Transient espressione genica in tabacco con all'Assemblea Gibson e Gene Gun

L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare l'espressione genica transitoria di un reporter marcato con GFP nelle cellule epidermiche delle foglie di tabacco. Ciò si ottiene progettando prima un costrutto di DNA che sarà espresso nel cloroplasto e nei perossisomi. Il costrutto viene quindi costruito utilizzando l'amplificazione PCR e l'assemblaggio Gibson.

Successivamente, viene utilizzata una pistola genetica per fornire il costrutto alle cellule epidermiche delle foglie di tabacco. In definitiva, l'imaging della foglia di tabacco mediante microscopia confocale rivela l'espressione di GFP nel cloroplasto e nel perossisoma. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la clonazione classica, è che non richiede enzimi di restrizione e, quindi, qualsiasi sequenza che può essere amplificata mediante PCR può essere clonata.

A causa della flessibilità del disegno genetico, le applicazioni di queste tecniche si estendono su scala più ampia. Ingegneria genetica delle piante agricole Inizia questo protocollo determinando i siti all'interno della cellula vegetale per l'espressione proteica finale. Per questo lavoro, l'obiettivo è quello di indirizzare l'espressione al cloroplasto, al perossisoma e al citosol.

Progettare quindi il costrutto di espressione. Il costrutto deve contenere un promotore, un gene rilevabile e un terminatore all'interno di un singolo plasmide. In questo caso, il promotore costitutivo P end cup two guida l'espressione della GFP, che è seguita dal Nolene Synthe, terminatore o nos t.

Si noti che in questo esperimento, testeremo una serie di tag, tag trot, uno, due e tre terminali espressi alla GFP per l'espressione nei cloroplasti e nei perossisomi. Il metodo di assemblaggio di Gibson dipende dall'azione di diversi enzimi in una miscela preconfezionata per digerire parzialmente le estremità del DNA a doppio filamento e facilitare la ricottura di coppie di basi complementari di sequenze di DNA vicine. Il costrutto finale ha tre parti che devono essere amplificate in quattro reazioni PCR prima dell'assemblaggio di Gibson.

La prima e la seconda reazione amplificano un vettore plasmidico a 8.000 coppie di basi, PORE, che contiene GFP NOS T e un marcatore di resistenza a cany. Il marcatore di resistenza è un buon punto per dividere questo grande DNA in due modelli più piccoli che sono più facilmente amplificati con PCR. La terza reazione amplifica la coppa dell'estremità P del promotore due e la quarta reazione amplifica il triag uno utilizzando software di progettazione in silico come ape design, la base per la base, in modo tale che ci sia una sovrapposizione di 50 coppie di basi tra ogni pezzo.

Quando si ordinano primer per PCR, è possibile utilizzare la sovrapposizione di 50 coppie di basi come primer 25 coppie di basi per direzione Dopo aver eseguito la PCR per amplificare ciascun componente, purificare separatamente il prodotto PCR e diluirlo in acqua distillata deionizzata. Se il modello PCR era una mini preparazione dal trattamento con e coli con l'enzima di restrizione DPN, si rimuoverà il DNA modello contaminante. Quindi, misura le concentrazioni di ciascuno dei pezzi di DNA.

Regolare la concentrazione del vettore a circa 150 nanogrammi per microlitro per ogni costrutto da assemblare, compreso un controllo, estrarre dal congelatore un'aliquota da 15 microlitri della miscela Gibson Assembly e scongelarla con ghiaccio. Utilizzando il tool@gibbon open source online. org, determinare i volumi per le quantità equimolari di ciascuno dei frammenti.

Aggiungere il volume calcolato di ciascuno dei frammenti alla miscela Gibson da 15 microlitri. Preparare anche un controllo del solo DNA vettore. Il volume totale di ogni reazione dovrebbe essere di 20 microlitri.

Usa l'acqua per regolare il volume, se necessario. Incubare le provette a una temperatura compresa tra 50 e 55 gradi Celsius per 30-60 minuti. Dopo l'incubazione, riposizionare le provette sul ghiaccio.

Estrarre un tubo micro fuge contenente un preparato commerciale di 200 microlitri di cloruro di calcio e coli da un congelatore a meno 80 gradi Celsius e scaldarlo leggermente a mano. Quindi aggiungere tutti i 20 microlitri della reazione all'e coli. Incubare le colture su ghiaccio per 30 minuti, quindi trasferirle a bagnomaria a 42 gradi Celsius e shock termico per 60 secondi.

Non utilizzare celle elettrocompetenti. La concentrazione relativamente alta di sale e la bassa concentrazione di DNA possono causare l'arco delle cellule dopo la trasformazione. Rimettere le colture in ICE per due minuti, quindi applicare 750 microlitri di terreno SOC o LB e lasciarle recuperare per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

La piastra successiva, la miscela su piastre LB con cany o altro antibiotico appropriato incubare a 37 gradi Celsius durante la notte vaglia 10 colonie mediante sequenziamento. Si noti che questo metodo può comportare un background più elevato e un numero maggiore di eventi di ricombinazione non bersaglio rispetto alla clonazione tradizionale basata sulla legatura. La trasfezione biotica del tabacco con una pistola genetica è stata precedentemente descritta in JoVE.

Qui, vengono esaminati i passaggi chiave e le differenze rispetto ai protocolli precedenti. Dopo aver amplificato e isolato i costrutti, preparare proiettili di pistola genica come descritto nell'articolo JoVE di Woods e zeto e caricarli nella pistola genetica per la trasfezione del tessuto epidermico della foglia di tabacco Nico Tania Benham Maiana. Scegli una foglia grande vicino alla base di una pianta di tre o cinque mesi.

Posizionalo con cura con il lato inferiore rivolto verso l'alto su tovaglioli di carta bagnati in una capsula di Petri da 15 centimetri indossando un'adeguata protezione per occhi e orecchie. Impostare la pressione dell'elio per la pistola genetica da 200 a 250 PS. Punto con attenzione la pistola genetica tra le costole sul lato inferiore di una foglia, a circa tre o cinque centimetri sopra di essa. Rilasciare la sicura e consegnare le particelle alla foglia.

Usa ogni proiettile due volte nella stessa posizione sulla foglia. Spostati in un'altra posizione e ripeti il processo se la foglia esplode, scarta e inizia una nuova foglia. C'è una certa varianza nella tenacità delle foglie a causa di condizioni di crescita come l'età, l'umidità, eccetera.

Dopo che tutti gli scatti sono stati erogati, copri la foglia e conservala due o tre giorni in condizioni di scarsa illuminazione sul banco. Esaminare la foglia in un microscopio da dissezione dotato di fluorescenza UV e cercare le singole cellule che esprimono GFP. Quando vengono trovate cellule che esprimono GFP, utilizzare le forbici da dissezione per estrarre con cura sezioni di foglia da cinque a 10 millimetri.

Immergere immediatamente ogni singolo frammento di foglia nel pozzetto di un vetrino da microscopio a pozzetti profondi contenente circa 200 microlitri di Tritone X 100 allo 0,1%. Il detergente aiuta a prevenire la formazione di bolle d'aria sulla superficie e il vetrino del microscopio a pozzetti profondi consente di visualizzare l'area di imaging dei tessuti più grandi utilizzando un microscopio confocale dotato di filtri appropriati e un obiettivo a immersione in acqua 40x. In questo studio, i tre diversi costrutti di targeting degli organelli GFP sono stati confrontati con untag GFP e un rubis. Coag.

La microscopia confocale GFP è stata utilizzata per rilevare la fluorescenza GFP nelle singole cellule trasformate transitoriamente in esperimenti di controllo in cui è stata espressa GFP non marcata. La fluorescenza si osserva solo nel nucleo e nel citosol, ma non nei cloroplasti, che sono identificati dall'autofluorescenza rossa della clorofilla, come si vede in questo esempio di una cellula trasfettata con un cloroplasto solo Rubis Oag. Costrutto GFP GFP era espresso nei grandi organelli.

La cella è delineata in bianco. Il giallo indica le aree di colocalizzazione del costrutto con la clorofilla, indicando che il costrutto è mirato al cloroplasto, come mostrato in questa immagine di un triag l'espressione di GFP di una cellula trasfettata è visibile nel cloroplasto, nelle periferie, nel citosol e nei piccoli organelli puntati che si ritiene siano perossisomi. Allo stesso modo, le cellule trasfettate del triag due esprimono anche GFP nel citosol del cloroplasto e i perossisomi del triag tre, che consiste in un segnale perossisomico incorporato all'interno di una regione a bassa complessità della sequenza del cloroplasto, localizzato solo al cloroplasto e al perossisoma.

Si noti che questa cella si trova in un livello fogliare diverso. Questa figura riassume l'espressione osservata nei compartimenti di una tipica cellula epidermica delle foglie di tabacco. Vengono mostrate le dimensioni e le posizioni relative all'interno della cellula e i relativi livelli di espressione osservati tramite trasfezione con pistola genica e microscopia confocale.

Si noti che la GFP untag si localizza al citosol e al nucleo, il PIMT due GFP di controllo si localizza al cloroplasto e triag una GFP, triag due GFP e Triag 3G FP localizzato al cloroplasto e al perossisoma come previsto, dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come costruire un plasma con l'assemblaggio di Gibson, consegnarlo alle foglie di tabacco e osservare l'espressione di GFP entro tre giorni. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare 150 nanogrammi per microlitro di DNA vettoriale per l'assemblaggio di Gibson e 1500 nanogrammi per microlitro del costrutto finale di DNA per realizzare i proiettili della pistola genetica Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la trasfezione dell'agrobatterio per ottenere un'espressione genica stabile piuttosto che transitoria.