Un metodo di espansione cGMP-applicabile per Aggregati di neurali umane staminali e cellule progenitrici derivate da cellule staminali pluripotenti o fetale tessuto cerebrale

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di far passare in modo efficiente le neurosfere in modo che il contatto tra cellule sia mantenuto per tutta la durata della vita delle cellule in coltura. Questa tecnica crea le condizioni di espansione necessarie per le cellule progenitrici neurali umane. Ciò si ottiene combinando fino a due fiasche T 1 75 delle stesse cellule e trasferendole in un tubo conico, consentendo il trasferimento delle sfere in una piastra di Petri come secondo passaggio condensato in neurosfere sospese in una massa gestibile sulla piastra di Petri, che consente alla lama di tagliare gli NPC H in piccoli cluster.

Successivamente, le neurosfere passate o tagliate vengono risospese per rimuovere le cellule dalla capsula di Petri e inserirle nelle nuove fiasche. Si ottengono risultati che dimostrano che la tecnica di taglio fornisce una strategia di crescita a lungo termine basata sulle curve di espansione che dimostrano tassi di crescita logaritmici a lungo termine rispetto alle cellule passate tramite l'approccio enzimatico standard. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale come sfera.

Le fasi di condensazione sono difficili da descrivere per iscritto. Ci sono anche diversi trucchi per aiutare nel processo. Se il terreno in eccesso non viene completamente rimosso dalla capsula di Petri, le sfere verranno semplicemente spinte nel mezzo invece di essere divise in gruppi più piccoli.

Inizia questa procedura affrontando il colore del supporto del pallone di NPC H. Scansiona il pallone al microscopio per osservare le cellule. Se possibile, usa un radicale per esaminare le dimensioni di diverse sfere.

Se molte sfere hanno un diametro di 300 micrometri o superiore, procedere con il processo di triturazione e tritare le celle ogni sette-10 giorni. Quindi riposizionare il pallone nell'incubatrice e posizionare il tritatutto. Accendere l'interruttore di alimentazione del tritatutto.

Nel BSC, impostare lo spessore di taglio a 200 micrometri e la forza della lama a 180 gradi o alla posizione delle nove. Quindi, verificare che la manopola della velocità automatica sia ruotata il più possibile in senso antiorario. Quindi spostare la manopola di rilascio del tavolo il più a destra possibile e verificare che il portatarga sia stabile.

Ruotare il manipolatore manuale del braccio in senso orario per sollevare il braccio al livello massimo. Successivamente, trasferire asetticamente una lama di trinciatura sterile a doppio taglio sul bullone del braccio del tritatutto. Usando un paio di pinze, posiziona la fibbia sulla lama usando la pinza.

La parte curva della fibbia deve trovarsi sopra il bordo superiore del braccio. Quindi, tieni la fibbia sul braccio e fissa il dado sul bullone. Con il cacciavite sterile, lasciando il dado allentato di un quarto di giro.

In questa procedura, trasferire la quantità suggerita di materiale di manutenzione nel nuovo pallone. Successivamente, trasferire asetticamente le cellule dall'incubatore al BSC. Appoggiare il pallone su una griglia per provette e lasciare che le sfere si depositino nel pallone.

Uno si è sistemato. Aspirato fino a 12 millilitri di surnatante. Con una pipetta sierologica da 10 millilitri, sciacquare tutte le sfere poco aderenti dalla superficie del pallone.

Ripeti se necessario e lascia che le sfere si stabilizzino tra i Ren. Quindi, trasferire il volume suggerito di fluido condizionato nel nuovo pallone. Quindi trasferire tutti i mezzi condizionati e le sfere rimanenti in un nuovo tubo conico da 15 millilitri.

Lasciare che le sfere si depositino e scartare il pallone usato. Successivamente, trasferire lentamente le cellule dal tubo conico da 15 millilitri alla piastra di Petri da 60 millimetri o al disco di spessoramento nel volume più basso possibile. Conservare il terreno condizionato rimanente in quanto verrà utilizzato per sciacquare le celle dal piatto dopo il taglio.

Cerca di ridurre al minimo la superficie coperta dai supporti e dalle sfere sul piatto. Quindi, inizia a condensare la piscina di sfere trasferendo nuovamente il super natin nel tubo conico da 15 millilitri. Rimuovere la maggior quantità possibile di terreno dalla parte superiore del pool di celle con un micropipettatore con punta a barriera per aerosol.

Fino a quando non è possibile rimuovere i supporti senza sfere, stendere la piscina. Utilizzando il lato della punta della pipetta per aumentare la superficie, inclinare leggermente la capsula di Petri e utilizzare il lato della punta della pipetta per far scorrere delicatamente tutte le sfere su un lato della piscina. Dopo che tutte le cellule sono state riposizionate, inclinare lentamente la capsula di Petri nella direzione opposta per consentire al terreno di separarsi dalle sfere.

Successivamente, trasferire nuovamente il supporto pulito nella provetta conica da 15 millilitri. Utilizzare il lato della punta della pipetta per far scorrere delicatamente tutte le sfere al centro della capsula di Petri. Quindi la piscina ha un diametro da 0,5 a 2,4 centimetri.

È importante mantenere bassa la profondità della piscina a sfere. Se la piscina è troppo profonda, le sfere verranno spinte da parte durante il taglio. A questo punto, trasferire la capsula di Petri sul portatarga e fissarla sotto i ganci portapiatti.

Utilizzare la manopola di rilascio del tavolo per far scorrere il portatarga verso sinistra in modo che la lama sia lontana dalle sfere e bloccata nell'ingranaggio. Quindi, abbassare il braccio del tritatutto ruotando la manopola del manipolatore manuale in senso orario fino a quando la lama non scatta in piano sulla capsula di Petri. Premere sul supporto del braccio mentre si stringe il dado.

Quindi premere il pulsante di ripristino. Una volta ferma la capsula di Petri con una mano mentre ruoti la manopola del manipolatore automatico del braccio in senso orario a 90 gradi o a ore 12 e inizia a tritare quando tutte le sfere sono state tagliate. Ruotare il portatarga di 90 gradi.

Quindi allentare il bullone, abbassare il braccio e serrare nuovamente il dado. Ripetere la procedura di tritatura. Successivamente, in modo asettico, trasferire la capsula di Petri dal portapiastre in uno spazio di lavoro nel BSC.

Trasferire un millilitro di terreno condizionato sulle sfere tritate. Quindi risospendere delicatamente e trasferire le sfere tritate in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Cerca di evitare di formare bolle e ripeti tutte le volte che è necessario per raccogliere le sfere tritate.

Misurare il volume del mezzo condizionato e delle sfere tritate. Aggiungere la quantità appropriata di mezzi di manutenzione per ottenere il volume suggerito nella tabella due colonne E.Successivamente, Eloqua la sospensione della sfera in ogni nuovo pallone, trasferire solo la sospensione della sfera in un pallone alla volta e risospendere le sfere tra i trasferimenti. Il volume finale in ogni pallone dovrebbe essere uguale al volume suggerito nella tabella due Colonna F.Posizionare gli NPC h tritati nell'incubatrice.

Questa figura mostra il numero di cellule proiettato di NPC H congelate al passaggio 19, quindi scongelate ed espanse come un monostrato aderente utilizzando la dissociazione enzimatica rispetto alle neurosfere passate tramite il metodo di taglio. Ecco le immagini rappresentative di sfere pre-tagliate e post tagliate a 10 x di ingrandimento. Questa immagine mostra le NPC del passaggio di disgelo 29 H che sono state piastrate per un giorno e colorate per il nido e l'espressione, mentre questa immagine mostra le NPC del passaggio di disgelo 29 H che sono state piastrate per sette giorni in assenza di fattori di crescita e colorate per GFAP e beta tre tubulina.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la tecnica di taglio automatizzato per far passare gli HBC, che mantiene il contatto da cellula a cellula per tutta la vita delle cellule e della coltura. Questa procedura può essere adattata a una moltitudine di tipi di cellule, come le cellule staminali neuro derivate da cellule pluripotenti o le sfere cardio.