Un metodo di espansione cGMP-applicabile per Aggregati di neurali umane staminali e cellule progenitrici derivate da cellule staminali pluripotenti o fetale tessuto cerebrale
15 giugno 2014
Questo protocollo descrive un metodo tagliere meccanico romanzo che consente l'espansione di staminali e cellule progenitrici aggregati sferici neurali senza dissociazione di una sospensione di cellule singole. Mantenere il contatto cellula / cellula consente una crescita rapida e stabile per oltre 40 passaggi.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di passaggiare in modo efficiente i neurosfere in modo da mantenere il contatto cellula-cellula per tutta la durata della coltura cellulare. Questa tecnica crea le condizioni di espansione necessarie per le cellule progenitrici neurali umane. Ciò si ottiene combinando fino a due fiasche T175 contenenti le stesse cellule e trasferendole in un tubo conico, consentendo così il trasferimento delle sfere in una piastra di Petri come secondo passaggio, concentrandole in una massa gestibile di neurosfere sospese sulla piastra di Petri, il che permette alla lama di tagliare le HNPC in piccoli cluster.
Successivamente, le neurosfere passate o tritate vengono risospese per rimuovere le cellule dalla piastra di Petri e trasferirle nei nuovi flaconi. I risultati ottenuti mostrano che la tecnica di tritatura fornisce una strategia di crescita a lungo termine, basata sulle curve di espansione che dimostrano tassi di crescita logaritmica prolungati rispetto alle cellule passaggiate mediante l'approccio enzimatico standard. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale come sfera.
È difficile descrivere per iscritto i passaggi di condensazione. Esistono inoltre diverse tecniche che facilitano il processo. Se non si rimuove completamente l’eccesso di mezzo dalla piastra di Petri, le sfere verranno semplicemente spostate all’interno del mezzo anziché suddividersi in aggregati più piccoli.
Iniziare questa procedura valutando il colore del mezzo nel flacone di H NPCs. Esaminare il flacone al microscopio per osservare le cellule. Se possibile, utilizzare un righello per esaminare le dimensioni di diverse sferoidi.
Se molte sfere hanno un diametro di 300 micrometri o superiore, procedere con il processo di frammentazione e frammentare le cellule ogni sette-dieci giorni. Quindi reinserire il flacone nell'incubatrice e preparare il frammentatore. Accendere l'interruttore di alimentazione del frammentatore.
Nella BSC, impostare lo spessore di taglio a 200 micrometri e la forza della lama a 180 gradi o alla posizione delle nove in punto. Successivamente, verificare che la manopola della velocità automatica sia ruotata completamente in senso antiorario. Quindi spostare la manopola di rilascio del tavolo il più possibile verso destra e verificare che il portapiastra sia stabile.
Ruotare il manipolatore manuale in senso orario per sollevare il braccio al livello massimo. Successivamente, trasferire in modo asettico una lama sterile per tritare a doppio taglio sul bullone del braccio del tritatore. Utilizzando una pinza, posizionare il fermo sulla lama con la pinza.
La parte curva del fermo deve trovarsi sopra il bordo superiore del braccio. Successivamente, tenere il fermo sul braccio e fissare il dado sul bullone. Con l’apposito cacciavite sterile, lasciare il dado allentato di un quarto di giro.
In questa procedura, trasferire la quantità suggerita di mezzo di mantenimento nel nuovo flacone. Successivamente, trasferire in modo asettico le cellule dall'incubatore nella cappa a flusso laminare. Appoggiare il flacone su un portaprovette e lasciare sedimentare le sferoidi all'interno del flacone.
Un solo esemplare. Aspirare fino a 12 millilitri di soprannatante. Con una pipetta serologica da 10 millilitri, risciacquare tutte le sfere debolmente aderenti dalla superficie della fiala.
Ripetere secondo necessità e lasciare sedimentare le sferoidi tra un'aggiunta e l'altra. Successivamente, trasferire il volume suggerito di mezzo condizionato nel nuovo flacone. Quindi, trasferire tutto il mezzo condizionato rimanente e le sferoidi in un nuovo tubo conico da 15 millilitri.
Lasciare sedimentare le sfere e scartare il flacone usato. Successivamente, trasferire lentamente le cellule dal tubo conico da 15 millilitri alla piastra di Petri da 60 millimetri o al disco shim nel volume più basso possibile. Conservare il mezzo condizionato rimanente poiché verrà utilizzato per risciacquare le cellule dalla piastra dopo il chop.
Cercare di minimizzare la superficie coperta dal mezzo e dalle sfere nella piastra. Successivamente, iniziare a concentrare il pool di sfere trasferendo il sovranatante nel tubo conico da 15 millilitri. Rimuovere quanta più parte possibile del mezzo dalla superficie del pool cellulare utilizzando una micropipetta con punta dotata di barriera anti-aerosol.
Finché non è possibile rimuovere il mezzo senza le sferoidi, distribuire uniformemente il liquido. Utilizzando il lato della punta della pipetta per aumentare la superficie di contatto, inclinare leggermente la piastra di Petri e usare il lato della punta della pipetta per far scivolare delicatamente tutte le sferoidi verso un lato del liquido. Dopo che tutte le cellule sono state spostate, inclinare lentamente la piastra di Petri nella direzione opposta per permettere al mezzo di separarsi dalle sferoidi.
Successivamente, trasferire il mezzo chiarificato nel tubo conico da 15 millilitri. Utilizzare il lato della punta della pipetta per far scivolare delicatamente tutte le sferoidi al centro della piastra di Petri. In modo che la pozza abbia un diametro compreso tra 0,5 e 2,4 centimetri.
È importante mantenere la profondità della piscina sferica poco elevata. Se la piscina è troppo profonda, le sfere verranno spostate durante il taglio. Ora trasferire la piastra di Petri sul supporto per piastre e fissarla sotto i ganci del supporto.
Utilizzare la manopola di rilascio del tavolo per spostare a sinistra il supporto della piastra in modo che la lama sia libera dalle sfere e bloccata nell'ingranaggio. Successivamente, abbassare il braccio del tritacarne ruotando la manopola del manipolatore manuale in senso orario finché la lama non scatta in posizione orizzontale sulla piastra di Petri. Premere verso il basso sul supporto del braccio mentre si serra il dado.
Quindi premere il pulsante di reset. Una volta stabilizzato, tenere fermo il piatto di Petri con una mano mentre si ruota la manopola del manipolatore automatico in senso orario fino alla posizione a 90 gradi o a mezzogiorno, e iniziare a tritare quando tutte le sfere sono state tritate. Ruotare il supporto della piastra di 90 gradi.
Quindi allentare il bullone, abbassare il braccio e riavvitare il dado. Ripetere la procedura di taglio. Successivamente, in condizioni asettiche, trasferire la piastra di Petri dal supporto a una zona di lavoro all'interno della cappa a flusso laminare.
Trasferire un millilitro di mezzo condizionato sui sferoidi tritati. Quindi risospendere delicatamente e trasferire i sferoidi tritati in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Evitare di formare bolle e ripetere quante volte necessario per raccogliere tutti i sferoidi tritati.
Misurare il volume dei mezzi condizionati e delle sferoidi tritate. Aggiungere la quantità appropriata di mezzo di mantenimento per raggiungere il volume suggerito nella colonna E della tabella due. Successivamente, trasferire la sospensione di sferoidi in ciascun nuovo flacone, trasferendo la sospensione di sferoidi in un flacone alla volta e risospendendo le sferoidi tra un trasferimento e l'altro. Il volume finale in ciascun flacone deve corrispondere al volume suggerito nella colonna F della tabella due. Posizionare gli h NPCs tritati nell'incubatrice.
Questa figura mostra il numero di cellule previsto di H NPC congelate al passaggio 19, quindi scongelate ed espanse come monocstrato aderente mediante dissociazione enzimatica, rispetto ai neurosfere passaggiate con il metodo di taglio. Di seguito sono riportate immagini rappresentative di sfere prima e dopo il taglio, con un ingrandimento di 10x. Questa immagine mostra H NPC al passaggio di scongelamento 29, seminate da un giorno e colorate per la nestina ed espressione, mentre questa immagine mostra H NPC al passaggio di scongelamento 29, seminate per sette giorni in assenza di fattori di crescita e colorate per GFAP e beta-tre-tubulina.
Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare la tecnica automatizzata di taglio per il passaggio delle HBC, che mantiene il contatto cellula-cellula per tutta la durata della vita delle cellule e della coltura. Questa procedura può essere adattata a molteplici tipi cellulari, come cellule staminali neurali derivate da cellule pluripotenti o cardio sferoidi.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo protocollo descrive un nuovo metodo meccanico di tritatura che consente l'espansione di aggregati sferici di cellule staminali neurali e cellule progenitrici senza dissociazione in sospensione di singole cellule. Il mantenimento del contatto cellula/cellula permette una crescita rapida e stabile per oltre 40 passaggi.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Ricerca sulle cellule staminali
Sfondo
- Il passaggio efficiente di neurosfere è fondamentale per mantenere la vitalità cellulare.
- I metodi tradizionali spesso alterano i contatti tra cellula e cellula.
- Questo studio esplora una tecnica meccanica di frammentazione per migliorare la crescita.
- Strategie di crescita a lungo termine sono essenziali per le cellule progenitrici neurali umane.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo che mantenga i contatti tra cellule durante il passaggio.
- Confrontare le velocità di crescita delle neurosfere tagliate rispetto ai metodi enzimatici standard.
- Fornire una dimostrazione visiva della tecnica di taglio.
Metodi Utilizzati
- Combinare fino a due fiasche T 1 75 delle stesse cellule.
- Trasferire le cellule in un tubo conico per ulteriori lavorazioni.
- Tagliare gli aggregati in piccoli cluster utilizzando una lama.
- Risospendere i neurosfere tritate per il trasferimento in nuove fiasche.
Risultati principali
- La tecnica del trinciamento favorisce tassi di crescita logaritmica a lungo termine.
- I risultati indicano una crescita migliorata rispetto ai metodi tradizionali.
- Dimostrazioni visive evidenziano l'efficacia della tecnica.
- Neurosferoidi trinciati hanno mantenuto una migliore vitalità cellulare nel tempo.
Conclusioni
- Il metodo meccanico di trinciatura è efficace per espandere le cellule progenitrici neurali.
- Il mantenimento del contatto cellula-cellula è fondamentale per una crescita ottimale.
- Questa tecnica offre un'alternativa promettente al passaggio enzimatico.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo meccanico di frammentazione consente l'espansione scalabile di aggregati di cellule staminali e progenitrici neurali umane mantenendo i contatti critici tra cellula e cellula, affrontando un collo di bottiglia fondamentale nella produzione di cellule staminali sia per applicazioni di ricerca che cliniche. Evitando la dissociazione enzimatica, la tecnica riduce la pressione differenziativa e il rischio di senescenza, favorendo la produzione costante di prodotti cellulari neurali rilevanti dal punto di vista clinico in condizioni di cGMP. Ciò colloca il metodo come uno strumento prezioso per ridurre i rischi nella validazione precoce di bersagli neurali e per consentire la generazione riproducibile di modelli preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Mantiene le interazioni fisiologiche tra cellule nelle colture di progenitori neurali, favorendo studi sull'interazione con il bersaglio più biologicamente rilevanti.
- Valore operativo: Consente un'espansione a lungo termine per oltre 40 passaggi, garantendo un approvvigionamento sostenuto di cellule per campagne iterative di validazione del bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce colture omogenee di sferoidi adatte a formati sperimentali standardizzati che richiedono un'architettura cellulare tridimensionale.
- Valore operativo: Genera rese elevate (>50 milioni di cellule per fiasca T175) rispetto alle colture aderenti, migliorando la produttività del screening e l'efficienza dei reagenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione rilevante per le malattie espandendo cellule derivate da cellule staminali pluripotenti o da tessuto fetale senza deriva fenotipica.
- Valore operativo: Compatibile con la produzione conforme ai criteri cGMP, facilitando una transizione senza interruzioni dalla fase di scoperta alla produzione su scala clinica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo del chopping si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo l'espansione affidabile di cellule progenitrici neurali per la validazione degli obiettivi, lo sviluppo di saggi e la riduzione del rischio meccanicistico prima dell'identificazione del composto leader.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi mediante la coltura prolungata di aggregati neurali fisiologicamente rilevanti.
- Screening: Fornisce risultati riproducibili con un elevato numero di cellule, essenziali per la standardizzazione dei saggi e le campagne di screening di composti.
- Analisi: Permette la quantificazione della cinetica di espansione e delle metriche di vitalità per supportare decisioni di tipo go/no-go.
- Ricerca traslazionale: Mantiene la fedeltà cellulare dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica, riducendo la variabilità biologica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di passaggio scalabile e automatizzata applicabile a diverse fonti di cellule staminali neurali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva grazie al mantenimento dei contatti cellulari nativi e alla riduzione di artefatti indotti dalla coltura.
- Valore operativo: Il passaggio meccanico standardizzato minimizza la variabilità tra utenti e supporta processi scalabili e riproducibili.
- Valore strategico: Riduce il rischio biologico nei programmi con bersagli neurali assicurando una qualità cellulare costante tra i diversi passaggi.
- Impatto sul portafoglio: Permette decisioni di avanzamento corrette in base al rischio grazie a un approvvigionamento affidabile di cellule conforme ai requisiti cGMP per studi preclinici e clinici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede una formazione nella tecnica asettica e nell'uso del tritacarne meccanico.
- Dipende dall'accesso a lame sterili, provette coniche, piastre di Petri e incubatori.
- Necessita di passaggi standardizzati di condensazione e risospensione per garantire una distribuzione uniforme delle dimensioni delle sfere.
- L'adattamento tra diversi sistemi modello potrebbe richiedere l'ottimizzazione dello spessore del taglio e della forza applicata alla lama.
- I limiti pratici includono la necessità di passaggi manuali di rimozione del mezzo durante la condensazione, che possono influenzare la produttività se non ottimizzati.
