Anti-Nuclear Antibody screening utilizzando cellule Hep-2

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di utilizzare un test di immunofluorescenza indiretta per lo screening degli anticorpi anti-nucleari. Ciò si ottiene incubando il siero del paziente con vetrini di substrato hep two. Il siero del paziente non legato viene lavato via, gli autoanticorpi legati vengono quindi incubati con un coniugato specifico marcato con fluoresceina e il reagente non legato viene lavato via.

Se osservati attraverso un microscopio a fluorescenza, i campioni positivi agli autoanticorpi mostreranno una fluorescenza verde mela corrispondente alle aree della cellula o dei nuclei in cui l'autoanticorpo si è legato in un modello di fluorescenza indicativo della presenza dell'antigene. In definitiva, la presenza di arna può essere utilizzata per aiutare nella diagnosi delle malattie del tessuto connettivo. Il vantaggio principale del metodo di immunofluorescenza indiretta rispetto ad altri metodi, come l'Eliza in fase solida, è che il substrato di due cellule Hep contiene oltre 100 antigeni espressi nella loro configurazione nativa.

Ciò consente l'identificazione di quasi tutti gli anticorpi O clinicamente rilevanti, cosa che non è possibile con le tecniche solid face poiché il metodo dell'immunofluorescenza indiretta è una tecnica molto specializzata. Le persone che non conoscono questo metodo hanno bisogno di tempo e pratica per diventare abili nella procedura di elaborazione dei vetrini. Anche l'interpretazione delle immagini al microscopio e l'apprendimento dell'identificazione di modelli rilevanti sono un'abilità che richiede tempo per essere padroneggiata.

Con i reagenti e gli strumenti giusti, i risultati sono più coerenti e più facili da interpretare. A dimostrare la procedura sarà Cassandra Bryant, una tecnologa dell'Immunofluorescent Asay Development Laboratory. Rimuovere i reagenti dalla confezione e lasciare che ogni articolo raggiunga la temperatura ambiente, preparare i reagenti e diluire il siero del paziente in base alla direzione in cui i vetrini dell'inserto sono codificati a barre e possono essere facilmente integrati in sistemi automatizzati.

Questa procedura illustra l'elaborazione manuale dei vetrini. I laboratori ad alta produttività, tuttavia, possono optare per apparecchiature automatizzate per l'elaborazione dei vetrini con funzionalità di scansione dei codici a barre. Gli strumenti Inova sono collegati tramite una rete centralizzata e intelligente che fornisce il controllo sui risultati del flusso di lavoro e sulla reportistica.

Per l'IFA. Ciò si traduce in un'identificazione positiva del paziente grazie all'elaborazione e all'eliminazione della trascrizione e degli errori correlati. Erogare una goccia di controllo positivo e una goccia di controllo negativo sul vetrino appropriato.

Pozzetti pipettare da 20 a 25 microlitri di siero paziente diluito nei pozzetti rimanenti. Elaborare un vetrino alla volta. Posizionare il vetrino in un contenitore colorante con un tovagliolo di carta umido sul fondo, coprire il contenitore e incubare il vetrino per 30 minuti.

Le condizioni di umidità impediranno al substrato di seccarsi, il che potrebbe causare macchie artificiali. Durante questo periodo di incubazione, gli anticorpi anti-nucleo nel siero del paziente si legheranno agli antigeni delle cellule che sono fissati su ciascun pozzetto. Dopo il periodo di incubazione, risciacquare il siero con un getto delicato di tampone di lavaggio per evitare di danneggiare il substrato.

Inclinare leggermente il vetrino in modo che il flusso non sia puntato direttamente sul substrato. Questo orientamento dei vetrini aiuterà anche a prevenire il crossover dei campioni tra i pozzetti. Picchiettare il tampone di lavaggio in eccesso e posizionare il vetrino in un barattolo Copeland contenente tampone di lavaggio.

Il tempo di incubazione per la fase di lavaggio dovrebbe essere di circa cinque minuti. Rimuovere i vetrini dal tampone di lavaggio e picchiettare delicatamente. Per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso, applicare una goccia di coniugato fluorescente su ciascun pozzetto.

Per un test NA, si raccomanda l'uso di un coniugato specifico per IgG FC. Incubare i vetrini per 30 minuti nel contenitore umidificato e assicurarsi di riposizionare il coperchio colorante. Il coniugato è sensibile alla luce e il coperchio proteggerà i vetrini dall'esposizione alla luce.

Durante questo periodo di incubazione, il coniugato si legherà agli anticorpi anti-nucleo del paziente che si sono legati agli antigeni cellulari. Questo legame coniugato provoca la presenza di fluorescenza nei pozzetti dopo l'incubazione. Lavare il vetrino con un tampone di lavaggio.

Come in precedenza, posizionare un vetrino coprioggetto su un tovagliolo di carta e applicare il supporto di montaggio in linea continua sul bordo inferiore del vetrino coprioggetti. Rimuovere ogni vetrino dal tampone di lavaggio e picchiettare delicatamente il vetrino. Per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso, toccare il bordo inferiore del vetrino con il bordo del vetrino coprioggetto.

Abbassare delicatamente il vetrino sul vetrino coprioggetti in modo tale che il mezzo di montaggio sul vetrino coprioggetti scorra verso il bordo superiore del vetrino senza che il coperchio della bolla d'aria scivoli, compresa la quantità ottimale di supporto di montaggio è una tecnica che richiede pratica per una visione perfetta. Vetrini con un microscopio a fluorescenza situato in una camera oscura, la scansione dell'intero pozzetto deve essere eseguita con un obiettivo 20x o 25x. Per valutare la distribuzione cellulare e l'uniformità della fluorescenza, passare a un obiettivo 40x.

Per dare l'interpretazione finale riguardo alla positività e al modello, guarda i controlli positivi e negativi. Il controllo negativo potrebbe non apparire completamente scuro, ma spesso mostrerà un basso livello di fluorescenza non specifica. Il controllo positivo mostrerà una fluorescenza verde mela brillante nel nucleo.

La positività può essere classificata utilizzando una scala di valutazione della reattività da uno più a quattro più. Oltre all'interpretazione manuale, i vetrini possono essere caricati e scansionati dal microscopio a fluorescenza automatizzato. Non è necessaria alcuna camera oscura.

Dopo aver creato un progetto selezionando il tipo di vetrino appropriato, lo strumento acquisisce e memorizza immagini digitali ad alta risoluzione delle cellule in ciascun pozzetto. Inoltre, Nova view misura l'intensità della luce fluorescente e classifica i risultati come positivi o negativi e fornisce il riconoscimento dei modelli per i campioni positivi. Le immagini vengono visualizzate dall'operatore su un monitor di computer ad alta risoluzione, consentendo l'interpretazione finale, la revisione e la conferma di Nova View.

I report dei risultati possono essere generati in base ai risultati confermati. Il legame degli autoanticorpi sulle strutture proteiche costituenti all'interno del nucleo si traduce in cinque principali modelli nucleari, tra cui il centromero omogeneo e maculato, il punto nucleolare e il punto nucleare. Per identificare un modello omogeneo come mostrato qui, identificare le cellule mitotiche o in divisione.

Le cellule mitotiche mostrano una fluorescenza solida e uniforme, che è spesso più pronunciata rispetto alle cellule a riposo. I nuclei delle cellule a riposo devono essere uniformi con colorazione diffusa. Questo modello caratteristico è molto probabilmente il risultato di autoanticorpi contro il DNA a doppio filamento.

Una caratteristica chiave del modello maculato è l'aspetto a fessura delle monete delle cellule mitotiche in metafase. La regione cromosomica di queste cellule è negativa. Le cellule a riposo mostrano un modello di macchie in tutti i nuclei.

La macchiettatura può essere definita grossolana o fine. La speckling del decorso è il risultato di autoanticorpi contro SM e RNP. La macchiettatura fine può essere dovuta agli autoanticorpi contro S-S-A-S-S-B e all'RNA polimerasi.

Il modello DFS è indicato come denso, finemente macchiato ed è indicativo di anticorpi auto contro DFS 70. Le cellule mitotiche mostrano una colorazione maculata, mentre le cellule a riposo mostrano macchie fini uniformemente distribuite in tutto il nucleo. In questi casi, devono essere eseguiti test di conferma poiché gli autoanticorpi DFS 70 sono prevalenti negli individui sani rispetto ai pazienti con malattia del tessuto connettivo.

Per identificare il pattern del centromero, scansionare i pozzetti e identificare le cellule mitotiche o in divisione. Le cellule in divisione hanno numerose macchie discrete in stretta associazione l'una con l'altra, spesso chiamate barra di metafase. Le cellule a riposo mostrano circa 40-60 macchie discrete distribuite in tutto il nucleo.

Il pattern del centromero è associato agli autoanticorpi contro le proteine del centromero con il pattern nucleolare. La colorazione della regione cromosomica nelle cellule mitotiche è variabile. Il modello nucleolare è associato a una colorazione omogenea o maculata dei nuclei, insieme a una colorazione debole, maculata o omogenea del nucleoplasma dei nuclei cellulari a riposo.

Questo modello è associato agli autoanticorpi contro l'RNA polimerasi tre fibrillina e gli anticorpi PM SCL. Il modello di punti nucleari è associato a metafase negativa, cellule mitotiche e pochi punti discreti nei nuclei delle cellule a riposo. Questo modello caratteristico è spesso il risultato di autoanticorpi contro SP 100 PML o P 80 colan.

Questi anticorpi sono associati alla cirrosi biliare primitiva e all'epatite autoimmune. Nell'immagine mostrata, il modello di punti nucleari mostra una colorazione citoplasmatica dovuta agli autoanticorpi contro gli antigeni mitocondriali. Il rilevamento degli anticorpi antinucleari e il riconoscimento dei modelli sono uno strumento importante per facilitare la diagnosi dei pazienti.

La comprensione del significato dei vari modelli consente ai medici e al personale di laboratorio di eseguire test di follow-up appropriati. I fattori più importanti per identificare correttamente i modelli di anticorpi anti-nucleo sono la selezione di un substrato cellulare di alta qualità e l'elaborazione dei vetrini con una buona tecnica costante. La lettura dei vetrini viene tradizionalmente eseguita mediante microscopia a fluorescenza in camere buie ed è eseguita da tecnici qualificati che hanno familiarità con i vari modelli nel contesto del ciclo cellulare e della morfologia cellulare.

Negli ultimi anni, sono stati sviluppati sistemi di imaging digitale per la lettura automatizzata delle diapositive, tali strumenti hanno automatizzato il flusso di lavoro e aumentano la coerenza della lettura e dell'interpretazione. Inoltre, con l'uso di vetrini con codice a barre, la tracciabilità dei campioni durante tutto il processo elimina potenziali errori di trascrizione e aumenta l'integrità dei dati e la sicurezza del paziente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire ogni fase della procedura di immunofluorescenza indiretta e di come identificare i modelli di anticorpi antinucleari clinicamente rilevanti.