Name: Un metodo di espansione cGMP-applicabile per Aggregati di neurali umane staminali e cellule progenitrici derivate da cellule staminali pluripotenti o fetale tessuto cerebrale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Scopri un metodo meccanico di taglio per espandere aggregati di cellule progenitrici neurali umane mantenendo il contatto cellulare. Questa tecnica consente una crescita logaritmica stabile per oltre 40 passaggi.

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Ringraziamo il Dott. Soshana Svendsen per la revisione critica e la modifica di questa relazione. Questo lavoro è stato contribuito per il NIH / NINDS 1U24NS078370-01 e CIRM DR2A-05320.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

<img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Tagliere schematica. Espansione cellule staminali sferoide / progenitrici nella cultura utilizzando il metodo di trinciatura meccanica. Fasi critiche Una panoramica del paradigma espansione tagliere è mostrato in Figura 6. HNPC dimensione della sfera è uno dei criteri im...

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Brandon C. Shelley 
to:
Clive Svendsen

A correction was made to <a href="/video/51219">A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue</a>. The corresponding author was changed.

Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

C&#39;è una lunga storia di espansione delle cellule staminali neurali roditori nella cultura sia come monostrato 1-3 o neurosfere di aggregazione 4-7. Inoltre, le cellule progenitrici neurali umane (hNPCs) isolati da varie regioni del sistema nervoso centrale sviluppo 8-17 sono state espanse in vitro. Queste cellule sono bi-potente, in grado di differenziarsi in entrambi astrociti e neuroni e sono stati uno strumento molto utile per lo studio dello sviluppo neurale 18,19 e la malattia meccanismo 20,21. hNPCs sono stati trapiantati in molti diversi modelli animali di malattia del sistema nervoso centrale con diversi livelli di integrazione, sopravvivenza e effetti funzionali 22-24. Tradizionalmente, roditori o NPC fetali derivate umani sono esposti a fattori di crescita - spesso fattore di crescita epidermico (EGF) e / o il fattore di crescita dei fibroblasti-2 (FGF-2) 25-28 - e sia aderente 29 e treSistemi sferoidali-dimensionali sono in genere diversi passaggi utilizzando dissociazione enzimatica in una cella singola sospensione 30-34. Il metodo standard per espandere le cellule per la ricerca o l&#39;uso clinico è come un monostrato aderente a causa di una facile manipolazione. Tuttavia, abbiamo dimostrato che passaging monostrato e neurosfere hNPCs con enzimatici o soluzioni chimiche portato nei primi mesi del senescenza 35. Inoltre, dissociazione enzimatica può provocare un aumento dei livelli di differenziazione e di anomalie del cariotipo sulla base di dati dimostrati con le cellule staminali embrionali 36-38. Anche se il metodo standard di hNPCs Passaging ha prodotto corrente di buona fabbricazione (cGMP) i prodotti di qualità che sono andati in fase 1 studi clinici (Stem Cells Inc., Neuralstem Inc.), il metodo consentito solo un paio di giri di amplificazione delle cellule, limitando l&#39; potenziale bancario. Chiaramente, i grandi esperimenti di ricerca e studi clinici futuri potrebbero beneficiare della capacità dipropagare cellule in massa e con senescenza ritardata per consentire la crescita su larga scala e banking di cellule. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo sviluppato un modo nuovo e automatizzata di neurosfere intatte meccanicamente Passaging da &quot;tagliare&quot; li in piccoli gruppi per mantenere il contatto cellula-cellula. Questo metodo notevolmente aumentato la loro durata di vita 39 e la sospensione della cultura permette un uso più efficiente dello spazio incubatore rispetto a colture monostrato, come si è visto con 3D metodo di coltura del bioreattore alternativo 40. Il protocollo tagliere fornito permette la produzione di banche di grandi dimensioni da un campione fetale maggiore di passaggio 10, un&#39;impresa improbabile utilizzando metodi passaging standard. Mentre questo metodo per hNPCs passaging è non convenzionale, sta crescendo in popolarità ed è stato recentemente, pubblicato con altri tipi di cellule come le cellule staminali neurali derivate da embrioni umani e cellule staminali pluripotenti indotte, consentendo l&#39;espansione su larga scala per varie applicazioni, tra cui in vitro modellazione malattia 41-46. Soprattutto, una banca di cellule hNPC cGMP-grade è già stato prodotto con il metodo tagliere, dimostrando che la tecnica può essere applicata verso future applicazioni cliniche.

<table><tbody><tr><td>Becher, 50 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-100-50</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Armadio di bio-sicurezza, classe II</td><td>Baker</td><td>SG-603A</td><td>Modello da 4 piedi o 6 piedi.&nbsp; Modello da 6 piedi consigliato; più produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Lame, Doppio taglio Prep</td><td>Personna</td><td>74-0002</td><td>più produttori/fornitori.&nbsp; ATTENZIONE:</td></tr><tr><td>Sharp Cell Freezing Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6295-50ML</td><td>DMSO, centrifuga senza siero</td></tr><tr><td>, secchio oscillante con inserti da 15 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Tubi conici, 15 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>S50712</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Tubi conici, 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352074</td><td>vari produttori/ fornitori</td></tr><tr><td>Pialla per congelatore a velocità controllata</td><td></td><td>Kryo 750</td><td>produttori / fornitori multipli</td></tr><tr><td>Cryovials, 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>produttori / fornitori multipli</td></tr><tr><td>Pallone di coltura, ventilato, T12.5</td><td>BD Falcon</td><td>353107</td><td>produttori / fornitori multipli</td></tr><tr><td>Pallone di coltura, ventilato, T25</td><td>BD Falcon</td><td>353081</td><td>vari produttori / fornitori</td></tr><tr><td>Fiaschetta di coltura, ventilata, T175</td><td>BD Falcon</td><td>353045</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Fiaschetta di coltura, ventilata, T75&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353110</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Filtro, 0.22 &; m, tazza attaccata, 1 L</td><td>Millipore</td><td>SCGPU11RE</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Filtro, 0.22 &; m, tazza attaccata, 150 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGVU01RE</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Filtro, 0.22 &; m, tazza attaccata, 500 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Filtro, 0.22 &; m, tazza attaccata, 50 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Carta da filtro, cerchi da 8,5 cm Pinza</td><td>Whatman/GE</td><td>1001-085</td><td></td></tr><tr><td>, modello standard - Seghettato/Curvo/18 cm</td> Camera di congelamento <td>Fine Science Tools</td><td>11001-18</td><td></td></tr><tr><td>, alcool isopropilico</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>"Mr. Frosty"</td></tr><tr><td>Incubatore, 37 gradi; C/5% CO2</td><td>Forma</td><td>370 series</td> vari <td>produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Emocitometro, Fase</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Lafayette Instruments</td><td>TC752-PD</td><td>·; È richiesta la modifica della piastra di Petri. &nbsp; ATTENZIONE:&nbsp; Lama mobile e affilata.</td></tr><tr><td>Micropipettatore, 1-10 &mu; l</td><td>Gilson</td><td>F144562</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Micropipettatore, 100-1.000 &mu; l (starter kit)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Micropipettatore, 2-20 &mu; l (starter kit)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Micropipettatore, 20-200 &mu; l (starter kit)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Avvitatore, Autoclavabile, 5/16"</td> <td>Steritool</td><td>10302</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette, tappo di cotone</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-8B</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Piastra di Petri, Vetro, Autoclavabile</td><td>Corning</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td>più produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Disco di spessore</td><td>McMaster-Carr</td><td>VARIABLE</td><td>più produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Puntali per pipette barriera sterili, 10 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV10R-H</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Puntali per pipette barriera sterili, 1.000 &; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV1000</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Puntali per pipette sterili barriera, 20 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV20-H</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Puntali per pipette sterili barriera, 200 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV200-H</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Pipette sterili monouso, involucro interamente in plastica, 10 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10J</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Pipette sterili monouso, involucro interamente in plastica, 2 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-675-3C</td><td>più produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Pipette sterili monouso, involucro interamente in plastica, 25 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10K</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Pipette sterili monouso, involucro interamente in plastica, 5 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10H</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Buste di sterilizzazione, 19 x 33 cm</td><td>Crosstex</td><td>SCL</td><td>più produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Filtro, 40 &; m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali, 60 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Rack per provette, ad incastro a quattro vie</td><td>Fisherbrand</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Fisherbrand</td><td>S52602Q</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>Progenitori neurali Reagenti</td><td></td><td></td><td></td>per la lavorazione specifici delle cellule</tr><tr><td>staminali neurali Mezzo di espansione (Stemline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3194-500ML</td><td>Importante utilizzare il marchio Stemline</td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico umano ricombinante (EGF)</td><td>Millipore</td><td>GF316</td><td>più produttori / fornitori</td></tr><tr><td>Fattore inibitorio della leucemia umana ricombinante (LIF)</td><td>Millipore</td><td>LIF1010</td><td>più produttori / fornitori</td></tr><tr><td>Trypan Blue (0.4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td>vari produttori/fornitori</td></tr><tr><td>TrypLE Select (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12563-011</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo di espansione cgmp-applicabile per aggregati di neurali umane staminali e cellule progenitrici derivate da cellule staminali pluripotenti o fetale tessuto cerebrale

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Una tecnica di espansione delle cellule ad accumulare un gran numero di cellule da un singolo esemplare per esperimenti di ricerca e studi clinici sarebbe di grande beneficio alla comunità di cellule staminali. Molti metodi di espansione attuali sono laboriosi e costosi, e quelli che coinvolgono completa dissociazione possono causare diversi tipi di staminali e cellule progenitrici di sottoporsi a una differenziazione o all&#39;inizio senescenza. Per superare questi problemi, abbiamo sviluppato un metodo passaging meccanico automatizzato denominato &quot;taglio&quot; che è semplice e poco costoso. Questa tecnica evita dissociazione chimica o enzimatica in cellule singole e invece consente l&#39;espansione su larga scala di sospensione, culture sferoidali che mantengono il contatto cellula / cellula costante. Il metodo di taglio è stato utilizzato principalmente per fetali cellule progenitrici neurali del cervello-derivato o neurosfere, ed è stato recentemente pubblicato per l&#39;utilizzo con le cellule staminali neurali derivate da cellule staminali pluripotenti embrionali e indotte. La procedura involves semina neurosfere su un piatto di coltura di tessuti Petri e in seguito una tagliente, la lama sterile attraverso le cellule automatizzare efficacemente il tedioso processo di manualmente dissociare meccanicamente ogni sfera. Sospendere cellule in coltura fornisce una superficie favorevole rapporto area-volume; come oltre 500.000 cellule possono essere coltivate in un singolo neurosfere inferiore a 0,5 mm di diametro. In un pallone T175, oltre 50 milioni di cellule possono crescere in colture in sospensione rispetto a solo 15 milioni nelle culture aderenti. È importante sottolineare che la procedura di taglio è stata utilizzata in corrente di buona fabbricazione (cGMP), permettendo la produzione di quantità di massa di prodotti di cellule clinico-grade.

<img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig5highres.jpg" width="500" /> Il numero di cellule Figura 5. Dati rappresentativi. A) previsti delle hNPCs congelati a p19, poi scongelati e ampliato come un monostrato aderente con dissociazione enzimatica rispetto al neurosfere diversi passaggi tramite il metodo tagliere. Giorno 0 rappresenta quando le cellule sono state scongelati a p20. B) Immagini rappresentativ...

Questo protocollo descrive un metodo tagliere meccanico romanzo che consente l&#39;espansione di staminali e cellule progenitrici aggregati sferici neurali senza dissociazione di una sospensione di cellule singole. Mantenere il contatto cellula / cellula consente una crescita rapida e stabile per oltre 40 passaggi.

Un metodo di espansione cGMP-applicabile per Aggregati di neurali umane staminali e cellule progenitrici derivate da cellule staminali pluripotenti o fetale tessuto cerebrale

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di passaggiare in modo efficiente i neurosfere in modo da mantenere il contatto cellula-cellula per tutta la durata della coltura cellulare. Questa tecnica crea le condizioni di espansione necessarie per le cellule progenitrici neurali umane. Ciò si ottiene combinando fino a due fiasche T175 contenenti le stesse cellule e trasferendole in un tubo conico, consentendo così il trasferimento delle sfere in una piastra di Petri come secondo passaggio, concentrandole in una massa gestibile di neurosfere sospese sulla piastra di Petri, il che permette alla lama di tagliare le HNPC in piccoli cluster.Successivamente, le neurosfere passate o tritate vengono risospese per rimuovere le cellule dalla piastra di Petri e trasferirle nei nuovi flaconi. I risultati ottenuti mostrano che la tecnica di tritatura fornisce una strategia di crescita a lungo termine, basata sulle curve di espansione che dimostrano tassi di crescita logaritmica prolungati rispetto alle cellule passaggiate mediante l'approccio enzimatico standard. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale come sfera.È difficile descrivere per iscritto i passaggi di cond

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La capacità di manipolare le staminali neurali umane / precursore cellule (hNSPCs) in vitro permette di indagare la loro utilità come i trapianti di cellule a fini terapeutici e di esplorare lo sviluppo umano neurale. Questo protocollo presenta un metodo di coltura e hNSPCs passaging nella speranza di aumentare la riproducibilità della ricerca sulle cellule staminali.

Passaging cellule staminali neuronali

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Generazione di cellule staminali neurali da scartate tessuto fetale umano corticale

Protocolli per la differenziazione neuronale di cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sono spesso molto tempo e richiedono notevoli capacità di colture cellulari. Qui, abbiamo adattato una piccola molecola procedura basata differenziazione di un formato di piastra multititre, permettendo la generazione semplice, rapido, efficace e di neuroni umani in modo controllato.

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Questa procedura produce neuroni telencefalici passando attraverso i punti di controllo che sono simili a quelli osservati durante lo sviluppo umano. Le cellule possono differenziarsi spontaneamente, sono esposti a fattori che li spingono verso il lineage neurale, sono isolati, e vengono piastrate su vetrini per consentire la differenziazione terminale e maturazione.

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Qui presentiamo un metodo per un modello umano in vitro della lesione elasticizzato in un formato a 96 pozzetti su una scala cronologica pertinente all'impatto del trauma. Sono inclusi i metodi per la realizzazione di piastre stretchable, quantificare l'insulto meccanico, coltura e ferendo le cellule, imaging e alto contenuto analisi per quantificare il danno.

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In questo protocollo, ci proponiamo di descrivere un metodo riproducibile per combinare dissociato pluripotenti umane su cellule staminali neuroni e astrociti insieme in 3D sfera cocultures, mantenendo queste sfere in condizioni galleggiante libera e successivamente misurazione dell'attività sinaptica circuito delle sfere con immunoanalysis e registrazioni di matrice multielettrodo.

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Generazione scalabile di organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti umane e caratterizzazione da immunostaining

Questo articolo descrive un protocollo per la generazione di neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane in un bioreattore a sospensione 3D da banco.

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Scopri un metodo meccanico di taglio per espandere aggregati di cellule progenitrici neurali umane mantenendo il contatto cellulare. Questa tecnica consente una crescita logaritmica stabile per oltre 40 passaggi.

Un metodo di espansione cGMP-applicabile per Aggregati di neurali umane staminali e cellule progenitrici derivate da cellule staminali pluripotenti o fetale tessuto cerebrale (Video) | JoVE Journal

Un metodo di espansione cGMP-applicabile per Aggregati di neurali umane staminali e cellule progenitrici derivate da cellule staminali pluripotenti o fetale tessuto cerebrale

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