Citotossico Efficacia della terapia fotodinamica in cellule di osteosarcoma In Vitro

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di mostrare l'efficacia citotossica della terapia fotodinamica nelle cellule di osteosarcoma. Ciò si ottiene misurando prima l'assorbimento intracellulare del fotosensibilizzatore M-T-H-P-C da parte delle cellule dell'osteosarcoma. Nella seconda fase, la luce laser viene applicata alle cellule per attivare il M-T-H-P-C e per produrre radicali citotossici dell'ossigeno.

Infine, il metabolismo cellulare e il numero di cellule sono misurati mediante un saggio solubile in acqua tetra oleum one o WST one. In definitiva, il test WST one, così come il conteggio diretto delle cellule, può essere utilizzato per misurare la citotossicità della terapia fotodinamica sulle cellule dell'osteosarcoma. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia dell'osteosarcoma in quanto consente di misurare l'efficacia della terapia fotodinamica in vitro e assomiglia alla tecnica attualmente utilizzata nei pazienti.

Per confrontare l'assorbimento di M-T-H-P-C tra le linee cellulari di osteosarcoma, iniziare con la placcatura 0,2 volte 10 al sesto Hoss e 143 cellule B per pozzetto. In triplicato in piastre a sei pozzetti, lasciare che le cellule aderiscano durante la notte a una fluenza dell'80-90% di co, quindi il giorno successivo, incubare le cellule con una concentrazione fissa di M-T-H-P-C per diversi periodi di tempo al buio per valutare l'assorbimento dipendente dal tempo del fotosensibilizzatore da parte delle cellule. Dopo le incubazioni, aspirare il terreno e lavare le cellule tre volte con PBS, quindi staccare le cellule con 0,5 millilitri di tripsin EDTA e contarle.

Quindi, centrifugare le celle per cinque minuti a 400 volte G e temperatura ambiente. Aspirare il mezzo e risospendere il pellet in PBS fino a una densità finale di due volte 10 alla quinta cella per millilitro. Pipettare 100 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di un 96.

Piastra a pozzetto e misura la fluorescenza delle cellule in uno spettrofotometro a fluorescenza impostato su un'eccitazione di 417 nanometri e un'emissione di 652 nanometri. Quindi preparare una curva standard impiattando 100 microlitri di concentrazioni da zero a quattro milligrammi per millilitro di M-T-H-P-C in triplicato. In una piastra a 96 pozzetti e misurare la fluorescenza come appena dimostrato per generare una curva standard per calcolare l'unità di fluorescenza relativa di ciascuna cella contenente pozzetti dalla piastra precedentemente misurata.

Per misurare la fototossicità del fotosensibilizzatore, primo seme 3000 cellule per pozzetto in triplicato per ogni concentrazione di M-T-H-P-C in una piastra a 96 pozzetti, comprese le cellule di controllo della tossicità scura per ogni concentrazione di FOTOSENSIBILIZZATORE. Lascia che le cellule aderiscano per una notte a una fluidità del 50-60% di co il giorno successivo. Incubare le cellule con un intervallo di concentrazioni di M-T-H-P-C al buio per cinque ore dopo l'incubazione.

Aspirare il terreno e lavare due volte le cellule con PBS e aggiungere terreno fresco senza M-T-H-P-C quindi specifico per lo spettro di assorbimento M-T-H-P-C, indossando un'adeguata protezione per gli occhi. Imposta un laser a diodi da 652 nanometri su una potenza di 21,88 milliwatt per centimetro quadrato a un'altezza di 13,5 centimetri. Distanza dalle celle per ottenere una dose di energia di cinque joule per centimetro quadrato.

Quindi illuminare le cellule, ad eccezione delle celle di controllo della tossicità al buio, per 230 secondi dopo l'illuminazione. Tenere le celle al buio a 37 gradi Celsius per 24 ore. Successivamente aggiungere 10 microlitri di wst, un reagente ogni 100 microlitri di terreno tre ore dopo l'aggiunta del reagente wst un misurare l'assorbanza dei singoli pozzetti a 415 nanometri.

Infine, calcolare il numero di cellule sopravvissute oltre al saggio WST one. Il conteggio diretto delle cellule è un secondo metodo per misurare la tossicità cellulare. Per calcolare la percentuale di cellule vitali, seminare due volte 10 alla quarta cella per pozzetto in 2 piastre da 24 pozzetti e lasciarle aderire per una notte.

Il giorno successivo incubare le celle per cinque ore al buio con M-T-H-P-C e illuminarle come appena dimostrato. Tenere le cellule di controllo scure al buio dopo 24 ore, raccogliere il surnatante, lavare le cellule una volta con PBS e occhi di tripsina infine far girare le cellule e risospendere il pellet in 200 microlitri di terreno fresco per il conteggio. I risultati illustrati in questo grafico mostrano nel pannello superiore l'assorbimento di M-T-H-P-C in modo dipendente dal tempo con un'intensità di fluorescenza della sospensione cellulare che rappresenta i livelli intracellulari del M-T-H-P-C.

Nel pannello inferiore. L'assorbimento dose-dipendente di M-T-H-P-C può essere valutato misurando la fluorescenza di M-T-H-P-C con uno spettrofotometro a fluorescenza. Questo grafico illustra l'assorbimento di una concentrazione fissa di M-T-H-P-C in modo dipendente dal tempo con l'intensità di fluorescenza della sospensione cellulare che rappresenta i livelli intracellulari di M-T-H-P-C.

In questo grafico, viene dimostrata la captazione dose-dipendente di M-T-H-P-C in Haass e 143 cellule B dopo un'incubazione di cinque ore. La captazione nella linea cellulare ad alta metastaticità 143 B era significativamente più alta rispetto alla linea cellulare ospite parentale a bassa metastazione. È dimostrata la tossicità al buio dose-dipendente delle cellule dell'osteosarcoma.

143 cellule B sono state trattate con diversi dosaggi di M-T-H-P-C e, rispetto alle cellule non trattate, è stata osservata una diminuzione dose-dipendente dell'attività metabolica e del numero di cellule misurate da wst, un test. La diminuzione della vitalità cellulare è stata riconosciuta a una concentrazione di M-T-H-P-C pari e superiore a 2,5 microgrammi per millilitro. Nel grafico in basso, è illustrata la tossicità dose-dipendente di M-T-H-P-C.

Le cellule sono state trattate con diverse dosi di M-T-H-P-C e successiva illuminazione a cinque joule per centimetro quadrato. È stata osservata una conseguente diminuzione dell'attività metabolica cellulare e una diminuzione del numero di cellule. Lo sviluppo di questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia del cancro per applicare questi metodi a modelli in vivo di osteosarcoma e per altre indagini precliniche.