arricchimento raggiungono il 92% e il 72% nei due esempi illustrati). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" target="_blank">Cli</a>ck qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3.jpg" width="500px" /> Figura 3:. Caratterizzazione delle cellule MT4 bersaglio HIV-1-infetti (A) Percentuale di cellule infettate nelle culture MT4 infettate con pNL4.3-GFP_ires_Nef WT o dVpu come determinato dalla percentuale di cellule GFP positive. Espressione di superficie (B) delle cellule BST2 nelle cellule infette è stata valutata dopo colorazione della superficie. Gli istogrammi grigi pieni rappresentano cellule mock-infettate macchiate con il siero di coniglio pre-immune (controllo senza macchia); i restanti istogrammi rappresentano cellule colorate con siero policlonale di coniglio anti-BST2. Istogrammi con linee continue rappresentano il controllo negativo GFP (neg) cellule; mentre istogrammi con linee tratteggiate corrispondono a (pos) positivi cellule infette GFP. Influenza mediaintensità orescence valori (MFI) sono indicati per ogni campione. Citometria a flusso è stato eseguito e analizzato come descritto nella Figura 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4.jpg" width="500px" /> Figura 4:. Cultura Co di PBMC appena isolate e le cellule T infette MT4 (A) Confronto di citometria a flusso profili FS / SS osservati per le cellule T MT4 solo, solo PBMC, o co-colture tra PBMC e cellule MT4 T. A causa delle differenze in termini di dimensioni e granularità, le cellule MT4 T ​​possono essere facilmente distinguibili da PBMC in co-colture in citometria a flusso. (B) Esempio rappresentativo della quantità di tipo I IFN rilasciato dopo stimolazione di PBMC con TLR7 o TLR9 agonisti (fa), o dopo co-culture con finto o le cellule MT4 indicati infettate con pNL4.3-GFP_ires_Nef WT o dVpu. I dati grezzi visualizzati come OD 650 valori e la loro converseion corrispondente per tipo-I concentrazione di IFN espressa in U / ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a>

A differenza privi di cellule HIV-1 particelle, cellule T CD4 + infetti siano effettivamente rilevati dalle cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC). Questo manoscritto descrive un metodo in cui le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) o pDCs isolate sono co-coltura con HIV-1 le cellule T infette di valutare sensing innato da pDCs valutata dal rilascio di tipo I IFN.

Valutare l&#39;innato rilevamento dell&#39;infezione da HIV-1 CD4 infetti<sup&gt; +</sup&gt; Cellule T dalle cellule dendritiche plasmacitoidi Utilizzando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema di co-coltura.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

L'obiettivo generale della procedura seguente è valutare il riconoscimento innato, da parte delle cellule dendritiche plasmocitoidi (PDC), delle cellule T CD4 positive infettate dal virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1). Questo viene ottenuto innanzitutto infettando le cellule T CD4 positive con l'HIV-1. Nel secondo passaggio, le cellule T infette vengono coltivate in co-coltura con le PDC.Dopo 18-22 ore, i soprannatanti delle colture concomitanti vengono recuperati per la quantificazione della produzione di interferone di tipo uno da parte delle PDC. In definitiva, la produzione di interferone di tipo uno può essere utilizzata per valutare la sensibilità del sangue umano, nonché delle PDC isolate, all'infezione da HIV-1 mediata dalle cellule T CD4-positivo. Questo metodo potrebbe rivelarsi utile per lo studio dei fattori virali e dell'ospite che regolano la risposta immunitaria innata precoce nel riconoscimento del patogeno, come ad esempio il riconoscimento delle cellule T CD4 infettate da HIV-1 da parte delle cellule plasmacitoidi citotossiche.Sebbene questi protocolli siano finalizzati alla misurazione dell'interferone di tipo uno, possono essere facilmente modificati per rilevare altre molecole bioattive rilasciate dalle cellule presentanti antigeni (PC) in seguito al riconoscimento di linfociti T infetti, come l'interferone gamma, il TNF alfa o le chinasi. Per l'infezione dei linfociti T primari positivi per il CD4, iniziare attivando i linfociti T positivi per il CD4 isolati dal sangue periferico umano con PHA per 48 ore. Mantenere le cellule in mezzo completo, integrato con IL-2 ricombinante, per almeno tre giorni prima dell'infezione. Successivamente, in un laboratorio di sicurezza biologica di livello tre, infettare i linfociti T con virus HIV-1 utilizzando diverse molteplicità di infezione, a due giorni dall'infezione.Valutare le colture cellulari per l'espressione di GFP BST due e CD quattro. Utilizzare esclusivamente colture con una positività al GFP compresa tra il 20 e il 50% per gli esperimenti di co-coltura in un impianto di livello di sicurezza biologica due. Successivamente, isolare le cellule mononucleate da un campione di sangue periferico umano mediante centrifugazione su gradiente di densità entro mezz'ora dal prelievo del sangue.Quindi colorare le cellule con gli anticorpi appropriati per confermare che le linee cellulari desiderate siano state isolate in rapporti fisiologici. Lavorare rapidamente per mantenere le cellule fredde. Utilizzare un kit di selezione negativa per PDC per arricchire le PDC all'interno dei PBMC isolati, seguendo le raccomandazioni del produttore.Quindi confermare la percentuale di purezza dell'arricchimento e le quantità relative dei marcatori specifici della superficie dei PDC, come ILT7 e BDCA2, mediante citofluorimetria. I campioni arricchiti dovrebbero contenere almeno il 40% di PDC. Successivamente, effettuare una co-coltura di 220 microlitri di cellule sensoriali con 30 microlitri di linfociti T infetti per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti con fondo a U. Includere pozzetti di controllo contenenti solo le cellule sensoriali o le cellule bersaglio, aggiustando questi pozzetti a un volume finale di 250 microlitri con mezzo completo. Per valutare la risposta dei PDC ad agonisti noti dei recettori tipo toll, aggiungere un agonista del TLR7 o del TLR9 nei pozzetti appropriati e incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 18-22 ore.Al termine della coltura co-coltivata, trasferire le cellule in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V e centrifugare la piastra per cinque minuti a 400 G e temperatura ambiente. Successivamente, trasferire i soprannatanti in una piastra a 96 pozzetti con fondo piatto. Ri-sospendere i pellet cellulari in paraformaldeide al 2% e analizzarli mediante citometria a flusso, utilizzando dimensioni e granulosità per distinguere le cellule in un grafico di scattering anteriore rispetto a quello laterale.Per misurare l'interferone di tipo uno bioattivo utilizzando cellule reporter hcbl per interferone alfa beta, piastrare innanzitutto le cellule reporter a una densità di 50.000 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti con fondo piatto, fino a un volume finale di 180 microlitri. Quindi aggiungere 20 microlitri del sopranatante di co-coltura appena raccolto in ogni pozzetto in duplicato, includere un set di controlli standard interni e incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 18-22 ore per determinare i livelli di fosfatasi alcalina rilasciati dalle cellule reporter. Aggiungere 180 microlitri di soluzione Quantum Blue in ogni pozzetto di una nuova piastra con fondo piatto. Successivamente, aggiungere 20 microlitri dei sopranatanti delle cellule HEC PLU interferone alfa beta indotte in ogni pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius fino allo sviluppo del colore nei pozzetti di controllo con interferone standard.La soluzione blu quantica cambia dal rosa al blu porpora in presenza dell'enzima. Infine, utilizzare uno spettrofotometro per valutare i livelli di fosfatasi alcalina secreta a 620-655 nanometri e determinare la concentrazione di interferone di tipo uno mediante estrapolazione dalla parte lineare della curva standard dell'interferone. A causa della natura variabile delle cellule primarie, è importante osservare i rapporti normali tra cellule mieloidi CD14 positive e cellule T CD3 positive, come mostrato in questi istogrammi rappresentativi.Inoltre, è auspicabile un numero ridotto di linfociti T attivati, identificati per lo scattering anteriore più elevato e per i livelli di CD tre, nelle colture di PBMC appena isolate. Di fondamentale importanza è la determinazione della percentuale relativa di PDC, sebbene questa percentuale possa variare dallo 0,2 all'1,2%. Un fenotipo di rilevamento anomalo è osservato anche in corrispondenza di entrambi gli estremi di questo intervallo. L'arricchimento dei PDC mediante selezione negativa spesso consente di ottenere una purezza del 50-95% dei PDC, come mostrato in questi due diagrammi a dispersione rappresentativi provenienti da donatori diversi.Un esempio prototipico dell'esperimento complessivo è illustrato nelle prossime figure. In questo studio rappresentativo, le cellule MT4 sono state infettate con P e l 4,3 GFP, IRIS NF di tipo selvaggio o delta VPU per ottenere una percentuale di infezione del 30% al momento della co-coltura.Come descritto in precedenza, solo le infezioni con il virus di tipo selvaggio hanno determinato un'importante downregolazione della BST-2 di superficie. A causa delle differenze di dimensioni e granulosità, le cellule MT-4 possono essere facilmente distinte dai PBMC mediante citometria a flusso dopo il co-coltura. Solo i PBMC in presenza di noti agonisti del TLR7 o del TLR9, oppure i PBMC a contatto con cellule infettate da HIV-1, hanno rilasciato quantità significative di interferone di tipo I. Nessun interferone è stato rilevato nei PBMC da soli, nel co-coltura di PBMC con cellule MT-4 infettate in modo fittizio (mock-infettate) o nelle cellule MT-4 infettate da sole. Nell'esempio qui presentato, il riconoscimento innato da parte dei PBMC di cellule MT-4 infettate da HIV-1 è risultato significativamente ridotto in presenza della proteina Vpu.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di prevenire tutte le possibili fonti di contaminazione. Utilizzare sempre soluzioni prive di endotossine. Ricordarsi di verificare regolarmente la presenza di contaminazioni da micoplasmi e coltivare le cellule senza l'aggiunta di antibiotici, poiché anche infezioni batteriche controllate possono essere rilevate dai PBMC.Non dimenticare che le cellule PC sono molto fragili. Hanno una vita limitata e la loro reattività può essere compromessa se la procedura non viene eseguita tempestivamente.

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