Name: Misurazione dei cambiamenti nella sensibilità tattile nella zampa posteriore dei topi utilizzando un apparecchio elettronico di von Frey (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Impara a misurare la sensibilità meccanica nella zampa posteriore dei topi utilizzando l'apparecchio elettronico di von Frey. Questo metodo permette valutazioni rapide e precise delle soglie di ritiro nel dolore infiammatorio.

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NIH R15 NS067536-01A1 (a DC) e il Macalester College Wallace Research Fund (a DC) hanno sostenuto questi studi. La Macalester College Library ha sostenuto la pubblicazione ad accesso aperto di questo articolo. Inoltre, ringraziamo gli attuali ed ex membri del laboratorio Chatterjea per il loro sostegno.

Il Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) del Macalester College ha approvato tutti i protocolli. Per questi esperimenti sono stati utilizzati topi svizzeri ND4 maschi di 8-12 settimane.
1. Preparazione e iniezione del veleno di Bothrops jararaca
<ol>
	<li>ATTENZIONE: Il veleno di B. jararaca è tossico. Indossare guanti, maschera e protezione per gli occhi quando si maneggia la polvere e si preparano le soluzioni.</li>
	<li>Somministrare 45 μg/kg di veleno di B. jararaca (regime determinato da precedenti esperimenti dose-risposta) o un veicolo salino allo 0,9% (10 μl) tramite iniezione intraplantare in entrambe le zampe posteriori utilizzando siringhe da insulina da 3/10 ml con aghi da 29 G x 1/2. Nota: A seconda del disegno sperimentale, le soluzioni di trattamento e di controllo possono essere iniettate separatamente rispettivamente in ciascuna zampa posteriore per fornire controlli interni all'interno di ciascun soggetto.</li>
</ol>
2. Configurazione e funzionamento dell'apparato elettronico von Frey
<ol>
	<li>Posizionare l'unità elettronica von Frey sul supporto della sonda. Assicurarsi che la sonda e il cavo siano collegati correttamente all'unità display e accendere lo strumento. Impostare il valore di lettura su zero (0,00 g) nella modalità di configurazione e posizionare delicatamente il peso di prova fornito (5,00 g) sul cono della sonda von Frey.</li>
	<li>Registrare la lettura su un quaderno di laboratorio e ripetere questa procedura al termine della sessione di test. Se si verifica una discrepanza superiore a 0,20 g tra le letture del peso di prova prima e dopo la sessione di prova, o se la lettura fluttua una volta applicato il peso di prova, potrebbe essere necessaria una nuova calibrazione dell'apparecchio (da parte del produttore).</li>
	<li>Per valutare la soglia di ritiro della zampa posteriore del topo, utilizzare l'apposita punta in polipropilene tra quelle fornite con la sonda. La scelta della punta dipende dal tessuto da sondare. Le punte rigide funzionano bene per il tessuto della zampa posteriore meno sensibile e più duro, mentre le punte semi-flessibili possono essere una scelta migliore per un'area più tenera come la cresta ano-genitale (Chatterjea, non pubblicato). Montare delicatamente la punta rigida sul cono della sonda.</li>
	<li>Per registrare la pressione massima applicata, commutare la modalità di funzionamento da impostazione a funzionamento in modo tale che la pressione massima applicata venga registrata sul display. In questa modalità, la lettura della pressione massima applicata verrà salvata sullo schermo del display quando la sonda viene retratta.</li>
</ol>
3. Considerazioni generali per la valutazione della soglia di ritiro della zampa posteriore
<ol>
	<li>Idealmente, sono necessari due ricercatori per misurare la soglia di ritiro della zampa posteriore (sensibilità meccanica) utilizzando un apparecchio EvF: uno per far funzionare l'apparato ed eseguire le misurazioni e un altro per trascrivere le misurazioni registrate e maneggiare i topi.</li>
	<li>Al fine di ridurre le distorsioni, lo sperimentatore che utilizza l'apparecchiatura deve essere all'oscuro dei trattamenti e dei valori soglia di sospensione registrati. Inoltre, per garantire la coerenza tra le misurazioni, la stessa persona dovrebbe valutare tutte le soglie di prelievo di base e sperimentali.</li>
	<li>Eseguire tutte le misurazioni in una stanza silenziosa e a temperatura controllata e alla stessa ora del giorno14.</li>
	<li>Lo sperimentatore che registra le misurazioni dovrebbe posizionare ciascun topo in camere individuali di alloggiamento multiunità di polimetilmetacrilato (PMMA) posizionate su un supporto da pavimento a rete. Copri le camere con coperchi perforati in PMMA e posiziona sopra un oggetto pesante per evitare che i topi fuoriescano. Posizionare del materiale assorbente sotto il supporto per assorbire/raccogliere i rifiuti escreti. Lasciare che i topi si acclimatino per 15 minuti nelle camere prima della valutazione della soglia di prelievo basale o sperimentale 6,7,10.</li>
	<li>Le zampe posteriori dei topi devono essere facilmente accessibili attraverso le aperture del pavimento in rete; quindi, posizionare il supporto da pavimento in rete ad un'altezza comoda su un carrello con freni o su un piano di lavoro stabile accessibile da tutti i lati.</li>
	<li>Durante le misurazioni, i topi potrebbero dover essere distratti con un pellet di cibo15 posizionato appena fuori dalla camera di misurazione o un rumore molto leggero prodotto picchiettando o facendo scorrere una penna lungo la rete metallica del pavimento della camera prima, ma non durante, la misurazione. Questo induce il mouse a rimanere fermo, consentendo allo sperimentatore di iniziare a effettuare le misurazioni più facilmente.</li>
</ol>
4. Valutazione della soglia di ritiro della zampa posteriore di base
<ol>
	<li>La prima serie di misurazioni di base deve essere eseguita 48 ore prima della somministrazione del trattamento. Azzerare la sonda al montaggio della punta rigida. Usando due mani, sollevare lentamente la sonda per stimolare il centro (area del poggiapiedi) della zampa posteriore sinistra o destra (se entrambe le zampe hanno ricevuto lo stesso trattamento).</li>
	<li>Aumentare gradualmente la pressione fino a quando non si osservano comportamenti di risposta nocicettiva definiti come la retrazione della zampa posteriore, il leccamento della zampa posteriore o il salto a quattro zampe6,10. Istruire l'altro investigatore a trascrivere la pressione che ha suscitato il comportamento osservato.</li>
	<li>Misurare la soglia di prelievo del topo situato nella camera adiacente. Continua fino a quando non hai valutato una volta le soglie di prelievo di ciascun topo. Ripetere altre quattro volte, in modo che ogni mouse venga misurato 5 volte come descritto in precedenza10.</li>
	<li>Per ogni topo, calcola il valore mediano delle 5 misurazioni, quindi calcola quanto ogni valore si discosta dalla mediana. Seleziona 3 valori che si discostano meno e calcolane la media per ottenere una soglia di prelievo di base come descritto in precedenza10. In questa dimostrazione, la misurazione è stata standardizzata utilizzando 3 valori su 5; Sebbene il numero specifico di misurazioni possa variare in base al disegno sperimentale, è importante assicurarsi che tutti i topi vengano colpiti un numero uguale di volte per valutare le linee di base.</li>
	<li>Ripetere le misurazioni di base 24 ore dopo. Effettuare 5 misurazioni per topo e fare la media delle 3 più vicine alla mediana per ottenere una soglia di astinenza di base.</li>
	<li>Per calcolare la soglia di astinenza media al basale di un topo, calcolare la media delle soglie di astinenza al basale prese a 48 e 24 ore prima del trattamento. Se la soglia media di astinenza al basale è inferiore a 3,50 g, o se le due soglie al basale differiscono di 2,00 g o più, escludere il topo dall'esperimento. Questi criteri assicurano che tutti i topi nell'esperimento abbiano risposte di base coerenti e soglie di sospensione di base sufficientemente alte che consentano di osservare soglie più basse dopo il trattamento.</li>
	<li>Nota: la soglia di esclusione dipenderà dal tessuto da sondare, dal ceppo degli animali studiati e dal tipo di punta utilizzata. Ad esempio, abbiamo scoperto che 3,5 g sono un utile punto di riferimento per il tessuto ND4 della zampa posteriore, ma le aree più dolenti come la cresta ano-genitale necessitano di una soglia di esclusione più bassa (Chatterjea, non pubblicato).</li>
	<li>Assegnare i topi ai gruppi di trattamento in modo che la linea di base media di astinenza dei gruppi sperimentali sia il più simile possibile prima della somministrazione dei trattamenti.</li>
</ol>
Nota: le misurazioni di base possono essere eseguite prima di 48 ore prima di un esperimento. Tuttavia, devono essere completate almeno 2 serie di misurazioni di base a intervalli regolari prima dell'inizio dei trattamenti.
5. Valutazione sperimentale della soglia di ritiro della zampa posteriore
<ol>
	<li>Valutare la soglia di ritiro della zampa posteriore (sensibilità meccanica) dopo il trattamento nei punti temporali appropriati determinati dal disegno dell'esperimento. Riportare i topi nelle loro gabbie con accesso a cibo e acqua subito dopo il completamento delle misurazioni.</li>
	<li>Segui i passaggi descritti sopra; prendi 3 invece di 5 misurazioni per ridurre la possibilità di sovrastimolare il tessuto della zampa posteriore (trattata), soprattutto se la sensibilità deve essere valutata in più punti temporali. Se due misurazioni su tre effettuate differiscono di oltre 2,00 g, eseguire una quarta misurazione.</li>
	<li>Calcolare la media di 3 misurazioni per ottenere la soglia di astinenza sperimentale per ciascun topo. Per tutti i topi per i quali sono state effettuate 4 misurazioni, calcolare la media di tre che si discostano meno dalla mediana, al fine di ottenere la soglia di ritiro sperimentale.</li>
	<li>Per ottenere la soglia di sospensione delta per ciascun topo in un determinato momento, sottrarre il basale dalla soglia di sospensione sperimentale. Ripetere per tutti i topi e tutti i punti temporali sperimentali9.</li>
	<li>Eseguire opportune analisi statistiche sui dati raccolti. In questo caso abbiamo utilizzato JMP 9.0 (SAS, Cary, NC) per eseguire l'analisi post hoc dell'ANOVA unidirezionale e dell'HSD di Tukey.</li>
</ol>

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<li>Zychar, B. C., Dale, C. S., Demarchi, D. S., Gonçalves, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+metalloproteases%2C+serine+proteases+and+phospholipases+A2+to+the+inflammatory+reaction+induced+by+Bothrops+jararaca+crude+venom+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Contribution of metalloproteases, serine proteases and phospholipases A2 to the inflammatory reaction induced by Bothrops jararaca crude venom in mice.</a> Toxicon. 55 (2-3), 227-234 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da rivelare.

La misurazione dei cambiamenti nelle risposte di astinenza è uno strumento importante utilizzato per valutare i cambiamenti nella sensibilità tattile nei modelli di dolore e infiammazione dei roditori. Qui dimostriamo l'utilità di un apparato elettronico di von Frey per eseguire questa valutazione. Ci sono diversi vantaggi in questa tecnica: i) possiamo valutare rapidamente le risposte di astinenza alla pressione applicata per più topi in più punti temporali abbastanza vicini tra loro, ii) possiamo usare una singola punta per applicare una pressione continua e specifica a una piccola area di tessuto, iii) possiamo misurare con precisione la pressione precisa applicata per ottenere una risposta di ritiro, e iv) possiamo facilmente implementare solidi limiti di base, criteri di esclusione e controlli interni per garantire che le valutazioni comportamentali siano il più precise e obiettive possibile.
I passaggi critici per garantire i migliori risultati per un test EvF sono la calibrazione preventiva dello strumento e le pratiche di misurazione coerenti. Come dettagliato nella sezione del protocollo, lo strumento deve essere maneggiato con cura e deve essere garantita un'adeguata calibrazione prima e durante l'uso. Prima di effettuare qualsiasi misurazione, le letture del peso di prova devono essere confermate per garantire un funzionamento ottimale della macchina. Se le letture fluttuano in modo significativo o se le letture del peso di prova non sono accurate, è necessario contattare prontamente il produttore per tarare l'apparecchiatura. Con questo in mente, è consigliabile, se possibile, disporre di un apparato elettronico di von Frey di riserva per non compromettere gli esperimenti sensibili al tempo a causa di un'imprevista necessità di calibrazione dello strumento. Inoltre, un singolo ricercatore ben addestrato dovrebbe prendere tutte le misurazioni di base e sperimentali per un determinato studio o serie di esperimenti, rimanendo all'oscuro dei gruppi di trattamento. I topi devono essere valutati in una stanza tranquilla, tenuti a una temperatura costante, acclimatati alle camere EvF per almeno 15 minuti ma non trattenuti nella camera più a lungo del necessario (soprattutto se vengono effettuate più misurazioni in un solo giorno) in modo da ridurre al minimo lo stress e le variazioni comportamentali indotte dal disagio.
Le misure EvF offrono miglioramenti significativi rispetto alle tecniche CvF esistenti. I ricercatori possono applicare una pressione continua e non devono passare da una punta all'altra di vari pesi come avviene negli esperimenti sui filamenti CvF6. Questo porta a un minor numero di colpi sul tessuto, il che è particolarmente rilevante in caso di tessuto infiammato o ferito. È possibile misurare la pressione precisa alla quale si verifica il ritiro rispetto alle misurazioni di prelievo del 50% che sono anche limitate dai pesi dei filamenti disponibili utilizzati nelle misurazioni CvF13. Poiché è possibile implementare criteri di esclusione razionali e uniformi (come discusso sopra), i topi possono essere assegnati a gruppi sperimentali in modo tale che tutti i gruppi abbiano linee di base medie simili all'inizio dell'esperimento. Le misurazioni EvF valutano i cambiamenti nella risposta comportamentale a un dato stimolo e non le risposte assolute stesse. Pertanto, il cambiamento di ciascun topo nella risposta nocicettiva è misurato come la differenza tra i suoi singoli ritiri sperimentali e quelli al basale, fornendo così controlli interni per ogni misurazione effettuata.
Forse il limite più significativo dell'EvF è che, in modo simile alla sua controparte manuale, lo stesso ricercatore deve effettuare tutte le misurazioni per una particolare serie di misurazioni di base e sperimentali. Ciò rende l'aumento della tecnica impegnativo dal punto di vista del tempo, del personale e delle attrezzature. Scopriamo che ~20 topi alla volta (a seconda della configurazione delle camere di saggio) possono essere misurati in 30-45 minuti o meno in più punti temporali, a condizione che ci siano almeno 45 minuti tra le misurazioni. Una considerazione correlata a questo proposito è la curva di apprendimento dei singoli sperimentatori. La coerenza interna deve essere stabilita prima che un singolo ricercatore possa intraprendere un esperimento su larga scala e ciò richiede molte ore di pratica dedicata che coinvolgono misurazioni ripetute della risposta di base fino al raggiungimento della coerenza desiderata. Inoltre, l'utilizzo dei cutoff di base implica che non tutti i topi di base per un esperimento possono essere inclusi; Scopriamo che il 25-30% dei topi al basale per esperimento sono tipicamente esclusi.
In termini di modifiche e applicazioni future, le misurazioni comportamentali dell'EvF aggiungono una potente dimensione a un'ampia gamma di modelli di infiammazione per analizzare il dolore acuto e/o cronico concomitante che può essere alla base di patologie infiammatorie. Nell'avvelenamento, abbiamo scoperto che cambiamenti pronunciati e rapidi nella sensibilità tattile accompagnavano gli esiti attesi di gonfiore tissutale, reclutamento leucocitario e degranulazione dei mastociti nelle zampe posteriori di topi maschi ND4. Questi risultati corroborano le precedenti osservazioni sui contributi dei mediatori dei mastociti alla sensibilità termica nei ratti20 e alla sensibilità meccanica indotta dal veleno di B. jararaca nei topi svizzeri ND4 misurati utilizzando CvF21. Il protocollo EvF può essere facilmente modificato per l'uso su tessuti diversi dalla zampa posteriore , ad esempio l'addome7 e la cresta ano-genitale8 , dove il CvF è attualmente utilizzato. I modelli di roditori di allergie, guarigione delle ferite, neuropatie e altre patologie possono essere facilmente adattati per includere misure di sensibilità meccanica nei tessuti che includono e oltre la zampa posteriore.
In sintesi, l'EvF è una tecnica utile ed efficace che aggiorna un approccio classico di misurazione della nocicezione nei roditori ed è un nuovo importante strumento per sondare i complessi meccanismi alla base del dolore in un'ampia gamma di modelli di malattia.

Le malattie croniche non trasmissibili sono responsabili di una quota sproporzionata del carico umano di mortalità e morbilità1. Il dolore cronico è sempre più riconosciuto come una componente importante del carico globale di malattia2. Ciò ha dato un grande impulso alle innovazioni nella prevenzione, nella gestione e nel trattamento del dolore. Allo stesso tempo, ci sono abbondanti prove che la biologia sottostante al dolore è il complesso3. I meccanismi alla base del dolore protettivo, disadattivo e cronico indicano un'intricata interazione tra il sistema immunitario e quello nervoso3,4. La delucidazione di questi meccanismi richiede approcci sperimentali quantitativi rigorosi e riproducibili, dalla dissezione molecolare all'analisi comportamentale.
I modelli di roditori sono stati preziosi nella caratterizzazione degli attori molecolari del dolore infiammatorio e neuropatico5. La riduzione del tempo e dell'intensità delle risposte precedentemente specificate agli stimoli nocivi viene utilizzata per misurare gli stati di dolore in questi animali, poiché i soggetti roditori non sono altrimenti in grado di riportare una sensazione di dolore6. Le risposte alterate alla temperatura e alla pressione sono comunemente usate come metriche della sensibilità tissutale nei modelli di roditori di nocicezione infiammatoria che può essere causata da infezione7,8, esposizione chimica6, 9,10, incisione chirurgica11, nonché dolore neuropatico causato dalla legatura dei nervi12.
La sensibilità meccanica, o risposta agli stimoli di pressione, viene spesso misurata utilizzando i classici filamenti di von Frey (CvF) - una serie (ad esempio 0,4-15 g13) di punte pesate applicate manualmente per testare il tessuto in incrementi seriali fino a quando i comportamenti del dolore non sono indotti nei controlli rispetto ai soggetti sperimentali. Esistono vari metodi per utilizzare queste punte o peli per valutare la sensibilità meccanica6,13; Il metodo più frequentemente utilizzato è il seguente. Una punta con una certa pressione (all'interno della serie; ad esempio 2 g13) viene selezionato come punto di partenza e la soglia di ritiro del 50% di un ratto o di un topo (l'intensità dello stimolo richiesta per produrre una risposta il 50% delle volte in cui la punta viene applicata al tessuto) viene determinata spostandosi verso l'alto e verso il basso del peso della punta in base alla visualizzazione di comportamenti di risposta precedentemente specificati13. Le soglie assolute di astinenza del 50% per i gruppi di trattamento vengono quindi confrontate tra i punti temporali basali e post-trattamento. Questa tecnica manuale richiede molto tempo. Oltre all'aumento del tempo trascorso da ciascun soggetto confinato in una camera di von Frey, questo aumenta anche il numero di volte in cui le punte di prova di vari pesi vengono applicate al tessuto infiammato causando un maggiore disagio ai roditori nello studio. Inoltre, vengono calcolate e confrontate soglie di prelievo del 50% tra gruppi di roditori; Le risposte individuali dei soggetti sperimentali non sono tipicamente normalizzate alle loro risposte basali individuali non trattate con, per quanto ne sappiamo, un'eccezione6. Di conseguenza, i soggetti roditori non vengono solitamente segnalati come assegnati ai gruppi di trattamento sulla base di risposte di base coerenti all'interno di un intervallo precedentemente determinato e nemmeno i singoli soggetti vengono valutati sulla base di una serie di criteri di esclusione applicati in modo coerente che consentono di standardizzare le risposte di base per qualsiasi particolare serie di studi e saggi.
Qui, presentiamo un metodo alternativo per misurare la sensibilità tattile delle zampe posteriori del topo dopo l'esposizione al veleno di Bothrops jararaca utilizzando un apparato elettronico di von Frey (EvF). Cunha e colleghi6 hanno aperto la strada all'uso delle tecniche EvF nei roditori e hanno sistematicamente confrontato l'efficacia di CvF ed EvF per dimostrare che EvF fornisce "una misura più sensibile, oggettiva e quantitativa" della sensibilità tattile nei modelli di roditori di dolore infiammatorio. In breve, nelle misurazioni EvF, una punta von Frey in polipropilene non igroscopico di diametro uniforme (0,8 mm) di rigidità adeguata per il tessuto da testare è collegata a una sonda elettronica e a un lettore che mostra la forza/peso con cui il roditore si ritrae dalla punta. Ci sono diverse differenze importanti tra le misurazioni CvF ed EvF. In primo luogo, il processo di misurazione delle risposte di base e sperimentali utilizzando l'EvF è notevolmente semplificato poiché la pressione sulla zampa posteriore può essere applicata con forza crescente fino a quando non c'è una risposta e non è necessario cambiare le punte come in CvF; Gli animali trascorrono meno tempo confinati nelle camere di saggio e sono quindi meno stressati e più a loro agio durante un esperimento. In secondo luogo, l'EvF consente una relativa facilità di implementazione dei criteri di esclusione razionale per i soggetti dello studio sotto forma di intervalli di soglie di base accettabili. Ciò consente la standardizzazione delle risposte di base all'interno e tra i gruppi di trattamento. In terzo luogo, la risposta di un soggetto a seguito di un trattamento sperimentale viene sempre confrontata con la propria risposta basale individuale, creando importanti controlli interni per le misurazioni. In quarto luogo, l'accuratezza delle soglie di prelievo viene registrata a un livello di risoluzione più elevato, poiché la pressione può essere applicata in modo continuo piuttosto che in incrementi disponibili sotto forma di pesi di filamenti manuali. Come per i saggi CvF ben progettati, anche gli esperimenti basati su EvF vengono eseguiti con lo stesso investigatore (cieco al trattamento) che applica la forza e registra i comportamenti di risposta. È importante notare che questa tecnica richiede tempo e impegno da parte dei ricercatori per stabilire la coerenza interna delle misurazioni e richiede che gli esperimenti siano pianificati in modo tale da tenere tolleranze appropriate per i topi che potrebbero dover essere esclusi a causa di risposte basali incoerenti.
Una valutazione della sensibilità meccanica facile da implementare, efficace e ben controllata facilita l'aggiunta della valutazione comportamentale a modelli di eventi infiammatori come l'avvelenamento - l'esempio che abbiamo usato qui per illustrare le capacità e la potenza delle misurazioni EvF nella misurazione dei cambiamenti nella sensibilità tattile. Abbiamo scoperto che i topi svizzeri ND4 maschi hanno mostrato una maggiore sensibilità meccanica dopo l'iniezione di veleno derivato dalla vipera sudamericana Bothrops jararaca nella zampa posteriore. Le risposte comportamentali sono state accompagnate da edema, afflusso di neutrofili e degranulazione dei mastociti nel tessuto interessato.

<table><tbody><tr><td>ND4 Topi maschi svizzeri</td><td>Harlan</td><td>0-32</td><td>I topi utilizzati qui avevano 8-12 settimane e sono stati alloggiati e utilizzati secondo le linee guida IACUC del Macaleter College.</td></tr><tr><td>Siringa da insulina da 3 ml/100 con ago BD da 29 G 1/2 BD309301</td><td></td><td></td><td>Smaltire dopo ogni utilizzo nell'apposito contenitore.</td></tr><tr><td>B. jararaca veleno</td><td>Sigma</td><td>V5625</td><td>ATTENZIONE: Sostanza tossica. Indossare una protezione per gli occhi e la pelle. Sciogliere in soluzione fisiologica sterile allo 0,9%.</td></tr><tr><td>Apparecchio elettronico von Frey; sonda = 90 g campo</td><td>IITC</td><td>2394</td><td>Muoversi delicatamente e assicurarsi che sia sempre orizzontale. Per azzerare la sonda, premere "Programma" e "Cancella". Per passare dalla modalità di configurazione a quella di funzionamento, premere "Function" (per la lettura "MH") o "MAX".</td></tr><tr><td>Supporto in rete + camere in PMMA</td><td>IITC</td><td>410</td><td>Da posizionare su un banco di lavoro stabile o su un carrello con quattro ruote per accedere a tutti i lati.</td></tr><tr><td>Solo punte rigide elettroniche von Frey, gamma 90 g</td><td>IITC</td><td>2390</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

misurazione dei cambiamenti nella sensibilità tattile nella zampa posteriore dei topi utilizzando un apparecchio elettronico di von frey

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Misurare i cambiamenti indotti dall'infiammazione nelle soglie di ritiro della zampa posteriore dalla pressione meccanica è una tecnica utile per valutare i cambiamenti nella percezione del dolore nei roditori. Le soglie di astinenza possono essere misurate prima al basale e poi dopo il farmaco, il veleno, la lesione, l'allergene o l'infiammazione evocata in altro modo applicando una forza accurata su aree molto specifiche della pelle. Un apparato elettronico di von Frey consente una valutazione precisa delle soglie di ritiro delle zampe posteriori del topo che non sono limitate dalle dimensioni dei filamenti disponibili, a differenza delle classiche misurazioni di von Frey. La facilità e la rapidità delle misurazioni consentono l'incorporazione della valutazione degli esiti della sensibilità tattile in diversi modelli di dolore infiammatorio e neuropatico a rapida insorgenza, poiché è possibile effettuare più misurazioni in un breve periodo di tempo. Le misurazioni sperimentali per i singoli soggetti roditori possono essere controllate internamente rispetto alle risposte di base individuali e ai criteri di esclusione facilmente stabiliti per standardizzare le risposte di base all'interno e tra i gruppi sperimentali. Pertanto, le misurazioni con un apparato elettronico di von Frey rappresentano un'utile modifica dei ben consolidati saggi classici basati sui filamenti di von Frey per l'allodinia meccanica dei roditori che possono essere applicati anche ad altri modelli di mammiferi non umani.

L'amministrazione locale del veleno di B. jararaca provoca cambiamenti nella sensibilità tattile della zampa posteriore e nell'edema dei tessuti nei topi maschi Swiss ND4.
1,5 ore dopo la somministrazione di 45 µg/kg di veleno di B. jararaca, topi maschi Swiss ND4 ritraevano le zampe posteriori a una pressione di 3,0 g inferiore rispetto al valore basale (Figura 1A). Il ritiro basale per tutti i gruppi avveniva a circa 4,5 g di pressione applicata; dopo il trattamento con veleno, i topi sperimentali ritraevano le zampe posteriori a una pressione di 1-1,5 g (dati non mostrati). I topi di controllo trattati con soluzione fisiologica mostravano una riduzione minima o nulla nella risposta alla pressione rispetto al valore basale in tutti i tempi sperimentali analizzati. Le soglie di risposta ridotte nei topi trattati sono state chiaramente mantenute a 3 e 6 ore dopo l'avvelenamento (Figura 1A) e risultavano indistinguibili dai controlli a 24 ore (dati non mostrati). Le zampe posteriori dei topi avvelenati presentavano edema tissutale caratteristico dell'infiammazione. A 1,5 ore dalla somministrazione del veleno, le zampe posteriori trattate, misurate come precedentemente descritto10, erano 1,5 mm più spesse rispetto al valore basale; l'edema è stato mantenuto fino a 3 e 6 ore (Figura 1B). Al contrario, le zampe trattate con soluzione fisiologica non hanno mostrato gonfiore né variazioni di spessore durante il periodo sperimentale. Per l'esperimento rappresentativo qui mostrato, un totale di 21 topi sono stati utilizzati per le misurazioni basali e 14 sono stati selezionati per l'inclusione nell'esperimento. Sono stati assegnati ai gruppi di trattamento in modo che le risposte medie di ritiro al valore basale fossero di circa 4,5 g per ciascun gruppo nel complesso.
I cambiamenti indotti dal veleno di B. jararaca nella sensibilità tattile sono accompagnati dalla degranulazione dei mastociti e dall'afflusso di neutrofili nelle zampe posteriori di topi maschi Swiss ND4.
Oltre all'aumento della sensibilità tattile e all'edema tissutale, abbiamo anche valutato l'afflusso di neutrofili (Figure 2A-B) e la degranulazione dei mastociti (Figure 2C-D) nei piedi posteriori di topi avvelenati rispetto a quelli trattati con soluzione salina. I neutrofili sono le prime cellule infiammatorie a essere reclutate in una lesione dalla circolazione ed è noto che mediino le risposte nocicettive infiammatorie10,16,17. I mastociti sono cellule sentinella residenti nei tessuti18 e la loro degranulazione è stata associata a risposte nocicettive nel piede posteriore del topo10 e nella dura madre del ratto19.
In questo studio, abbiamo osservato che l'afflusso di neutrofili nelle zampe posteriori inoculate con veleno era aumentato di quasi 1.000 volte rispetto alle zampe posteriori trattate con soluzione salina (Figura 3A), valutato mediante conteggio di sezioni sagittali plantari di tessuto in paraffina da 4 µm colorate con ematossilina-eosina10, prelevate 1,5 ore dopo la somministrazione del veleno da topi sacrificati.
Nelle zampe trattate con soluzione salina, i mastociti plantari nel tessuto della zampa posteriore erano per lo più integri o mostravano una lieve degranulazione (Figura 3B). Al contrario, le zampe posteriori intossicate mostravano una degranulazione moderata ed estesa dei mastociti nel 15-20% dei casi (Figura 3B). Le sezioni di tessuto descritte in precedenza sono state colorate con blu di toluidina e il numero di granuli visibili è stato contato per ogni mastocita osservato al fine di determinare lo stato di degranulazione, come descritto in precedenza10.
<img alt="Grafici dell'effetto del veleno di B. jararaca: A) Soglia meccanica, B) Larghezza della zampa nel tempo. Dati statistici." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. L'amministrazione locale del veleno di B. jararaca provoca variazioni della sensibilità meccanica della zampa posteriore e edema tissutale nei topi maschi Swiss ND4. Le soglie di ritrazione di base e la larghezza iniziale della zampa sono state valutate rispettivamente 48 e 24 ore prima del trattamento intraplantare con veleno di B. jararaca (Bjv; 45 µg/kg) o con soluzione fisiologica (10 µl). Le soglie di ritrazione sono state misurate a 1,5, 3 e 6 ore dopo il trattamento (A). La larghezza media della zampa (valore medio della larghezza della zampa sinistra e destra di un topo) nella regione medio-plantare è stata valutata mediante calibro digitale al basale e successivamente a 1,5, 3 e 6 ore dopo il trattamento, al fine di determinare l'edema tissutale come precedentemente descritto10 (B). Le significatività sono state confrontate con i topi trattati con soluzione fisiologica (* = p &lt; 0,05, ** = p &lt; 0,01, *** = p &lt; 0,001 rispettivamente). n = 10-11 topi per gruppo di trattamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine in dimensioni maggiori</a>.
<img alt="Histological comparison of saline and B. jararaca effects, under 400x and 1000x magnification." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. B. jararaca l'ipersensibilità meccanica indotta dal veleno è accompagnata dalla degranulazione dei mastociti e dall'afflusso di neutrofili nelle zampe posteriori di topi maschi ND4 Swiss 3 topi/trattamento sono stati sottoposti a eutanasia mediante CO2 a 1,5 ore dal trattamento e le loro zampe posteriori sono state escisse, conservate in formalina al 10% per 24 ore, trasferite in etanolo al 70%, decalcificate per 1-2 settimane in EDTA al 15% e incluse in paraffina. 4 µm sezioni sagittali sono state colorate con ematossilina-eosina (A-B) e blu di toluidina (C-D) per la visualizzazione dei neutrofili (A-B) e mastociti (C-D), rispettivamente. Le immagini sono state acquisite a 400X e 1.000X come indicato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine a dimensione maggiore</a>. 
<img alt="Neutrofili e degranulazione indotte dal veleno di B. jararaca; grafico a barre; analisi dell'impatto del veleno" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. La sensibilità meccanica indotta dal veleno di B. jararaca è accompagnata da aumenti significativi nei livelli di degranulazione dei mastociti e nell'afflusso di neutrofili nelle zampe posteriori di topi maschi ND4 Swiss. I neutrofili e i mastociti su sezioni di tessuto colorate sono stati contati utilizzando un microscopio Olympus CX21LED. I neutrofili sono stati contati in 3 zampe posteriori per trattamento, dalla caviglia alle dita, in campi adiacenti a un ingrandimento di 400X  (A). I mastociti sono stati contati in 3 cuscinetti plantari per trattamento e il loro stato di degranulazione è stato valutato in base al numero di granuli visibili al di fuori del contorno cellulare: intatto (0), lieve (0-10), moderato (10-20), esteso (21+), come descritto in precedenza10 (B).  Per evitare di contare due volte le stesse cellule, i ricercatori che valutavano il numero di neutrofili e i livelli di degranulazione dei mastociti nelle sezioni delle zampe posteriori hanno utilizzato una griglia riportata nel reticolo dell'oculare. I ricercatori erano ciechi rispetto ai trattamenti. Le significatività sono state confrontate con i topi trattati con soluzione salina (* = p &lt; 0,05, ** = p &lt; 0,01, *** = p &lt; 0,001 rispettivamente). n =3 topi per gruppo di trattamento.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita</a>.

Le misurazioni elettroniche di von Frey sono un'alternativa efficace e migliorata ai classici filamenti di von Frey, in quanto consentono una misurazione rapida e precisa dei cambiamenti nelle soglie di prelievo meccanico dei roditori agli stimoli di pressione applicati continuamente prima e dopo un evento infiammatorio.

Misurazione dei cambiamenti nella sensibilità tattile nella zampa posteriore dei topi utilizzando un apparecchio elettronico di von Frey

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le risposte non suscettibili alla pressione meccanica nella zampa posteriore dei topi. Questo viene ottenuto posizionando innanzitutto gli animali su un pavimento a griglia metallica e permettendo loro di abituarsi quando sono pronti. Una punta in polipropilene viene applicata sulla parte inferiore della zampa posteriore e la pressione viene aumentata gradualmente.Quando viene osservata la risposta comportamentale appropriata, lo stimolo viene ritirato. Una volta raccolti i valori basali, gli animali ricevono un'intervento sperimentale prima di ulteriori test. Infine, le variazioni delle soglie di ritrazione della zampa posteriore vengono confrontate tra i gruppi di trattamento per determinare l'effetto di un particolare trattamento sulle modifiche della sensibilità tattile alla pressione.Il dolore è un componente fondamentale dell'infiammazione. È importante misurare e caratterizzare il dolore in diversi contesti. Questo metodo relativamente semplice di valutazione del dolore può essere applicato a molti modelli diversi di infiammazione.La procedura sarà dimostrata da Tiana ov, una tecnica di ricerca del mio laboratorio, Madison Mack, che ha partecipato a questo lavoro durante la sua formazione universitaria, e da Akila Sykes, attualmente studentessa universitaria nel mio laboratorio. Iniziamo configurando l'apparato sperimentale per consentire un facile accesso alle zampe posteriori.Posizionare singole camere sopra un pavimento a rete. Il pavimento a rete deve trovarsi a un'altezza comoda e su una superficie stabile. Successivamente, posizionare l'apparato elettronico di Von Frey sul piano del banco.Assicurarsi che la sonda e il cavo siano correttamente collegati all'unità di visualizzazione e accendere lo strumento in modalità configurazione. Impostare la lettura su zero e posizionare delicatamente il peso di prova fornito sulla punta della sonda Von Frey. Registrare il valore visualizzato e ripetere nuovamente questa procedura alla fine dei test; se vi è una discrepanza tra i due valori, potrebbe essere necessario ricalibrare l'apparecchiatura.Selezionare una punta in polipropilene della dimensione appropriata per il tessuto da testare. Le punte rigide sono adatte per il tessuto della zampa posteriore, meno sensibile e più resistente. Montare delicatamente la punta sul cono della sonda.Passare successivamente dalla modalità di configurazione a quella di funzionamento. Verrà visualizzata la pressione massima applicata quando la sonda viene ritratta. Sono necessari due ricercatori per misurare le soglie di ritrazione della zampa posteriore.Uno per utilizzare l'apparecchiatura ed eseguire le misurazioni, e un altro per registrare tali misurazioni al fine di ridurre il bias. L'investigatore che utilizza l'anesthesi TER deve essere cieco rispetto ai trattamenti e ai valori registrati della soglia di ritrazione. Inoltre, per garantire coerenza tra le misurazioni, la stessa persona deve registrare tutti i valori basali e della soglia di ritrazione.48 ore prima del trattamento, vengono registrate le prime misurazioni di base. Posizionare del materiale assorbente sotto il supporto per raccogliere i rifiuti escreti. Dopo aver montato la punta e azzerato la sonda, l'operatore che registra le misurazioni deve posizionare i topi in camere individuali.Coprire le camere con coperchi forati e posizionare un oggetto pesante sopra. Per evitare che i topi fuggano, lasciare che si abituino alla camera per 15 minuti prima di procedere. In generale, chi si approccia per la prima volta a questa tecnica avrà difficoltà nell'applicare gradualmente una pressione crescente e nel raggiungere una coerenza interna con le proprie misurazioni; la pratica è quindi essenziale per ottenere risultati riproducibili.Quando si è pronti, utilizzare entrambe le mani per sollevare lentamente la sonda e stimolare la pianta del piede dell'arto posteriore destro o sinistro. Aumentare gradualmente la pressione fino a quando non viene osservato un comportamento nocicettivo. Questi comportamenti sono identificati da ritrazione dell'arto posteriore, leccamento dell'arto posteriore o salto dell'arto.Chiedere all'altro ricercatore di registrare la pressione che ha provocato il comportamento osservato. Durante la misurazione, è utile incoraggiare il topo a rimanere fermo posizionando una ricompensa alimentare appena fuori dalla camera o producendo un lieve rumore, come un colpetto delicato, prima di effettuare la misurazione. Procedere con il topo successivo finché ciascuno non sia stato testato una volta e ripetere questa procedura altre quattro volte.Dopo aver raccolto cinque valori basali, calcolare la media per ogni topo. Ripetere le misurazioni basali dopo 24 ore e utilizzare questi valori per calcolare un'altra media. Per assicurare che tutti i topi presentino risposte basali coerenti, escludere gli animali con una soglia media di ritiro inferiore a 3,5 grammi o con valori basali che differiscono di due grammi o più.Infine, assegnare i topi a gruppi di trattamento separati in modo che la media della soglia di ritiro iniziale di ciascun gruppo sia il più simile possibile. Qui, le soglie di ritiro sono state misurate dopo l'amministrazione del veleno nella zampa posteriore, ROS raca. Il gruppo controllo trattato con soluzione salina ha mostrato poche variazioni rispetto alla baseline in tutti i tempi.I punti di prova delle risposte nocicettive nei topi trattati sono stati chiaramente mantenuti fino a sei ore. Inoltre, l'edema tissutale, caratteristico dell'infiammazione, era evidente nelle zampe posteriori trattate con veleno, ma non in quelle trattate con soluzione salina. I cambiamenti indotti dal veleno nella sensibilità tattile sono stati accompagnati da un afflusso di neutrofili quasi mille volte superiore.Rispetto alle zampe posteriori trattate con soluzione fisiologica, nei tessuti delle zampe posteriori trattate con soluzione fisiologica, i mastociti plantari erano per lo più integri o mostravano una degranulazione lieve. Al contrario, nelle zampe posteriori accoppiate si osservava una degranulazione moderata ed estesa dei mastociti nel 15-20%. Questa tecnica può essere adattata per valutare la sensibilità meccanica o tattile in una vasta gamma di tessuti diversi dalla zampa posteriore.Pertanto, questa tecnica può essere incorporata in molti modelli diversi di infiammazione e dolore nei roditori.

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Misurazione delle modifiche nella sensibilità tattile nell'arto posteriore dei topi utilizzando un apparato elettronico von Frey

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Misurazione dei cambiamenti nella sensibilità tattile nella zampa posteriore dei topi utilizzando un apparecchio elettronico di von Frey (Video) | JoVE Journal

Misurazione dei cambiamenti nella sensibilità tattile nella zampa posteriore dei topi utilizzando un apparecchio elettronico di von Frey

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