Name: Un modello di anossia-fame per ischemia / riperfusione in C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Scopri come modellare l'ischemia/riperfusione in C. elegans utilizzando anossia e fame. Questo metodo economico permette di studiare danni neuronali e risposte comportamentali con microscopia a fluorescenza.

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Figure 1 e 2 sono stati precedentemente pubblicati in Biologia Free Radical &amp; Medicina (Queliconi et al. 5) e hanno copyright detenuti da Elsevier. Questo lavoro è stato supportato dal Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), l&#39;Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de processos Redox em Biomedicina, il Núcleo de Apoio à Pesquisa de processos Redox em Biomedicina, USPHS NS064945 (KN), e USPHS GM087483 (KN ). BBQ è uno studente di dottorato sostenuto da una borsa di studio FAPESP.

1. C. elegans crescita <ol><li> Preparare 35 millimetri Nematode crescita media (NGM) piastre di agar seminate con i batteri OP50, come da metodi di coltivazione standard di 1. </li><li> Sincronizzare C. elegans, ponendo 6 adulti gravide su un piatto NGM seminato. Rimuovere il numero di adulti dopo ~ 100 uova sono state fissate (~ 3 ore). </li><li> Incubare le piastre per 3 giorni a 20 ° C, a quel punto i vermi avranno sviluppato a giovani stadio adulto e sono ottimali per questo esperimento. Protocolli alternativi per sincronizzare C. elegans sono descritte altrove 10. </li></ol> 2. Materiali per AS <ol><li> M9 tampone (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na 2 HPO 4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO 4) deve essere depurata di ossigeno equilibrando con N 2 (argon può anche essere usato) durante 30 min prima dell&#39;esperimento e tenuto circondato da ghiaccio. </li><li> Fai un piccolo foro (3 millimetrilarghezza) nel coperchio di 1,5 ml provette da microcentrifuga in cui i vermi saranno collocate durante AS. Il foro permette lo scambio di gas senza tenere il coperchio aperto, in quanto questo può portare a eccessiva della carta evaporazione. </li></ol> 3. Anossia / fame <ol><li> Condurre tutti gli esperimenti, almeno in triplicato. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone RT, M9 ossigenato per ogni placca 35 mm avente vermi adulti giovani coltivate come descritto sopra. Fare attenzione a non rimuovere i batteri dalla piastra (aggiungere M9 ai bordi dove i batteri non sono state seminate). Dopo circa 1 min i vermi dovrebbero essere nuotare nella M9. </li><li> Cappotto un puntale da 1 ml con BSA pipettando ed espellendo una soluzione sterile BSA 1%. </li><li> Inclinare con cautela il piatto contenente i vermi in un tampone M9, rimuovere la M9 dallo stesso luogo in cui è stato aggiunto, e posizionare la sospensione nei tubi microcentrifuga preparati. Far riposare in ghiaccio fino i vermi siano depositati sul fondo delle provette (~ 1-2 Min). </li><li> Rimuovere la quantità massima di M9 possibile senza disturbare i vermi dal tubo (lasciando circa 100 ml), aggiungere 1 ml di M9 ossigeno purgato e ghiacciata e posizionare il tubo sul ghiaccio fino a quando i vermi si depositano sul fondo di nuovo. Ripetere l&#39;ultimo passaggio 3x. In ultimo lavaggio, rimuovere la M9 fino ~ 100 microlitri rimane nel tubo. </li><li> Mettere le provette con i vermi in deoxygenated M9 all&#39;interno di una camera anossica / ipossia (vedere le istruzioni qui di seguito, Sezione 3.6.1) o, in alternativa, in un contenitore sigillato personalizzato (vedi istruzioni qui sotto, sezione 3.6.2). <ol><li> Se una camera anossica / ipossica commerciale deve essere utilizzato, lasciare alcune M9 spurgato all&#39;interno della camera prima di iniziare la fase 3.5 e ripetere il punto 3.5 una volta che i vermi sono all&#39;interno della camera. </li><li> Se una camera personalizzato deve essere utilizzato, una descrizione dettagliata di come creare un apparecchio a basso costo è presentato alla fine di questo protocollo ed è stato descritto da un altro gruppo in precedenza 11. In breve: <ol&gt; <li> Fare due fori in un coperchio da 250 ml Tupperware-tipo di contenitore e aggiungere connettori per tubi a loro. Uno sarà utilizzato per iniettare la miscela di gas mentre l&#39;altro sarà l&#39;uscita gas in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Posizionare i vermi nella camera e sigillare la camera con il coperchio. </li><li> Gas con un costante flusso di N 2 (100 ml / min). </li><li> Porre il contenitore in un bagno di acqua a 26 ° C. Assicurarsi che il tubo di uscita è ben immerso in acqua così non ritorni vie e che non vi siano perdite nel sistema (apparente da bolle derivanti dalla camera stessa). </li></ol></li></ol></li><li> Incubare i vermi a 26 ° C per 20 ore. </li></ol> 4. Riperfusione simulata <ol><li> Dopo 20 ore in condizioni di AS, rimuovere i tubi dalla camera di incubazione in aria ambiente. </li><li> Pipetta C. elegans con una punta BSA rivestito (come al punto 3.3) su un OP50 testa di serie 35 millimetri piastra NGM. Incubare le piastre a 20 ° C per 24 ore.Dopo questo, i vermi saranno pronti per essere segnato. </li></ol> 5. Identificare Morto Versus Live Worms <ol><li> Utilizzando un pick platino, toccare leggermente la parte superiore della testa della vite senza fine. Vermi vivi si sposteranno indietro dopo essere stato toccato. Se i vermi sono nonresponsive, segnare come morto. Occasionalmente, un verme non si muoverà all&#39;indietro, ma può presentare un leggero movimento della testa da lato a lato. Anche se non è tecnicamente morto, questi vermi sono quasi certo di scadenza entro poche ore, e dovrebbero essere classificati come morti. Se si aspetta troppo tempo per segnare i vermi, schiusa interna della progenie può accadere e queste &quot;borse-di-vermi&quot; può rompersi, facendo rilevare le carcasse molto difficile. </li><li> Rimuovere entrambi i vermi vivi e morti dalla piastra se essi sono computati al fine di evitare conteggi doppi. I vermi vivi possono essere spostati in un piatto a parte per eseguire test comportamentali. La quantità di vermi viventi relativi al totale è rappresentato come la% di vermi sopravvissuti (Figura 1A </strong&gt;). </li></ol> 6. Toccare risposta Assay <ol><li> Una descrizione dettagliata di questo protocollo è stato presentato in Hart, Anne C., ed. Comportamento (3 luglio 2006), WormBook, ed. La C. elegans Comunità di Ricerca, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. <ol><li> A segnare per la risposta al tocco, identificare i vermi che si muovono e toccano leggermente il lato della testa del verme (vicino alla parte centrale della faringe) con uno scalpello ciglio (Figura 3). </li><li> Se il worm si muove indietro, segnare come reattivo, se non, segnare come non risponde (Figura 1B). Ripetere questa operazione 10-15x per ogni vite senza fine con intervalli di 10 secondi. Sonda almeno 10 vermi in ogni gruppo per avere dati precisi. Lo stesso test può essere utilizzato per valutare i cambiamenti in avanti locomotore seguente tocco leggero alla parete posteriore del corpo. Fare attenzione a non toccare la testa o la coda del verme, dal momento che questo stimola un comportamento diverso. </li><li> Infine, inceppi di controllo genetico aziendali [N2 Bristol wild-type per il positivo, mec (mechanosensory) mutante di negativo - ad esempio CB1338 mec-3 (e1338) IV] per calibrare la forza con cui a toccare i vermi. Troppo dura di una stimolazione sarà suscitare una risposta comportamentale in mutanti MEC, troppo poco non si suscitare un effetto nei controlli N2 tipo selvatico. </li></ol></li></ol> 7. Neuronale modifiche <ol><li> Per visualizzare Post come modificazioni neuronali, utilizzare un ceppo che esprime GFP in-rispondere al tocco MEC neuroni 4,5. Questi neuroni sono lunghi processi che corrono lungo la parete del corpo e sono facilmente segnati per anomalie morfologiche. Inoltre, l&#39;informazione morfologica può essere integrato con misure comportamentali di funzione neuronale, come descritto sopra. Un ceppo che può essere utilizzato per questo scopo è TU2583, che è disponibile dalla C. elegans Genetics Center e contiene il transgene integrato uIs25 che esprimono GFP from il mec-18 promotore o, in alternativa TU2562, che contiene un mec-3 :: GFP fusion integrata. </li><li> Preparare un pad agarosio. <ol><li> Sciogliere 2% agarosio in acqua, portare a 1x M9 con uno stock 10x, e mantenere la soluzione a 70 ° C. </li><li> Una goccia (~ 20 microlitri) di questa soluzione in un vetrino (25 mm x 75 mm) che è stato inserito tra altri due slitte, ognuna delle quali ha un unico pezzo di nastro sul loro lato inferiore. </li><li> Posizionare un vetrino finale perpendicolare alla prima sulla superficie della soluzione di agarosio al 2%, e lasciate raffreddare a temperatura ambiente. Questo dovrebbe formare un pad che è lo spessore del nastro. </li><li> Rimuovere la slitta superiore e aggiungere 10 ml di M9 contenenti 0,1% Tetramisole, che immobilizzare i vermi. </li></ol></li><li> Spostare alcuni (~ 10) vivere vermi sul 2% agarosio diapositiva. Posizionare un vetrino su di loro e visualizzare GFP utilizzando un microscopio a fluorescenza in un obiettivo 100X con l&#39;illuminazione adeguata. </li><li> Danneggiatoneuroni mostrerà una stringa citosolico membrana del reticolo perle nei processi, composto punctum multiple (Figura 2A), e / o anomalie in cui i processi sembrano essere ignorate (Figura 2B). Conte punctum e le anomalie in entrambi i neuroni per ogni verme, con un totale di almeno 10 vermi. </li></ol> 8. Lab-made Hypoxic Camera <ol><li> Uno stile Tupperware, richiudibile, contenitore chiuso ermeticamente può essere retrofit come una camera anossica. Fare attenzione a scegliere un contenitore che è il più piccolo possibile. Un piccolo contenitore crea un ambiente ipossico più veloce ed è più facile da montare nel bagno d&#39;acqua (Figura 4). </li><li> Fai due fori sul coperchio (può essere fatto con un cacciavite o riscaldando pinze e costringendo nel coperchio) e inserire un connettore di plastica o di metallo che si inserisce il tubo (Figura 5A). Utilizzare colla che può essere posizionato sotto l&#39;acqua, e diventa difficile anche dopo essiccamento, evitando di movimentoil connettore e quindi riducendo la possibilità di perdite (Figura 5B). </li><li> Il contenitore deve essere collocato nella vasca d&#39;acqua in modo che sia completamente sommerso (Figura 4). Per immergere il contenitore, utilizzare un peso bottiglia o un peso immersioni. </li><li> Uno dei raccordi dei tubi saranno utilizzati per introdurre una miscela di gas e l&#39;altro tubo fungerà da sovrappressione, quindi, andrebbe lasciata sotto l&#39;acqua in modo che il contenitore è sigillato rispetto all&#39;ambiente esterno (Figura 4). </li><li> La composizione dell&#39;aria può essere modulata utilizzando il gas su misura, controllori di flusso di massa o di qualsiasi apparato che mescola i gas desiderati. Il flusso di gas deve essere controllato, come flusso elevato può creare eccessiva evaporazione. Ad esempio, in un contenitore da 250 ml, 100 ml / min di gas fornirà buon spazio per i vermi e un flusso adeguato. </li><li> La lunghezza del tubo deve essere ridotto al minimo, in quanto possono essere permeabile ai gas, unallowing l&#39;ingresso di O 2. È importante evitare l&#39;uso di silicone, Tygon provette come questi materiali sono permeabili scambio di gas. Noi preferiamo tubi di polipropilene o nylon. Vetro o tubi di metallo mantengono i gas bene, ma sono anche più difficili da lavorare. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Come è stato ampiamente utilizzato in C. elegans per modellare lesioni IR. Alcuni punti chiave dovrebbero essere evidenziati per questo protocollo: C. elegans sono resistenti a una vasta gamma di lesioni, che giustifica la necessità per 3 insulti concomitanti (calore, fame e anossia) per raggiungere morte con questo sistema. Solo Anoxia non uccide i vermi in questa finestra di tempo 14. Inoltre, l&#39;aumento della temperatura è un ulteriore stress, quindi è importante monitorare attentamente. In senso stretto, la fame non contribuisce significativamente al grado di mortalità osservata 7, di per sé, ma sembra ridurre la variabilità tra le repliche sperimentali. Dato che non ci può essere variabilità significativa dal giorno per giorno, è estremamente importante per confrontare i campioni eseguiti direttamente in parallelo, e di ripetere gli esperimenti su più giorni. In generale, i risultati vengono valutati per tre piastre separate di 50-100 vermi / condizione sperimentale e questi sono in media e considerato come una singola replica sperimentale. In generale, tra i sette ei nove repliche sembrano essere sufficienti per raggiungere o escludere la significatività statistica. Ha bisogno anche lo stadio di sviluppo dei vermi utilizzati nell&#39;esperimento essere attentamente monitorati come la suscettibilità delle diverse fasi di AS danni varia significativamente 15,16. L&#39;uso dei giovani adulti è standard, e la fase larvale (L3 e L4) vermi sembrano essere più resistenti agli effetti dannosi di AS (dati non pubblicati). Questo protocollo offre due modi per eseguire gli esperimenti, uno con un apparato di laboratorio-made (utilizzando contenitori Tupperware tipo e gas in ingresso 11) e altre con una camera ipossica commerciali 4,6. Anossia può essere ottenuto con altri mezzi che consumano l&#39;ossigeno, come descritto altrove 13,17. L&#39;uso di tecniche alternative per creare un ambiente ipossico può cambiare il tempo di incubazione AS necessarioper creare la quantità desiderata di morte. Targeting ~ 20% di sopravvivenza è un punto di partenza ideale per studiare interventi protettivi, mentre l&#39;80% è altrettanto ideale per gli interventi che aggravano gli effetti negativi di AS. Un altro avvertimento importante è il momento in cui i punteggi osservatore vermi morti / vivi. Se il tempo di analisi è estesa oltre 24 ore, i dati possono essere fuorviante in quanto vermi morti diventano sempre più difficili da identificare. Ciò può essere dovuto alle carcasse verme diventare relativamente trasparente nel tempo, ma anche al fatto che gli embrioni fecondati possono svilupparsi in progenie post-mortem all&#39;interno delle carcasse e disturbare loro che emergono. L&#39;analisi della morfologia neuronale può essere modificato per guardare proteina espressione modelli 18, frammentazione nucleare 4 e altri parametri 19 sostituendo un ceppo verme che esprime l&#39;appropriato marcatore geneticamente codificato. Un avvertimento finale è che la visualizzazione dellaprocessi neuronali dovrebbero essere fatte meno di 30 min dopo aver posizionato i vermi sul vetrino. Animali tenuti sotto anestesia su vetrini per periodi più lunghi possono presentare danni AS-indipendente. Regolare la quantità di animali per vetrino in base al tempo necessario per monitorare e analizzare loro.

C. elegans è un nematode che è stato ampiamente adottato come multicellulare eucariotica organismo modello sin dalla sua introduzione da Brenner 1. Si tratta di un modello semplice, economico e versatile, che permette facili collegamenti tra le alterazioni genetiche e fenotipiche cambia 2. L&#39;ischemia è caratterizzata da una mancanza di nutrienti e di ossigeno ad un tessuto, seguita da riperfusione, quando una raffica di specie reattive dell&#39;ossigeno è prodotto 3 e la maggior parte del danno. Nel 2002, un modello di ischemia / riperfusione (IR) in C. elegans è stato sviluppato 4 riguardanti la presentazione dell&#39;intero worm per anossia, la privazione di nutrienti e stress da calore per circa 20 ore, seguito da 24 ore in condizioni normali. Anche se questo modello è tecnicamente un anossia-fame (AS) condizione, la morte cellulare avviene attraverso meccanismi che sono conservati nei mammiferi, incluso il danno indotto da ossidanti durante la riperfusione &lt;sup&gt; 5. Inoltre, simili a mammiferi IR, danno indotto da AS in C. elegans può essere evitata mediante precondizionamento ischemico 6,7 o 8,9 precondizionamento anestetico. I protocolli di seguito viene illustrato come imitare IR in C. elegans utilizzando il modello AS, come a segnare anomalie morfologiche e comportamentali che derivano da AS, e come adattare il protocollo in modo da consentire l&#39;esperimento possa essere condotta con un investimento iniziale inferiore utilizzando una misura, facilmente costruito un&#39;alternativa camera .

<table><tbody><tr><td>Ceppo N2&nbsp;</td><td>CGC</td><td></td><td>Ceppo di tipo selvatico. http://www.cbs.umn.edu/CGC/</td></tr><tr><td>TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)</td><td>CGC</td><td>TU2583</td><td>transgene fluorescente integrato utilizzato per marcare i neuroni tattili.
http://www.cbs.umn.edu/CGC/</td></tr><tr><td>CB1338 mec-3 (e1338)IV</td><td>CGC</td><td>CB1338</td><td>mutante mec-3 canonico insensibile al tocco.
http://www.cbs.umn.edu/CGC/</td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U Microscopio&nbsp;</td><td>Nikon USA</td><td>TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a bassa temperatura</td><td>Sheldon Manufacturing Inc.</td><td>Modello 2005</td><td></td></tr><tr><td>Picconcime</td><td></td><td></td> per ciglia <td>Un plettro per ciglia può essere preparato attaccando una ciglia su uno stuzzicadenti di legno, quindi attaccando lo stuzzicadenti in una pipetta di vetro Pasteur (<forte>Figura 3</forte>).</td></tr><tr>Camera <td>ipossica</td><td>Coy</td><td>8307030</td><td>Scatola a guanti ipossica dotata di catalizzatore al paladio e controller CO2.</td></tr></tbody></table>

un modello di anossia-fame per ischemia / riperfusione in<em&gt; c. elegans</em

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocolli per anossia / fame nel modello di organismo genetico C. elegans simulare ischemia / riperfusione. Worms sono separati dal cibo batterica e poste sotto anossia per 20 ore (ischemia simulata), e successivamente trasferiti in un ambiente normale con il cibo (riperfusione simulata). Questo sperimentali risultati paradigma in aumento della morte e danno neuronale, e tecniche sono presentati per valutare la vitalità dell&#39;organismo, alterazioni della morfologia dei processi tocco neurone, nonché sensibilità al tocco, che rappresenta l&#39;uscita del comportamento della funzione neuronale. Infine, un metodo per la costruzione incubatori ipossiche utilizzando contenitori cucina comune è descritto. L&#39;aggiunta di una unità di controllo del flusso di massa consente modifiche da apportare alla miscela di gas nelle incubatrici personalizzati, e un bagno di acqua circolante consente sia il controllo della temperatura e rende facile identificare perdite. Questo metodo fornisce un&#39;alternativa a basso costo commerciale diunità disponibili.

Sottoponendo C. elegans a 20 ore di AS a 26 ° C in un laboratorio-made camera di incubazione personalizzato come descritto (punto 3.6.2) ha comportato una significativa mortalità (Figura 1A) 5. L&#39;imaging fluorescente successiva di punctum e le interruzioni nei GFP etichettati processi neuronali di sopravvissuti ha confermato la presenza di anomalie morfologiche (Figura 2). I sopravvissuti anche risposto male alla luce della parete di tocco del corpo (Figura 1B). Questo modello è stato utilizzato da più gruppi per studiare come la predisposizione genetica, intervento farmaceutico, e la plasticità metabolica colpisce esiti AS dipendenti 4-6,8,9,12,13. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1.jpg" /> Figura 1. C. elegans sopravvivenza e la risposta al tocco dopoAS. A) Percentuale di vermi che esporre 24 ore post-AS sopravvivenza. Il ceppo N2 è il background genetico wild type, e KWN85 contiene un transgene integrato che etichette neuroni MEC con GFP. B) Risposta a toccare stimoli di vivere C. elegans (N2 Strain) dopo AS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2.jpg" /> Figura 2. Toccare modifiche neurone dopo AS. Neurone touch (PLML e PLMR) anomalie come i processi tortuosi e pause (A) o l&#39;accumulo di aggregati GFP nei processi (B) sono stati monitorati in sopravvivenza anestetizzata C. elegant<html> ans dopo AS. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3.jpg" /> Figura 3. Scelta ciglio. Un ritiro ciglio assemblato. Nel riquadro, un particolare del ciglio incollato al legno stuzzicadenti. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4.jpg" /> Figura 4. Lab-made camera ipossica all&#39;interno del bagno d&#39;acqua. Un contenitore chiuso pronto per iniziare l&#39;esperimento. Le frecce indicano l&#39;entrata e l&#39;uscita del gas ed il peso della bottiglia usata per evitare che flottante. 231fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Dettagli del lato interno ed esterno del coperchio del contenitore. A) lato esterno del coperchio del contenitore, indicando il tubo e il suo connettore attaccato al foro precedentemente realizzato. B) lato esterno del coperchio del contenitore, indicando il connettore del tubo attaccato al foro precedentemente realizzato.

Un protocollo è descritto che utilizza anossia / fame in C. elegans per modellare ischemia / riperfusione. Risultati funzionali comprendono un aumento della mortalità, anomalie visibili in processi neuronali GFP-etichettata, e le risposte deteriorate comportamentali che richiedono la funzione neuronale.

Un modello di anossia-fame per ischemia / riperfusione in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

L'obiettivo generale di questa procedura è riprodurre l'ischemia e la ri-perfusione in *C. elegans*. Questo viene ottenuto spostando *C. elegans* in un microtubo e lavando via i batteri. Il secondo passaggio consiste nel creare un ambiente anossico.Utilizzando una camera ipossica realizzata in laboratorio, gli animali sono sottoposti ad anossia per 20 ore e successivamente posti in condizioni aerobiche dopo 24 ore. L'ultimo passaggio consiste nel valutare gli animali morti e nel valutare la risposta al tocco. Le modifiche neuronali vengono inoltre osservate mediante microscopia a fluorescenza.Alla fine, la privazione di ossigeno e di nutrimento in *C. elegans* viene utilizzata per ricreare le stesse condizioni osservate nell'ischemia, una lesione nei superioreucarioti, impiegando un modello genetico più semplice e flessibile. I vantaggi principali di queste tecniche rispetto ai metodi tradizionali di induzione dell'ischemia in cellule isolate o cuori isolati sono che *C. elegans* è un modello genetico estremamente potente ed è anche un organismo trasparente. Questo consente di utilizzare diverse tecniche e fluidi. In aggiunta, viene mostrato come, invece di utilizzare una costosa camera ipossica o camera ambientale, si possa costruire in laboratorio una camera ipossica ed ambientale il cui costo è di pochi dollari.Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questa materia deve essere consapevole di alcuni punti chiave, come ad esempio svuotare accuratamente i buffer, prestare molta attenzione al punteggio dei vermi e mantenere costanti la temperatura e la quantità di ossigeno utilizzate. Tutti questi fattori possono influenzare l'esito dell'esperimento. Per preparare una camera ipossica personalizzata, è possibile adattare un contenitore ermetico sigillabile dello stile Tupperware a camera anossica. Si consiglia di scegliere il contenitore più piccolo possibile, poiché un contenitore ridotto genera un ambiente ipossico più rapidamente ed è più facile da collocare nel bagnomaria.Praticare due fori nel coperchio di dimensioni tali da ospitare un connettore in plastica o metallo che si adatti al tubo, fissandolo saldamente con una colla che può essere applicata sotto l'acqua e che indurisce dopo l'essiccazione, evitando così movimenti del connettore e riducendo la possibilità di perdite. In alternativa, è possibile utilizzare una guarnizione in neoprene per aiutare a sigillare il connettore al contenitore. Posizionare il contenitore nel bagno termico in modo che sia completamente immerso.Immergere il contenitore. Utilizzare un peso per bottiglia o un peso da immersione. Uno dei raccordi del tubo verrà utilizzato per introdurre una miscela gassosa, mentre l'altro tubo fungerà da valvola di sfiato della pressione.Pertanto, deve essere lasciato sotto l'acqua in modo che il contenitore sia isolato dall'ambiente esterno. Per iniziare la coltivazione di C. elegans secondo il protocollo descritto nel testo, preparare il tampone M9 ed eliminare l'ossigeno mediante equilibratura con azoto per 30 minuti prima dell'esperimento, mantenendo il tutto circondato da ghiaccio. Praticare un piccolo foro nel coperchio delle provette microcentrifuga da 1,5 mL, nelle quali verranno collocate le worm durante l'anedossia e la privazione di nutrienti.Il foro permette lo scambio gassoso senza dover tenere il coperchio aperto, il che potrebbe portare a un'eccessiva evaporazione del mezzo. Aggiungere un millilitro di tampone M9 ossigenato a temperatura ambiente in ciascuna piastra da 35 millimetri contenente vermi adulti giovani. Fare attenzione a non rimuovere i batteri dalla piastra.Dopo circa un minuto, i vermi dovrebbero nuotare nell'M nine. Successivamente, ricoprire la punta di una pipetta da un millilitro con albumina sierica bovina o BSA, aspirando ed espellendo una soluzione sterile di BSA al 1%. Inclinare con attenzione la piastra contenente i vermi nel tampone M nine e rimuovere l'M nine dallo stesso punto in cui era stato aggiunto.Quindi posizionare la sospensione nei tubi da microcentrifuga preparati. Lasciare riposare i campioni sul ghiaccio finché i vermi non saranno scesi sul fondo dei tubi. Rimuovere la massima quantità possibile di M nine senza disturbare i vermi nel tubo.Quindi aggiungere un millilitro di M nove priva di ossigeno e fredda, e posizionare il tubo sul ghiaccio fino a quando i vermi non si saranno depositati sul fondo. Ripetere nuovamente questo passaggio di lavaggio per tre volte; nell'ultimo lavaggio, rimuovere l'M nove fino a quando ne rimangono circa 100 microlitri nel tubo.Successivamente, posizionare i tubi con i vermi nel tampone M nove deossigenato nella camera e sigillare la camera utilizzando il coperchio con un flusso costante di azoto pari a 100 millilitri al minuto. Collocare il contenitore all'interno di un bagno termico a 26 gradi Celsius. Assicurarsi che il tubo di uscita sia completamente immerso in acqua in modo che non entri aria e che non vi siano perdite nel sistema.Procedere con l'incubazione dei vermi a 26 gradi Celsius per 20 ore; al termine dell'incubazione, pipettare *Caenorhabditis elegans* con una punta rivestita di BSA su una piastra di terreno di crescita per nematodi da 35 millimetri. Incubare le piastre a 20 gradi Celsius per 24 ore. Trascorso questo tempo, i vermi saranno pronti per essere valutati.Utilizzando un'asticella di platino, toccare leggermente la parte superiore della testa del verme vivo. Se i vermi non rispondono, segnarli come morti. A volte un verme potrebbe non muoversi all'indietro, ma potrebbe mostrare un lieve movimento laterale della testa; anche se tecnicamente non morto, è quasi certo che questo verme morirà entro poche ore e pertanto va considerato morto.Ripetere questo passaggio da 10 a 15 volte per ogni verme, con intervalli di dieci secondi. Esaminare almeno 10 vermi per ogni gruppo per ottenere dati accurati per visualizzare la privazione post-anossica e le modifiche neuronali. Utilizzare un ceppo che esprima la proteina fluorescente verde o GFP nei neuroni meccanocettivi responsivi al tocco.Posizionare una goccia di soluzione di ARO al 2% su un vetrino posto tra altri due vetrini che presentano un singolo pezzo di nastro adesivo sulla faccia inferiore. Posizionare un ultimo vetrino perpendicolarmente al primo, sopra la soluzione di ARO al 2%, e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. Si dovrebbe formare un cuscinetto dello spessore del nastro adesivo.Quindi rimuovere il vetrino superiore e aggiungere 10 microlitri di M nine contenenti lo 0,1% di tetra aole, che immobilizzerà i vermi. Trasferire circa 10 vermi vivi sul vetrino al 2%aro e posizionare un coprioggetto sopra di essi. Visualizzare la GFP utilizzando un microscopio a fluorescenza con un obiettivo da 100x e l'illuminazione appropriata.I neuroni danneggiati mostreranno un modello a collana di perle della membrana citosolica nei prolungamenti, costituito da multiple puntiformi e/o anomalie in cui i prolungamenti appaiono interrotti. Contare le puntiformi e le anomalie in entrambi i neuroni per ciascun verme, utilizzando complessivamente almeno 10 vermi. Sottoporre *Caenorhabditis elegans* a 20 ore di anossia e digiuno a 26 gradi Celsius in una camera d'incubazione appositamente costruita in laboratorio ha determinato una significativa mortalità.I sopravvissuti hanno anche risposto in modo scarso al tocco leggero della parete corporea. Successivi esami di imaging fluorescente di punti e interruzioni nei processi neuronali etichettati con GFP nei sopravvissuti hanno confermato la presenza di anomalie morfologiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre l'ischemia.Un'osservazione in laboratorio ha evidenziato camere ipossiche e inoltre si dovrebbe essere in grado di misurare la morte e anche le modificazioni neurologiche in Seattle elegance. Questo modello è stato utilizzato da diversi gruppi per studiare come l'ione naturale derivante da molteplici interventi e il metabolismo possano influenzare la sopravvivenza e la morte in condizioni ipossiche.

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