Name: Transient espressione genica in tabacco con allAssemblea Gibson e Gene Gun (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T18:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Scopri l'espressione genica transitoria nel tabacco con l'Assembla Gibson e il gene gun. Questo metodo consente di studiare l'espressione in cloroplasti e perossisomi senza enzimi di restrizione.

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Gli autori desiderano ringraziare Jen Sheen del Massachusetts General Hospital per la generosa donazione di piantine di Nicotiana benthamiana. Jen Bush ci ha aiutato molto nella consulenza in coltivazione di piante e la creazione di una zona di camera di crescita. Tom Ferrante dell&#39;Istituto Wyss offerto aiuto cruciale con microscopia confocale. Gli autori desiderano soprattutto ringraziare Don Ingber del Children Hospital di Boston e l&#39;Istituto Wyss per la generosa donazione di una pistola Gene e relative forniture. Il finanziamento per questo progetto è stato fornito attraverso un accordo di cooperazione con il Dipartimento dell&#39;Energia Advanced Research Projects Agency (ARPA-E Award # DE-000079) per la PAS, JCW, e MdM, e attraverso Chimerion Biotechnology, Inc. per MJV.

1. Progettazione di sequenze alternativa-splicing per multipla Organelle Targeting <ol><li> Determinare i siti per l&#39;espressione finale di proteine. Per questo lavoro, l&#39;interesse è in mira la cloroplasti, perossisomi, e citosol. </li><li> Utilizzare la letteratura per identificare proteine ​​e DNA sequenze note di indirizzare le proteine ​​per organelli di interesse. In questo caso un cloroplasto di targeting sequenza di Arabidopsis thaliana L-isoaspartate metiltransferasi 6,15, e un perossisomi mira sequenza di Arabidopsis thaliana transthyretin come S-allantoina sintasi 16,17 sono stati determinati. </li><li> Identificare un regime-splicing alternativo che dovrebbe indirizzare le proteine ​​di interesse per gli organelli corretti. Per questo lavoro, splice siti come osservato in un sistema di Arabidopsis naturale 6. La sequenza di mRNA è stata ridisegnata lasciando i siti di splicing naturali, ma le sequenze sono stati collocati codifica peroxis-cloroplasto oome-targeting tag all&#39;interno introni alternativamente-splicing (Figura 1). </li></ol> 2. Assemblea Gibson di parti di DNA Vedi anche figura 2. Il metodo di assemblaggio Gibson dipende dall&#39;azione di numerosi enzimi in un mix pre-made a 1) parzialmente digerire le estremità del DNA a doppio filamento di rendere filamenti singoli e 2) ricottura paia di basi gratuiti della vicina pezzi di DNA. Questo permette la clonazione di frammenti di DNA senza le limitazioni dei siti di restrizione. <ol><li> Scegliere un ordine per gli elementi del costrutto di DNA plasmidico. Come esempio TriTag-1 ha elementi di: a) un vettore plasmidico (pori, contenente un costrutto GFP noto a lavorare in piante, un marcatore di resistenza alla kanamicina, e origini di replicazione di E. coli e Agrobacterium tumefaciens host), b) una sequenza promotore, (P ENTCUP2, mostrato come costitutivo in piante), C) un cloroplasto rivolti sequenza (CTS), c) una sequenza di targeting perossisomi (PTS), e d) una serie di siti di splicing come descritto in precedenza 6. </li><li> Progettare la base-per-base costrutto con il software di progettazione in silico. Scimmia è un pacchetto freeware open source utile per questo lavoro. Nota: TriTag-1, ha l&#39;ordine: plasmide vettore, promoter, ATG, sito di splice donatore, cloroplasti sequenza bersaglio, sito donatore di splicing, luogo neutro, accettore sito di splice, perossisomi sequenza bersaglio, accettore sito di splice, GFP contenute nel vettore plasmidico . <ol><li> Progettare il silico costrutto di DNA in modo tale che vi sia una sovrapposizione di 50 bp tra ogni pezzo al momento dell&#39;ordine primer per PCR. È possibile utilizzare la sovrapposizione 50 bp come primer: 25 bp ciascuna direzione. <ol><li> Essere sicuri di tenere traccia della provenienza di ciascuno dei pezzi di sequenza. E &#39;come: un plasmide di essere coltivate e miniprepped; una sequenza lineare che può essere utilizzato come modello PCR; o una sequenza che dovrà esseresintetizzato in commercio? Diverse aziende offrono servizi di sintesi del DNA a basso costo per frammenti &lt;500 bp. In questo caso, il TriTag sé è 437 bp quindi era vantaggioso per ordinare commercialmente. </li><li> I migliori risultati arriveranno se tutti i frammenti siano PCR-amplificati e purificati dalla loro DNA template. Il marcatore di resistenza è un buon posto per dividere questo grande DNA in due modelli più piccoli che sono più facilmente PCR-amplificato. </li><li> Di restrizione restrizione enzima DpnI taglia il DNA metilato. Se il modello di PCR era una miniprep da E. coli, trattamento DpnI rimuoverà il contaminante DNA stampo. </li></ol></li></ol></li><li> Purificare tutte le sequenze di DNA separatamente ed eluire in acqua, TE o tampone EB. <ol><li> parte PORE vettore 1, ~ 3000 bp (frecce verdi). PCR amplificato e DpnI trattata. </li><li> PORE vettore parte 2, ~ 3000 bp (frecce nere). PCR amplificato e DpnI trattata. </li><li> TriTag inserto, 437 bp (frecce blu). Ordinato in commercio. Resuspend in DDH 2 O. </li><li> P ENTCUP promotore, ~ 750 bp (frecce arancioni). PCR-amplificato e DpnI trattata. </li></ol></li><li> Misurare le concentrazioni di ciascuno dei pezzi di DNA. Obiettivo per 150 ng / ml dei pezzi di vettore. </li><li> Prelevare un &#39;aliquota del mix di montaggio Gibson fuori dal freezer e scongelare sul ghiaccio. Questa è disponibile in commercio, ma anche di semplice realizzazione in laboratorio 12-14. <ol><li> Ci sono due passi per questa ricetta: a 5x master mix viscoso e 15 reazione dimensioni aliquote di 1.33x microlitri. Il master mix 5x contiene: 3 ml di 1 M Tris-HCl pH 7.5, 300 ml 1 M MgCl 2, 600 microlitri 10 mM di ciascun dNTP, 300 ml 1 M DTT, 1,5 g di PEG-8000, 20 mg di NAD, e DDH 2 O a 6 ml. Preparare 320 microlitri aliquote (18) e congelare tutti tranne uno a -20 ° C. La soluzione sarà molto viscoso. Etichettare questi &quot;tampone isoterma 5X&quot; </li><li> Per quello rimanente (320 ml), aggiungere 1,2 microlitri T5 Exonuclease, 20 microlitri Phusion Alto-Fidelity DNA polimerasi, 160 microlitri Taq DNA Ligase e 700 ml DDH 2 O. Preparare 15 aliquote microlitri (~ 80) sul ghiaccio in provette per PCR e conservare a -20 ° C. </li></ol></li><li> Determinare il volume di quantità equimolari di ciascuno dei frammenti. Ci sono alcuni calcolatori online, tra cui Gibthon.org. Ci dovrebbe essere un totale di 5 ml di tutti i pezzi di DNA. Aggiungerli al 15 microlitri Gibson mix aliquota. Se questo richiede volumi troppo piccolo per pipetta, diluire i frammenti di DNA e / o utilizzare più di una aliquota. <ol><li> Non dimenticate di preparare un controllo del DNA vettore da solo (ad esempio, la parte di DNA che contiene il marcatore di resistenza agli antibiotici) e portare a volume con acqua. </li></ol></li><li> Incubare le provette in un termociclatore a 50-55 ° C per 30-60 minuti. Sostituire su ghiaccio e trasformare in E. coli attraverso le cellule chimicamente competenti shock termico. Non utilizzare cellule elettrocompetenti. La concentrazione di sale e la concentrazione di DNA relativamente bassapuò causare le cellule a arco. <ol><li> Applicare tutte le 20 microlitri di una preparazione commerciale di 200 microlitri di calcio cloruro competente E. coli. Incubare 30 min in ghiaccio e shock termico 60 sec a 42 ° C </li><li> Ritorno al ghiaccio 2 min, applicare 750 microlitri SOC o terreno LB e recuperare agitazione in una provetta 30 minuti a 37 ° C. Piatto il composto e diluizioni adeguate LB + Kan (o altro antibiotico appropriato). Questo può tradursi in background maggiore (e un numero maggiore di eventi di ricombinazione non-target) rispetto ai tradizionali clonazione a base di legatura, ma vale la pena di schermo di circa 10 colonie. </li></ol></li><li> Conferma clone tramite sequenza e memorizzare una aliquota a -80 ° C </li></ol> 3. Biolistic trasfezione di tabacco con il Gene Gun Questa è una tecnica che si instaura in JoVE 18,19. Passaggi chiave e le differenze sono descritte di seguito. <ol><li> Crescere 50-100 ml E. coli o 200 ml Agrobacterium. Maxi-prep cultura. Una concentrazione di circa 1.500 ng / ml è necessaria per continuare. </li><li> Preparare gene proiettili di pistola come descritto in precedenza. Caricarli nella Gene Gun. </li><li> Per la trasfezione di Nicotiana benthamiana tabacco foglia tessuto epidermico, scegliere un grande foglia vicino alla base di un impianto di 3 mesi. Tagliare con cautela e metterlo lato inferiore su tovaglioli di carta bagnati in un piatto di 15 centimetri Petri. </li><li> Impostare la pressione Lui per il Gene Gun a 200-250 psi. </li><li> Orientare con attenzione la pistola genica tra nervature sul lato inferiore di una foglia, circa 3-5 cm sopra di esso. Rilasciare la sicurezza e fornire le particelle all&#39;anta. Ogni proiettile può essere utilizzato per due volte nella stessa posizione sulla foglia. Se esplode foglia, scartano e avviare una nuova foglia-c&#39;è qualche variazione in foglia tenacità a causa di condizioni di crescita, come l&#39;età, l&#39;umidità, ecc Per una foglia di 12 cm, si aspettano per adattarsi circa 6 colpi. </li><li> Conservare la foglia, coperto con la parte superiore di unCapsula di Petri per 2-3 giorni in condizioni di scarsa luminosità in panchina. </li><li> Esaminare la foglia in un microscopio dissezione dotato di fluorescenza UV, e la ricerca di singole cellule che esprimono GFP. Sezionare 5-10 mm sezioni di foglia. </li><li> Immergere la foglia in un vetrino da microscopio ben profondità sotto ~ 200 microlitri 0,1% Triton X-100. Il detersivo aiuta a prevenire la formazione di bolle d&#39;aria sulla superficie, e la profonda microscopio ben vetrino consente una grande area di esposizione del tessuto. </li></ol> 4. Microscopia confocale di Tissue trasfezionati Queste istruzioni variano per ogni strumento, quindi è essenziale per ottenere adeguatamente formati. <ol><li> Per gli esperimenti di rivelazione di fluorescenza, impostare il laser di eccitazione a 489 nm, e impostare i rivelatori fotomoltiplicatori a 500-569 nm per GFP fluorescenza e 630-700 nm per la clorofilla auto-fluorescenza. Celle di immagine utilizzando un obiettivo 40x immersione in acqua. </li></ol>

<ol><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trait+stacking+in+transgenic+crops%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22GM+crops%22%5BJournal%5D)">Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities.</a> GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).</li>
<li>Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+plant+splicing+code%3A+experimental+and+computational+approaches+for+predicting+alternative+splicing+and+splicing+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).</li>
<li>Hickey, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene+regulation+in+plants+by+alternative+splicing+of+a+suicide+exon%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).</li>
<li>Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+in+plants+-+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing in plants - coming of age.</a> Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).</li>
<li>Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+alternative+pre-messenger+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.</a> Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).</li>
<li>Dinkins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+transcriptional+initiation+sites+and+alternative+5%27-+and+3%27-splice+site+selection+of+the+first+intron+deploys+Arabidopsis+protein+isoaspartyl+methyltransferase2+variants+to+different+subcellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%3A+for+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).</li>
<li>Kebeish, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplastic+photorespiratory+bypass+increases+photosynthesis+and+biomass+production+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).</li>
<li>Maier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Introduction+of+a+Glycolate+Oxidative+Cycle+into+A.+thaliana+Chloroplasts+Leads+to+Growth+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+the+isoprenoid+pathway+in+tobacco+by+expressing+the+cytoplasmic+mevalonate+pathway+in+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts.</a> Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).</li>
<li>Sapir-Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+localization+of+Arabidopsis+isopentenyl+diphosphate+isomerases+suggests+that+part+of+the+plant+isoprenoid+mevalonic+acid+pathway+is+compartmentalized+to+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).</li>
<li>Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+heterologous+protein+to+multiple+plant+organelles+via+rationally+designed+5%27+mRNA+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags.</a> Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Lowenson, J. D., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+D-aspartyl+residues+in+polypeptides+by+the+erythrocyte+L-isoaspartyl%2FD-aspartyl+protein+methyltransferase.+Implications+for+the+repair+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).</li>
<li>Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+a+camel+through+the+eye+of+a+needle%3A+the+import+of+folded+proteins+by+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell+%2F+under+the+auspices+of+the+European+Cell+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).</li>
<li>Reumann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Arabidopsis+leaf+peroxisomes+reveals+novel+targeting+peptides%2C+metabolic+pathways%2C+and+defense+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms.</a> The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Hollender, C. A., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+Fluorescence+Complementation+%28BiFC%29+Assay+for+Protein-Protein+Interaction+in+Onion+Cells+Using+the+Helios+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene.</a> (40), (2010).</li>
<li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo studio, strategie semplici sono descritti per la localizzazione di una singola proteina transgenica a più compartimenti cellulari nelle piante. L&#39;obiettivo era di progettare costrutto che esprimesse un singolo gene in più di un organello in Nicotiana benthamiana. Le strategie includono progettazione razionale di base di GFP-costrutti di DNA, il montaggio Gibson, la consegna dei plasmidi a celle foglia con il Gene Gun, e l&#39;osservazione dei risultati con microscopia confocale. <p class="jove...

Questo lavoro è un progetto di ingegneria / biologia sintetica metabolica in cui le cellule vegetali sono progettati per esprimere una proteina reporter in diversi organelli ma solo con un singolo costrutto di DNA. Un approccio per proteine ​​bersaglio a più di una posizione comporta clonazione più copie genetiche, ciascuna contenente un diverso peptide localizzazione. Ogni copia deve essere introdotto da successive ritrasformazione, o, in alternativa, da backcrossing singole trasformazioni 1. Ciò comporta la clonazione supplementare, ed è limitata da un tag di localizzazione per ogni terminale. Un altro modo per localizzare una proteina a più riprese è attraverso splicing alternativo 2-5. RNA è trascritto da un singolo gene, ma diverse copie della trascrizione sono trattati in modo diverso, spesso in più di un modo per cella. Ciò può comportare più di un RNA messaggero nella cella trascritto da un singolo gene. Questi diversi messengeRNA R possono codificare per diverse isoforme della stessa proteina, o nel caso di un frameshift, una proteina diversa. Sebbene splicing alternativo è stato descritto in letteratura per molti anni, i meccanismi di azione e donatore conservati e splice siti recettoriali sono solo stati chiariti più recente 6. Poiché questi siti vengono meglio descritti, si aprono opportunità per l&#39;ingegneria. Gli ingegneri metaboliche delle piante si trovano ad affrontare una sfida quando esprime una proteina in più organelli. Per una proteina che è da localizzare a più organello, il tecnico deve clonare il gene stesso più volte, ciascuno con una sequenza segnale separato dirigendolo al organello di interesse. Per un singolo gene in tre organelli, questo è semplicemente tre geni. Ma per una via metabolica sei gene, questo si espande a 18 geni, un notevole sforzo di clonazione. La combinazione di più sequenze di localizzazione in un unico segno gene alternativa-impiombatoriduce ificantly questo sforzo. Ad esempio, re-engineering fotorespirazione 7,8 e sintesi isoprenoide 9,10 coinvolge sia i cloroplasti e perossisomi. Nel nostro caso abbiamo approfittato dei siti di splicing come osservato in un sistema di Arabidopsis thaliana naturale descritto in precedenza 6. Abbiamo razionalmente riprogettato la sequenza di mRNA di lasciare i siti di splicing naturali solo, ma messo sequenze che codificano tag-perossisomi rivolti-cloroplasto o all&#39;interno introni alternativamente-splicing (Figura 1). La proteina espressa può o non può avere un tag, a seconda che il pre-mRNA che codifica è stato escisso come un introne (Figure 1g e 1h). Per ulteriori informazioni sulla progettazione dei costrutti presentati in questo lavoro, vedere l&#39;articolo compagna 11. Perché questo è ancora uno sforzo significativo clonazione, il montaggio Gibson, un nuovo metodo di clonazione costrutti di DNA, è used in costruzione. Il metodo Gibson può essere utilizzato per qualsiasi sequenza, indipendentemente siti di restrizione (Figura 2) 12-14. Il mix specifico di enzimi permette un solo passaggio, assemblaggio isotermica. In questo metodo, più parti a doppio filamento lineare di DNA sono progettati in modo tale che essi hanno sequenze sovrapposte di ~ 50 bp. L&#39;assemblaggio miscela enzimatica Gibson digerisce parzialmente le parti di DNA lineari, esponendo singoli filamenti di sequenze omologhe. Questi parziali sequenze a singolo filamento sono ri-ricotti nella miscela di reazione, con un conseguente rapido, one-step, sequenza-indipendente, reazione subcloning privo di legatura. Questo lavoro descrive 1) progettazione razionale costrutti splicing alternativo per l&#39;espressione di cloroplasti delle piante, perossisomi, e citosol, 2) la loro clonazione utilizzando il nuovo metodo privo di legatura di riunione Gibson, 3) la loro consegna nelle cellule delle foglie di tabacco con Gene Gun, e 4) I risultati mostrano il targeting organelli, come osservato con GFPe microscopia confocale.

<table><tbody><tr><td>Primer per oligonucleotidi</td><td>IDT</td> <td>(personalizzato)</td> <td>Design specifico per il costrutto</td></tr><tr><td>GeneBlocks</td><td>IDT</td> <td>(personalizzato)</td> <td>500 bp oligonucleotidi</td></tr><tr><td>ApE software</td><td>U Utah</td> <td>(download)</td> <td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td></tr> <tr><td>MinElute kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Utilizzato per purificare i prodotti PCR</td></tr><tr><td>Kit QIAprep spin miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Utilizzato per preparare quantità adeguate al clonaggio di plasmidi</td></tr><tr><td>Phusion Master Mix con tampone GC NEB</td><td></td><td>M0532S</td><td>Utilizzato per amplificare con PCR il gene di interesse Miscela di</td></tr><tr><td>reazione di assemblaggio Gibson</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Master mix dei seguenti 9 ingredienti</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH7.5</td><td>Teknova</td><td>T1075</td><td>Miscela di assemblaggio Gibson</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>G Biosiences</td><td>82023-086</td><td>Miscela di montaggio Gibson</td></tr><tr><td>Miscela dNTP</td><td>Fermentas</td><td>R0192</td><td>Miscela di assemblaggio Gibson</td></tr><tr><td>1 M DTT</td><td>Fermentas</td><td>R0861</td><td>Miscela di assemblaggio Gibson</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Affymetrix</td><td>19966</td><td>Miscela di assemblaggio Gibson</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Applichem</td><td>A1124,0005</td><td>Miscela di assemblaggio Gibson</td></tr><tr><td>Esonucleasi T5</td><td>Epicentro</td><td>T5E4111K</td><td>Miscela di assemblaggio Gibson</td></tr><tr><td>Phusion polimerasi</td><td>NEB</td><td>F530S</td><td>Miscela di assemblaggio Gibson</td></tr><tr><td>Taq DNA ligasi</td><td>NEB</td><td>M0208L</td><td>Miscela di assemblaggio Gibson</td></tr><tr><td>Gibthon.org</td><td></td><td></td><td>Sito web per semplificare i calcoli</td></tr><tr><td>Plasmide PLUS Maxi kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td>Utilizzato per preparare il DNA per i proiettili della pistola genetica Sistema</td></tr> di <tr><td>pistola genetica</td><td>BioRad</td><td>165-2451</td><td>Include tutte le parti necessarie</td></tr><tr><td>Nicotania benthamiana</td><td>(n/a)</td><td>(n/a)</td><td>Dono di Jen Sheen, MGH</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Leica</td><td>SP5 X MP</td><td>Imaging delle cellule risultanti</td></tr><tr><td>Vetrini a pozzetti profondi Microscopia</td><td>elettronica</td><td>Scienze 71561-01</td><td>Utilizzato per l'imaging confocale</td></tr><tr><td>Un editor di plasmidi (ApE) </td><td>Università dello Utah </td><td></td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td></tr><tr><td>Gibthon:Calcolatore</td><td></td><td></td> di legatura <td>http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</td></tr></tbody></table>

transient espressione genica in tabacco con all&#39;assemblea gibson e gene gun

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Al fine di indirizzare una singola proteina a più organelli subcellulari, piante tipicamente duplicare i geni rilevanti, ed esprimono ogni gene separatamente utilizzando complesse strategie di regolamentazione, tra cui promotori differenziali e / o sequenze di segnali. Ingegneri metaboliche e biologi sintetici interessato a colpire enzimi per un particolare organello trovano ad affrontare una sfida: per una proteina che è da localizzare a più di un organello, il tecnico deve clonare il gene stesso più volte. Si presenta una soluzione a questa strategia: sfruttando splicing alternativo dell&#39;mRNA. Questa tecnologia sfrutta cloroplasto stabilito e dei perossisomi mira sequenze e li combina in un unico mRNA che viene alternativamente impiombata. Alcune varianti di splicing vengono inviati al cloroplasto, alcuni al perossisoma, e alcuni al citosol. Qui il sistema è progettato per multipli organello targeting con splicing alternativo. In questo lavoro, GFP si aspettava di essere espressed nei cloroplasti, citosol, e perossisomi da una serie di razionalmente progettati 5 &#39;tag mRNA. Questi tag hanno il potenziale per ridurre la quantità di clonazione necessaria quando i geni eterologhi devono essere espressi in più organelli subcellulari. I costrutti sono stati progettati in opera precedente 11, e sono stati clonati usando Gibson assembly, un metodo di clonazione indipendente legatura che non richiede enzimi di restrizione. I plasmidi risultanti sono stati introdotti in Nicotiana benthamiana celle foglia epidermica con un protocollo Gene Gun modificato. Infine, foglie trasformate sono state osservate con microscopia confocale.

Lo sforzo progettuale è stato il risultato di una pianificazione significativa. Novel di questo progetto è l&#39;uso di splicing alternativo per creare un pre-mRNA che viene tradotto in proteine ​​differenzialmente espressi. Queste proteine ​​sono espresse in diversi organelli, in questo caso il cloroplasti, perossisomi e / o citosol. Abbiamo adattato gene Arabidopsis naturale che viene alternativamente impiombato 6, e collocato conosciuti cloroplasto 6 e perossisomi 17 mira seq...

Questo lavoro descrive un nuovo metodo per selettivamente organelli subcellulari nelle piante, saggiata usando l&#39;BioRad Gene Gun.

Transient espressione genica in tabacco con all&#39;Assemblea Gibson e Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare l'espressione genica transitoria di un reporter marcato con GFP in cellule epidermiche di foglia di tabacco. Questo risultato si ottiene innanzitutto progettando un costrutto di DNA che verrà espresso nei cloroplasti e nelle perossisomi. Il costrutto viene quindi assemblato mediante amplificazione PCR e assemblaggio Gibson.Successivamente, un gene gun viene utilizzato per trasferire il costrutto nelle cellule epidermiche della foglia di tabacco. Infine, l'analisi della foglia di tabacco mediante microscopia confocale rivela l'espressione di GFP nel cloroplasto e nei perossisomi. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il clonaggio classico, è che non richiede enzimi di restrizione e, pertanto, qualsiasi sequenza amplificabile mediante PCR può essere clonata.A causa della flessibilità del disegno genetico, le applicazioni di queste tecniche si estendono a una scala più ampia. L'ingegneria genetica delle piante agricole inizia questo protocollo determinando i siti all'interno della cellula vegetale per l'espressione finale della proteina. Per questo lavoro, l'obiettivo è indirizzare l'espre

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Descrizione di un virus-indotto silenziamento genico (VIGS) metodo per knock-down di espressione genica...

Virale silenziamento genico (VIGS) in Nicotiana benthamiana E Pomodoro

Vi presentiamo il protocollo dettagliato per Agrobacterium mediata indotta da virus silenziamento genico (VIGS), saggio in cotone. Il virus crepitio del tabacco (TRV)-vettori derivati ​​VIGS sono stati schierati per indurre il silenziamento dell'RNA di cotone GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. Il fenotipo albino causati da tacere GrCLA1 ​​è stata osservata nella fase piantina entro 2 settimane dopo l'inoculazione.

Mediata da Agrobacterium Virus-Induced tacere Assay Gene In Cotone

Piante offrono un sistema innovativo per la produzione di proteine ​​farmaceutiche su scala commerciale che è più scalabile, economica e sicura rispetto paradigmi attuale espressione. In questo studio, riportiamo un approccio semplice e conveniente, ma scalabile per introdurre target-gene...

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Indotta da virus silenziamento genico è uno strumento utile per identificare geni coinvolti nella resistenza nonhost delle piante. Dimostriamo l'uso di agenti patogeni batterici che esprimono GFPuv nell'identificazione di geni silenziati piante suscettibili ai patogeni nonhost. Questo approccio è semplice, veloce e facilita lo screening su larga scala e di protocollo simili possono essere applicati a studiare varie altre interazioni pianta-microbo.

VIGS-Mediated Forward Genetica screening per la identificazione di geni coinvolti nella resistenza Nonhost

Produzione di proteine ​​transitoria nelle piante di Nicotiana sulla base di infiltrazione sottovuoto con Agrobacteria trasportando i vettori di lancio (Tobacco Mosaic Virus-based) è un approccio rapido ed economico per la produzione di antigeni e proteine ​​terapeutiche. Abbiamo semplificato la procedura e migliorato l'accumulo di destinazione ottimizzando le condizioni di coltivazione batteri, selezionando specie ospite e co-introduzione di silenziamento dell'RNA soppressori.

Ottimizzazione e utilizzo di<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediata transitoria produzione di proteine ​​in<em&gt; Nicotiana</em

Descriviamo un disegno di esperimenti approccio che può essere utilizzato per determinare e modellare l'influenza del transgene elementi regolatori, parametri di crescita e sviluppo delle piante, e condizioni di incubazione sulla espressione transiente di anticorpi monoclonali e proteine ​​reporter nelle piante.

Caratterizzazione dei sistemi complessi Utilizzando il Design of Experiments Approccio: Transient Protein Expression in tabacco come un caso di studio

Piante di tabacco sono stati usati per produrre una cellulasi fungine, TrCel5A, tramite un sistema di espressione transiente. L'espressione potrebbe essere monitorato utilizzando una proteina di fusione fluorescente, e l'attività della proteina è stata caratterizzata post-espressione.

Espressione ricombinante Cellulase Cel5A da<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In piante di tabacco

La sintesi di plasmidi personalizzati richiede lavoro e tempo. Questo protocollo descrive l'uso della clonazione dell'assemblaggio Gibson per ridurre il lavoro e la durata della procedura di clonazione del DNA personalizzata. Il protocollo descritto produce anche costrutti proteici marcati affidabili per l'espressione nei mammiferi a un costo simile al tradizionale clonaggio del DNA taglia e incolla.

Generazione di plasmidi vettori che esprimono proteine ​​FLAG-tagged Ai sensi del regolamento di Human Factor-allungamento 1α Promotore Uso Gibson Assembly

In questo studio è stata confrontata l'espressione di una proteina ricombinante umana bersaglio in diverse piattaforme di produzione. Ci siamo concentrati sulle colture tradizionali basate su fermentatori e sugli impianti, descrivendo il set-up di ciascun sistema ed evidenziando, sulla base dei risultati riportati, i limiti e i vantaggi intrinseci per ogni piattaforma.

Un&#39;analisi comparativa di espressione della proteina ricombinante in diversi biofabbriche: batteri, cellule di insetto e impianti

A livello subcellulare, gli eventi di segnalazione sono modulati dinamicamente da segnali di sviluppo e ambientali. Qui descriviamo un protocollo che impiega il sistema di espressione transitoria del tabacco per monitorare l'interazione dinamica proteina-proteina e per rivelare l'organizzazione spaziale della trasduzione del segnale nelle cellule vegetali.

Imaging Riorganizzazione spaziale di una via di segnalazione MAPK Utilizzando il sistema transitorio Expression Tabacco

L'espressione eterologa transitoria degli enzimi biosintetici in foglie di Nicotiana benthamiana può deviare endogene forniture di 2,3-oxidosqualene verso la produzione di nuovi prodotti ad alto valore triterpenici. Qui è descritto un protocollo dettagliato per produzione preparativo-scala rapidamente (5 giorni) di triterpeni e analoghi utilizzando questa potente piattaforma di origine vegetale.

Espressione transiente in Nicotiana Benthamiana lascia per produzione del Triterpene su scala preparativa

Scopri l'espressione genica transitoria nel tabacco con l'Assembla Gibson e il gene gun. Questo metodo consente di studiare l'espressione in cloroplasti e perossisomi senza enzimi di restrizione.

Transient espressione genica in tabacco con all'Assemblea Gibson e Gene Gun

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