Misurazione dei cambiamenti nella sensibilità tattile nella zampa posteriore dei topi utilizzando un apparecchio elettronico di von Frey
19 dicembre 2013
Le misurazioni elettroniche di von Frey sono un'alternativa efficace e migliorata ai classici filamenti di von Frey, in quanto consentono una misurazione rapida e precisa dei cambiamenti nelle soglie di prelievo meccanico dei roditori agli stimoli di pressione applicati continuamente prima e dopo un evento infiammatorio.
L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le risposte non suscettibili alla pressione meccanica nella zampa posteriore dei topi. Questo viene ottenuto posizionando innanzitutto gli animali su un pavimento a griglia metallica e permettendo loro di abituarsi quando sono pronti. Una punta in polipropilene viene applicata sulla parte inferiore della zampa posteriore e la pressione viene aumentata gradualmente.
Quando viene osservata la risposta comportamentale appropriata, lo stimolo viene ritirato. Una volta raccolti i valori basali, gli animali ricevono un'intervento sperimentale prima di ulteriori test. Infine, le variazioni delle soglie di ritrazione della zampa posteriore vengono confrontate tra i gruppi di trattamento per determinare l'effetto di un particolare trattamento sulle modifiche della sensibilità tattile alla pressione.
Il dolore è un componente fondamentale dell'infiammazione. È importante misurare e caratterizzare il dolore in diversi contesti. Questo metodo relativamente semplice di valutazione del dolore può essere applicato a molti modelli diversi di infiammazione.
La procedura sarà dimostrata da Tiana ov, una tecnica di ricerca del mio laboratorio, Madison Mack, che ha partecipato a questo lavoro durante la sua formazione universitaria, e da Akila Sykes, attualmente studentessa universitaria nel mio laboratorio. Iniziamo configurando l'apparato sperimentale per consentire un facile accesso alle zampe posteriori.
Posizionare singole camere sopra un pavimento a rete. Il pavimento a rete deve trovarsi a un'altezza comoda e su una superficie stabile. Successivamente, posizionare l'apparato elettronico di Von Frey sul piano del banco.
Assicurarsi che la sonda e il cavo siano correttamente collegati all'unità di visualizzazione e accendere lo strumento in modalità configurazione. Impostare la lettura su zero e posizionare delicatamente il peso di prova fornito sulla punta della sonda Von Frey. Registrare il valore visualizzato e ripetere nuovamente questa procedura alla fine dei test; se vi è una discrepanza tra i due valori, potrebbe essere necessario ricalibrare l'apparecchiatura.
Selezionare una punta in polipropilene della dimensione appropriata per il tessuto da testare. Le punte rigide sono adatte per il tessuto della zampa posteriore, meno sensibile e più resistente. Montare delicatamente la punta sul cono della sonda.
Passare successivamente dalla modalità di configurazione a quella di funzionamento. Verrà visualizzata la pressione massima applicata quando la sonda viene ritratta. Sono necessari due ricercatori per misurare le soglie di ritrazione della zampa posteriore.
Uno per utilizzare l'apparecchiatura ed eseguire le misurazioni, e un altro per registrare tali misurazioni al fine di ridurre il bias. L'investigatore che utilizza l'anesthesi TER deve essere cieco rispetto ai trattamenti e ai valori registrati della soglia di ritrazione. Inoltre, per garantire coerenza tra le misurazioni, la stessa persona deve registrare tutti i valori basali e della soglia di ritrazione.
48 ore prima del trattamento, vengono registrate le prime misurazioni di base. Posizionare del materiale assorbente sotto il supporto per raccogliere i rifiuti escreti. Dopo aver montato la punta e azzerato la sonda, l'operatore che registra le misurazioni deve posizionare i topi in camere individuali.
Coprire le camere con coperchi forati e posizionare un oggetto pesante sopra. Per evitare che i topi fuggano, lasciare che si abituino alla camera per 15 minuti prima di procedere. In generale, chi si approccia per la prima volta a questa tecnica avrà difficoltà nell'applicare gradualmente una pressione crescente e nel raggiungere una coerenza interna con le proprie misurazioni; la pratica è quindi essenziale per ottenere risultati riproducibili.
Quando si è pronti, utilizzare entrambe le mani per sollevare lentamente la sonda e stimolare la pianta del piede dell'arto posteriore destro o sinistro. Aumentare gradualmente la pressione fino a quando non viene osservato un comportamento nocicettivo. Questi comportamenti sono identificati da ritrazione dell'arto posteriore, leccamento dell'arto posteriore o salto dell'arto.
Chiedere all'altro ricercatore di registrare la pressione che ha provocato il comportamento osservato. Durante la misurazione, è utile incoraggiare il topo a rimanere fermo posizionando una ricompensa alimentare appena fuori dalla camera o producendo un lieve rumore, come un colpetto delicato, prima di effettuare la misurazione. Procedere con il topo successivo finché ciascuno non sia stato testato una volta e ripetere questa procedura altre quattro volte.
Dopo aver raccolto cinque valori basali, calcolare la media per ogni topo. Ripetere le misurazioni basali dopo 24 ore e utilizzare questi valori per calcolare un'altra media. Per assicurare che tutti i topi presentino risposte basali coerenti, escludere gli animali con una soglia media di ritiro inferiore a 3,5 grammi o con valori basali che differiscono di due grammi o più.
Infine, assegnare i topi a gruppi di trattamento separati in modo che la media della soglia di ritiro iniziale di ciascun gruppo sia il più simile possibile. Qui, le soglie di ritiro sono state misurate dopo l'amministrazione del veleno nella zampa posteriore, ROS raca. Il gruppo controllo trattato con soluzione salina ha mostrato poche variazioni rispetto alla baseline in tutti i tempi.
I punti di prova delle risposte nocicettive nei topi trattati sono stati chiaramente mantenuti fino a sei ore. Inoltre, l'edema tissutale, caratteristico dell'infiammazione, era evidente nelle zampe posteriori trattate con veleno, ma non in quelle trattate con soluzione salina. I cambiamenti indotti dal veleno nella sensibilità tattile sono stati accompagnati da un afflusso di neutrofili quasi mille volte superiore.
Rispetto alle zampe posteriori trattate con soluzione fisiologica, nei tessuti delle zampe posteriori trattate con soluzione fisiologica, i mastociti plantari erano per lo più integri o mostravano una degranulazione lieve. Al contrario, nelle zampe posteriori accoppiate si osservava una degranulazione moderata ed estesa dei mastociti nel 15-20%. Questa tecnica può essere adattata per valutare la sensibilità meccanica o tattile in una vasta gamma di tessuti diversi dalla zampa posteriore.
Pertanto, questa tecnica può essere incorporata in molti modelli diversi di infiammazione e dolore nei roditori.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per misurare le risposte nocicettive alla pressione meccanica nella zampa posteriore di topi mediante misurazioni elettroniche con il test di von Frey. Questa tecnica consente una valutazione rapida e precisa delle variazioni delle soglie di ritrazione meccanica prima e dopo interventi infiammatori.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Valutazione del Comportamento
- Modelli di Infiammazione
Sfondo
- La misurazione del dolore è fondamentale per comprendere l'infiammazione.
- L'apparato elettronico di von Frey offre vantaggi rispetto ai metodi classici.
- Una misurazione accurata delle soglie di ritrazione è essenziale per la riproducibilità.
- Questo metodo può essere adattato a diversi modelli di roditori.
Scopo dello studio
- Valutare la sensibilità meccanica in risposta a stimoli di pressione.
- Valutare gli effetti dei trattamenti sul comportamento nocicettivo.
- Stabilire un metodo affidabile per la valutazione del dolore nella ricerca.
Metodi Utilizzati
- Abituazione dei topi su un pavimento a griglia metallica.
- Applicazione graduale di pressione mediante una punta in polipropilene.
- Registrazione delle soglie di ritrazione da parte di due investigatori in cieco.
- Confronto tra le misurazioni basali e quelle post-trattamento.
Risultati principali
- Sono stati osservati cambiamenti significativi nelle soglie di ritrazione dopo il trattamento.
- L'infiammazione è stata caratterizzata da edema tissutale e afflusso di neutrofili.
- La degranulazione dei mastociti ha mostrato variazioni tra i gruppi trattati.
- Il metodo ha dimostrato adattabilità a diversi tipi di tessuto.
Conclusioni
- Il metodo elettronico di von Frey è efficace per valutare il dolore nei roditori.
- Questa tecnica può migliorare la comprensione dei meccanismi del dolore infiammatorio.
- Fornisce una base per futuri studi sull'efficacia del dolore e dei trattamenti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione dei cambiamenti nella sensibilità tattile nei modelli rodentici fornisce dati fondamentali nella fase iniziale per la validazione di bersagli analgesici e la riduzione dei rischi meccanicistici nello sviluppo di terapie per il dolore. Il metodo elettronico di von Frey consente una misurazione rapida e quantitativa delle soglie di ritrazione meccanica, supportando una valutazione preclinica riproducibile di modelli di dolore infiammatorio e neuropatico. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva riguardo al legame con il bersaglio e l'efficacia del trattamento prima di avanzare composti verso studi di fase successiva.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative ai percorsi nocicettivi e ai meccanismi di modulazione del dolore.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico fornendo letture quantitative e controllate internamente della sensibilità tattile tra i diversi gruppi di trattamento.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio attraverso il confronto oggettivo delle soglie di ritrazione basali e post-intervento per valutare la modulazione del bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive, stabilendo misurazioni standardizzate della sensibilità tattile di base.
- Riproducibilità: Consente misurazioni costanti e ripetute in brevi intervalli di tempo, favorendo la standardizzazione del saggio e la comparabilità tra gruppi.
- Scalabilità: Permette numerose misurazioni per soggetto, aumentando la produttività e l'affidabilità delle campagne di screening di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella l'allodinia meccanica indotta da infiammazione, in linea con i fenotipi clinici del dolore nelle condizioni infiammatorie e neuropatiche.
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta e i flussi di lavoro preclinici fornendo esiti quantificabili della sensibilità al dolore meccanicamente rilevanti.
- Avanzamento basato sul rischio: Fornisce indicazioni per decisioni di avanzamento o interruzione dello studio sulla base di modifiche riproducibili delle soglie di ritrazione dopo interventi sperimentali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo elettronico di von Frey si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto promettente fino ai test di efficacia preclinica, in particolare per composti che modulano il dolore.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi misurando le risposte nocicettive alla pressione meccanica come lettura funzionale dell'interazione con il bersaglio.
- Screening: Fornisce output quantitativi pronti per il saggio e riproducibili, essenziali per una valutazione affidabile dei composti nei modelli del dolore.
- Analisi: Offre misurazioni precise della soglia di ritrazione e confrontabilità statistica tra condizioni basali e di trattamento.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla validazione preclinica attraverso esiti di sensibilità meccanica rilevanti per la malattia nei modelli di infiammazione.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità di piattaforma riutilizzabile in diversi modelli di dolore infiammatorio e neuropatico, riducendo lo sviluppo ridondante dei saggi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dell'obiettivo riducendo l'ambiguità meccanicistica nella modulazione delle vie del dolore.
- Valore operativo: Fornisce misurazioni standardizzate e riproducibili della sensibilità tattile con minima variabilità tecnica.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo, potenziando l'efficienza del capitale e riducendo l'abbandono in fasi avanzate a causa della mancanza di efficacia mediata dal bersaglio.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei composti in base al rischio, sulla base di effetti quantificabili sui soglie di ritrazione meccanica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede una formazione nell'osservazione comportamentale e nell'identificazione delle risposte nocicettive per garantire la coerenza delle misurazioni.
- È dipendente da un apparato elettronico von Frey calibrato e dalla selezione appropriata della punta in polipropilene per il tessuto della zampa posteriore.
- Necessita dell'accecamento degli operatori e dei registrazioni rispetto alle condizioni di trattamento per minimizzare i bias nella registrazione della soglia.
- Comporta criteri di esclusione basati sulla variabilità della soglia basale per garantire l'omogeneità del gruppo e l'integrità dei dati.
- Limitato alle risposte comportamentali misurabili; richiede endpoint nocicettivi chiari come il ritiro della zampa, lecito o salto.
