Name: Transient espressione genica in tabacco con allAssemblea Gibson e Gene Gun (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T18:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Scopri l'espressione genica transitoria nel tabacco con l'Assembla Gibson e il gene gun. Questo metodo consente di studiare l'espressione in cloroplasti e perossisomi senza enzimi di restrizione.

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Gli autori desiderano ringraziare Jen Sheen del Massachusetts General Hospital per la generosa donazione di piantine di Nicotiana benthamiana. Jen Bush ci ha aiutato molto nella consulenza in coltivazione di piante e la creazione di una zona di camera di crescita. Tom Ferrante dell&#39;Istituto Wyss offerto aiuto cruciale con microscopia confocale. Gli autori desiderano soprattutto ringraziare Don Ingber del Children Hospital di Boston e l&#39;Istituto Wyss per la generosa donazione di una pistola Gene e relative forniture. Il finanziamento per questo progetto è stato fornito attraverso un accordo di cooperazione con il Dipartimento dell&#39;Energia Advanced Research Projects Agency (ARPA-E Award # DE-000079) per la PAS, JCW, e MdM, e attraverso Chimerion Biotechnology, Inc. per MJV.

1. Progettazione di sequenze alternativa-splicing per multipla Organelle Targeting <ol><li> Determinare i siti per l&#39;espressione finale di proteine. Per questo lavoro, l&#39;interesse è in mira la cloroplasti, perossisomi, e citosol. </li><li> Utilizzare la letteratura per identificare proteine ​​e DNA sequenze note di indirizzare le proteine ​​per organelli di interesse. In questo caso un cloroplasto di targeting sequenza di Arabidopsis thaliana L-isoaspartate metiltransferasi 6,15, e un perossisomi mira sequenza di Arabidopsis thaliana transthyretin come S-allantoina sintasi 16,17 sono stati determinati. </li><li> Identificare un regime-splicing alternativo che dovrebbe indirizzare le proteine ​​di interesse per gli organelli corretti. Per questo lavoro, splice siti come osservato in un sistema di Arabidopsis naturale 6. La sequenza di mRNA è stata ridisegnata lasciando i siti di splicing naturali, ma le sequenze sono stati collocati codifica peroxis-cloroplasto oome-targeting tag all&#39;interno introni alternativamente-splicing (Figura 1). </li></ol> 2. Assemblea Gibson di parti di DNA Vedi anche figura 2. Il metodo di assemblaggio Gibson dipende dall&#39;azione di numerosi enzimi in un mix pre-made a 1) parzialmente digerire le estremità del DNA a doppio filamento di rendere filamenti singoli e 2) ricottura paia di basi gratuiti della vicina pezzi di DNA. Questo permette la clonazione di frammenti di DNA senza le limitazioni dei siti di restrizione. <ol><li> Scegliere un ordine per gli elementi del costrutto di DNA plasmidico. Come esempio TriTag-1 ha elementi di: a) un vettore plasmidico (pori, contenente un costrutto GFP noto a lavorare in piante, un marcatore di resistenza alla kanamicina, e origini di replicazione di E. coli e Agrobacterium tumefaciens host), b) una sequenza promotore, (P ENTCUP2, mostrato come costitutivo in piante), C) un cloroplasto rivolti sequenza (CTS), c) una sequenza di targeting perossisomi (PTS), e d) una serie di siti di splicing come descritto in precedenza 6. </li><li> Progettare la base-per-base costrutto con il software di progettazione in silico. Scimmia è un pacchetto freeware open source utile per questo lavoro. Nota: TriTag-1, ha l&#39;ordine: plasmide vettore, promoter, ATG, sito di splice donatore, cloroplasti sequenza bersaglio, sito donatore di splicing, luogo neutro, accettore sito di splice, perossisomi sequenza bersaglio, accettore sito di splice, GFP contenute nel vettore plasmidico . <ol><li> Progettare il silico costrutto di DNA in modo tale che vi sia una sovrapposizione di 50 bp tra ogni pezzo al momento dell&#39;ordine primer per PCR. È possibile utilizzare la sovrapposizione 50 bp come primer: 25 bp ciascuna direzione. <ol><li> Essere sicuri di tenere traccia della provenienza di ciascuno dei pezzi di sequenza. E &#39;come: un plasmide di essere coltivate e miniprepped; una sequenza lineare che può essere utilizzato come modello PCR; o una sequenza che dovrà esseresintetizzato in commercio? Diverse aziende offrono servizi di sintesi del DNA a basso costo per frammenti &lt;500 bp. In questo caso, il TriTag sé è 437 bp quindi era vantaggioso per ordinare commercialmente. </li><li> I migliori risultati arriveranno se tutti i frammenti siano PCR-amplificati e purificati dalla loro DNA template. Il marcatore di resistenza è un buon posto per dividere questo grande DNA in due modelli più piccoli che sono più facilmente PCR-amplificato. </li><li> Di restrizione restrizione enzima DpnI taglia il DNA metilato. Se il modello di PCR era una miniprep da E. coli, trattamento DpnI rimuoverà il contaminante DNA stampo. </li></ol></li></ol></li><li> Purificare tutte le sequenze di DNA separatamente ed eluire in acqua, TE o tampone EB. <ol><li> parte PORE vettore 1, ~ 3000 bp (frecce verdi). PCR amplificato e DpnI trattata. </li><li> PORE vettore parte 2, ~ 3000 bp (frecce nere). PCR amplificato e DpnI trattata. </li><li> TriTag inserto, 437 bp (frecce blu). Ordinato in commercio. Resuspend in DDH 2 O. </li><li> P ENTCUP promotore, ~ 750 bp (frecce arancioni). PCR-amplificato e DpnI trattata. </li></ol></li><li> Misurare le concentrazioni di ciascuno dei pezzi di DNA. Obiettivo per 150 ng / ml dei pezzi di vettore. </li><li> Prelevare un &#39;aliquota del mix di montaggio Gibson fuori dal freezer e scongelare sul ghiaccio. Questa è disponibile in commercio, ma anche di semplice realizzazione in laboratorio 12-14. <ol><li> Ci sono due passi per questa ricetta: a 5x master mix viscoso e 15 reazione dimensioni aliquote di 1.33x microlitri. Il master mix 5x contiene: 3 ml di 1 M Tris-HCl pH 7.5, 300 ml 1 M MgCl 2, 600 microlitri 10 mM di ciascun dNTP, 300 ml 1 M DTT, 1,5 g di PEG-8000, 20 mg di NAD, e DDH 2 O a 6 ml. Preparare 320 microlitri aliquote (18) e congelare tutti tranne uno a -20 ° C. La soluzione sarà molto viscoso. Etichettare questi &quot;tampone isoterma 5X&quot; </li><li> Per quello rimanente (320 ml), aggiungere 1,2 microlitri T5 Exonuclease, 20 microlitri Phusion Alto-Fidelity DNA polimerasi, 160 microlitri Taq DNA Ligase e 700 ml DDH 2 O. Preparare 15 aliquote microlitri (~ 80) sul ghiaccio in provette per PCR e conservare a -20 ° C. </li></ol></li><li> Determinare il volume di quantità equimolari di ciascuno dei frammenti. Ci sono alcuni calcolatori online, tra cui Gibthon.org. Ci dovrebbe essere un totale di 5 ml di tutti i pezzi di DNA. Aggiungerli al 15 microlitri Gibson mix aliquota. Se questo richiede volumi troppo piccolo per pipetta, diluire i frammenti di DNA e / o utilizzare più di una aliquota. <ol><li> Non dimenticate di preparare un controllo del DNA vettore da solo (ad esempio, la parte di DNA che contiene il marcatore di resistenza agli antibiotici) e portare a volume con acqua. </li></ol></li><li> Incubare le provette in un termociclatore a 50-55 ° C per 30-60 minuti. Sostituire su ghiaccio e trasformare in E. coli attraverso le cellule chimicamente competenti shock termico. Non utilizzare cellule elettrocompetenti. La concentrazione di sale e la concentrazione di DNA relativamente bassapuò causare le cellule a arco. <ol><li> Applicare tutte le 20 microlitri di una preparazione commerciale di 200 microlitri di calcio cloruro competente E. coli. Incubare 30 min in ghiaccio e shock termico 60 sec a 42 ° C </li><li> Ritorno al ghiaccio 2 min, applicare 750 microlitri SOC o terreno LB e recuperare agitazione in una provetta 30 minuti a 37 ° C. Piatto il composto e diluizioni adeguate LB + Kan (o altro antibiotico appropriato). Questo può tradursi in background maggiore (e un numero maggiore di eventi di ricombinazione non-target) rispetto ai tradizionali clonazione a base di legatura, ma vale la pena di schermo di circa 10 colonie. </li></ol></li><li> Conferma clone tramite sequenza e memorizzare una aliquota a -80 ° C </li></ol> 3. Biolistic trasfezione di tabacco con il Gene Gun Questa è una tecnica che si instaura in JoVE 18,19. Passaggi chiave e le differenze sono descritte di seguito. <ol><li> Crescere 50-100 ml E. coli o 200 ml Agrobacterium. Maxi-prep cultura. Una concentrazione di circa 1.500 ng / ml è necessaria per continuare. </li><li> Preparare gene proiettili di pistola come descritto in precedenza. Caricarli nella Gene Gun. </li><li> Per la trasfezione di Nicotiana benthamiana tabacco foglia tessuto epidermico, scegliere un grande foglia vicino alla base di un impianto di 3 mesi. Tagliare con cautela e metterlo lato inferiore su tovaglioli di carta bagnati in un piatto di 15 centimetri Petri. </li><li> Impostare la pressione Lui per il Gene Gun a 200-250 psi. </li><li> Orientare con attenzione la pistola genica tra nervature sul lato inferiore di una foglia, circa 3-5 cm sopra di esso. Rilasciare la sicurezza e fornire le particelle all&#39;anta. Ogni proiettile può essere utilizzato per due volte nella stessa posizione sulla foglia. Se esplode foglia, scartano e avviare una nuova foglia-c&#39;è qualche variazione in foglia tenacità a causa di condizioni di crescita, come l&#39;età, l&#39;umidità, ecc Per una foglia di 12 cm, si aspettano per adattarsi circa 6 colpi. </li><li> Conservare la foglia, coperto con la parte superiore di unCapsula di Petri per 2-3 giorni in condizioni di scarsa luminosità in panchina. </li><li> Esaminare la foglia in un microscopio dissezione dotato di fluorescenza UV, e la ricerca di singole cellule che esprimono GFP. Sezionare 5-10 mm sezioni di foglia. </li><li> Immergere la foglia in un vetrino da microscopio ben profondità sotto ~ 200 microlitri 0,1% Triton X-100. Il detersivo aiuta a prevenire la formazione di bolle d&#39;aria sulla superficie, e la profonda microscopio ben vetrino consente una grande area di esposizione del tessuto. </li></ol> 4. Microscopia confocale di Tissue trasfezionati Queste istruzioni variano per ogni strumento, quindi è essenziale per ottenere adeguatamente formati. <ol><li> Per gli esperimenti di rivelazione di fluorescenza, impostare il laser di eccitazione a 489 nm, e impostare i rivelatori fotomoltiplicatori a 500-569 nm per GFP fluorescenza e 630-700 nm per la clorofilla auto-fluorescenza. Celle di immagine utilizzando un obiettivo 40x immersione in acqua. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo studio, strategie semplici sono descritti per la localizzazione di una singola proteina transgenica a più compartimenti cellulari nelle piante. L&#39;obiettivo era di progettare costrutto che esprimesse un singolo gene in più di un organello in Nicotiana benthamiana. Le strategie includono progettazione razionale di base di GFP-costrutti di DNA, il montaggio Gibson, la consegna dei plasmidi a celle foglia con il Gene Gun, e l&#39;osservazione dei risultati con microscopia confocale. <p class="jove...

Questo lavoro è un progetto di ingegneria / biologia sintetica metabolica in cui le cellule vegetali sono progettati per esprimere una proteina reporter in diversi organelli ma solo con un singolo costrutto di DNA. Un approccio per proteine ​​bersaglio a più di una posizione comporta clonazione più copie genetiche, ciascuna contenente un diverso peptide localizzazione. Ogni copia deve essere introdotto da successive ritrasformazione, o, in alternativa, da backcrossing singole trasformazioni 1. Ciò comporta la clonazione supplementare, ed è limitata da un tag di localizzazione per ogni terminale. Un altro modo per localizzare una proteina a più riprese è attraverso splicing alternativo 2-5. RNA è trascritto da un singolo gene, ma diverse copie della trascrizione sono trattati in modo diverso, spesso in più di un modo per cella. Ciò può comportare più di un RNA messaggero nella cella trascritto da un singolo gene. Questi diversi messengeRNA R possono codificare per diverse isoforme della stessa proteina, o nel caso di un frameshift, una proteina diversa. Sebbene splicing alternativo è stato descritto in letteratura per molti anni, i meccanismi di azione e donatore conservati e splice siti recettoriali sono solo stati chiariti più recente 6. Poiché questi siti vengono meglio descritti, si aprono opportunità per l&#39;ingegneria. Gli ingegneri metaboliche delle piante si trovano ad affrontare una sfida quando esprime una proteina in più organelli. Per una proteina che è da localizzare a più organello, il tecnico deve clonare il gene stesso più volte, ciascuno con una sequenza segnale separato dirigendolo al organello di interesse. Per un singolo gene in tre organelli, questo è semplicemente tre geni. Ma per una via metabolica sei gene, questo si espande a 18 geni, un notevole sforzo di clonazione. La combinazione di più sequenze di localizzazione in un unico segno gene alternativa-impiombatoriduce ificantly questo sforzo. Ad esempio, re-engineering fotorespirazione 7,8 e sintesi isoprenoide 9,10 coinvolge sia i cloroplasti e perossisomi. Nel nostro caso abbiamo approfittato dei siti di splicing come osservato in un sistema di Arabidopsis thaliana naturale descritto in precedenza 6. Abbiamo razionalmente riprogettato la sequenza di mRNA di lasciare i siti di splicing naturali solo, ma messo sequenze che codificano tag-perossisomi rivolti-cloroplasto o all&#39;interno introni alternativamente-splicing (Figura 1). La proteina espressa può o non può avere un tag, a seconda che il pre-mRNA che codifica è stato escisso come un introne (Figure 1g e 1h). Per ulteriori informazioni sulla progettazione dei costrutti presentati in questo lavoro, vedere l&#39;articolo compagna 11. Perché questo è ancora uno sforzo significativo clonazione, il montaggio Gibson, un nuovo metodo di clonazione costrutti di DNA, è used in costruzione. Il metodo Gibson può essere utilizzato per qualsiasi sequenza, indipendentemente siti di restrizione (Figura 2) 12-14. Il mix specifico di enzimi permette un solo passaggio, assemblaggio isotermica. In questo metodo, più parti a doppio filamento lineare di DNA sono progettati in modo tale che essi hanno sequenze sovrapposte di ~ 50 bp. L&#39;assemblaggio miscela enzimatica Gibson digerisce parzialmente le parti di DNA lineari, esponendo singoli filamenti di sequenze omologhe. Questi parziali sequenze a singolo filamento sono ri-ricotti nella miscela di reazione, con un conseguente rapido, one-step, sequenza-indipendente, reazione subcloning privo di legatura. Questo lavoro descrive 1) progettazione razionale costrutti splicing alternativo per l&#39;espressione di cloroplasti delle piante, perossisomi, e citosol, 2) la loro clonazione utilizzando il nuovo metodo privo di legatura di riunione Gibson, 3) la loro consegna nelle cellule delle foglie di tabacco con Gene Gun, e 4) I risultati mostrano il targeting organelli, come osservato con GFPe microscopia confocale.

<table><tbody><tr><td>Primer per oligonucleotidi</td><td>IDT</td> <td>(personalizzato)</td> <td>Design specifico per il costrutto</td></tr><tr><td>GeneBlocks</td><td>IDT</td> <td>(personalizzato)</td> <td>500 bp oligonucleotidi</td></tr><tr><td>ApE software</td><td>U Utah</td> <td>(download)</td> <td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td></tr> <tr><td>MinElute kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Utilizzato per purificare i prodotti PCR</td></tr><tr><td>Kit QIAprep spin miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Utilizzato per preparare quantità adeguate al clonaggio di plasmidi</td></tr><tr><td>Phusion Master Mix con tampone GC NEB</td><td></td><td>M0532S</td><td>Utilizzato per amplificare con PCR il gene di interesse Miscela di</td></tr><tr><td>reazione di assemblaggio Gibson</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Master mix dei seguenti 9 ingredienti</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH7.5</td><td>Teknova</td><td>T1075</td><td>Miscela di assemblaggio Gibson</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>G Biosiences</td><td>82023-086</td><td>Miscela di montaggio Gibson</td></tr><tr><td>Miscela dNTP</td><td>Fermentas</td><td>R0192</td><td>Miscela di assemblaggio Gibson</td></tr><tr><td>1 M DTT</td><td>Fermentas</td><td>R0861</td><td>Miscela di assemblaggio Gibson</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Affymetrix</td><td>19966</td><td>Miscela di assemblaggio Gibson</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Applichem</td><td>A1124,0005</td><td>Miscela di assemblaggio Gibson</td></tr><tr><td>Esonucleasi T5</td><td>Epicentro</td><td>T5E4111K</td><td>Miscela di assemblaggio Gibson</td></tr><tr><td>Phusion polimerasi</td><td>NEB</td><td>F530S</td><td>Miscela di assemblaggio Gibson</td></tr><tr><td>Taq DNA ligasi</td><td>NEB</td><td>M0208L</td><td>Miscela di assemblaggio Gibson</td></tr><tr><td>Gibthon.org</td><td></td><td></td><td>Sito web per semplificare i calcoli</td></tr><tr><td>Plasmide PLUS Maxi kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td>Utilizzato per preparare il DNA per i proiettili della pistola genetica Sistema</td></tr> di <tr><td>pistola genetica</td><td>BioRad</td><td>165-2451</td><td>Include tutte le parti necessarie</td></tr><tr><td>Nicotania benthamiana</td><td>(n/a)</td><td>(n/a)</td><td>Dono di Jen Sheen, MGH</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Leica</td><td>SP5 X MP</td><td>Imaging delle cellule risultanti</td></tr><tr><td>Vetrini a pozzetti profondi Microscopia</td><td>elettronica</td><td>Scienze 71561-01</td><td>Utilizzato per l'imaging confocale</td></tr><tr><td>Un editor di plasmidi (ApE) </td><td>Università dello Utah </td><td></td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td></tr><tr><td>Gibthon:Calcolatore</td><td></td><td></td> di legatura <td>http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</td></tr></tbody></table>

transient espressione genica in tabacco con all&#39;assemblea gibson e gene gun

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Al fine di indirizzare una singola proteina a più organelli subcellulari, piante tipicamente duplicare i geni rilevanti, ed esprimono ogni gene separatamente utilizzando complesse strategie di regolamentazione, tra cui promotori differenziali e / o sequenze di segnali. Ingegneri metaboliche e biologi sintetici interessato a colpire enzimi per un particolare organello trovano ad affrontare una sfida: per una proteina che è da localizzare a più di un organello, il tecnico deve clonare il gene stesso più volte. Si presenta una soluzione a questa strategia: sfruttando splicing alternativo dell&#39;mRNA. Questa tecnologia sfrutta cloroplasto stabilito e dei perossisomi mira sequenze e li combina in un unico mRNA che viene alternativamente impiombata. Alcune varianti di splicing vengono inviati al cloroplasto, alcuni al perossisoma, e alcuni al citosol. Qui il sistema è progettato per multipli organello targeting con splicing alternativo. In questo lavoro, GFP si aspettava di essere espressed nei cloroplasti, citosol, e perossisomi da una serie di razionalmente progettati 5 &#39;tag mRNA. Questi tag hanno il potenziale per ridurre la quantità di clonazione necessaria quando i geni eterologhi devono essere espressi in più organelli subcellulari. I costrutti sono stati progettati in opera precedente 11, e sono stati clonati usando Gibson assembly, un metodo di clonazione indipendente legatura che non richiede enzimi di restrizione. I plasmidi risultanti sono stati introdotti in Nicotiana benthamiana celle foglia epidermica con un protocollo Gene Gun modificato. Infine, foglie trasformate sono state osservate con microscopia confocale.

Lo sforzo progettuale è stato il risultato di una pianificazione significativa. Novel di questo progetto è l&#39;uso di splicing alternativo per creare un pre-mRNA che viene tradotto in proteine ​​differenzialmente espressi. Queste proteine ​​sono espresse in diversi organelli, in questo caso il cloroplasti, perossisomi e / o citosol. Abbiamo adattato gene Arabidopsis naturale che viene alternativamente impiombato 6, e collocato conosciuti cloroplasto 6 e perossisomi 17 mira seq...

Questo lavoro descrive un nuovo metodo per selettivamente organelli subcellulari nelle piante, saggiata usando l&#39;BioRad Gene Gun.

Transient espressione genica in tabacco con all&#39;Assemblea Gibson e Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare l'espressione genica transitoria di un reporter marcato con GFP in cellule epidermiche di foglia di tabacco. Questo risultato si ottiene innanzitutto progettando un costrutto di DNA che verrà espresso nei cloroplasti e nelle perossisomi. Il costrutto viene quindi assemblato mediante amplificazione PCR e assemblaggio Gibson.Successivamente, un gene gun viene utilizzato per trasferire il costrutto nelle cellule epidermiche della foglia di tabacco. Infine, l'analisi della foglia di tabacco mediante microscopia confocale rivela l'espressione di GFP nel cloroplasto e nei perossisomi. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il clonaggio classico, è che non richiede enzimi di restrizione e, pertanto, qualsiasi sequenza amplificabile mediante PCR può essere clonata.A causa della flessibilità del disegno genetico, le applicazioni di queste tecniche si estendono a una scala più ampia. L'ingegneria genetica delle piante agricole inizia questo protocollo determinando i siti all'interno della cellula vegetale per l'espressione finale della proteina. Per questo lavoro, l'obiettivo è indirizzare l'espressione al cloroplasto, alla perossisoma e al citosol.Successivamente, progettare il costrutto di espressione. Il costrutto deve contenere un promotore, un gene rilevabile e un terminatore all'interno di un singolo plasmide. In questo caso, il promotore costitutivo P end cup due guida l'espressione della GFP, seguita dal terminatore Nolene Synthe o nos t.Si noti che in questo esperimento verranno testate una serie di sequenze, le trit tag uno, due e tre, espresse a livello del terminale N di GFP per l'espressione in cloroplasti e perossisomi. Il metodo di assemblaggio Gibson si basa sull'azione di diversi enzimi presenti in una miscela pronta che degradano parzialmente le estremità del DNA a doppio filamento e facilitano l'appaiamento di basi complementari tra sequenze di DNA adiacenti. Il costrutto finale è composto da tre parti che devono essere amplificate mediante quattro reazioni di PCR prima dell'assemblaggio Gibson.Le prime due reazioni amplificano un vettore plasmidico di 8.000 paia di basi, PORE, che contiene GFP NOS T e un marcatore di resistenza alla canamicina. Il marcatore di resistenza rappresenta un buon punto in cui dividere questo DNA di grandi dimensioni in due templati più piccoli, più facilmente amplificabili tramite PCR. La terza reazione amplifica il promotore P end cup due, e la quarta reazione amplifica triag uno utilizzando un software di progettazione in silico come ape design, assemblando il costrutto base per base, in modo che vi sia un'overlap di 50 paia di basi tra ciascun frammento.Quando si ordinano primer per la PCR, è possibile utilizzare l'overlap di 50 paia di basi come primer, con 25 paia di basi in ciascuna direzione. Dopo aver eseguito la PCR per amplificare ciascun componente, purificare separatamente i prodotti della PCR e diluirli in acqua deionizzata distillata. Se il template della PCR era una mini-preparazione da e. coli trattata con l'enzima di restrizione DPN, si rimuoverà il DNA template contaminante. Successivamente, misurare le concentrazioni di ciascun frammento di DNA.Regolare la concentrazione del vettore a circa 150 nanogrammi per microlitro per ciascun costrutto da assemblare, inclusa una condizione di controllo; prelevare un'aliquote di 15 microlitri della miscela di Gibson Assembly dal congelatore e farla scongelare sul ghiaccio. Utilizzando lo strumento open source online @gibbon. org, determinare i volumi corrispondenti a quantità equimolari di ciascun frammento.Aggiungere il volume calcolato di ciascun frammento alla miscela Gibson da 15 microlitri. Preparare anche un controllo costituito soltanto dal DNA vettore. Il volume totale di ciascuna reazione deve essere di 20 microlitri.Usare acqua per regolare il volume, se necessario. Incubare i tubi a 50-55 gradi Celsius per 30-60 minuti. Al termine dell'incubazione, riporre nuovamente i tubi sul ghiaccio.Rimuovere una provetta microcentrifuga contenente una preparazione commerciale di 200 microlitri di *E. coli* competente al cloruro di calcio da un congelatore a meno 80 gradi Celsius e riscaldarla leggermente a mano. Aggiungere quindi tutti i 20 microlitri della reazione all'*E. coli*. Incubare le colture sul ghiaccio per 30 minuti, quindi trasferirle in un bagno termico a 42 gradi Celsius ed esporle a un trattamento termico di 60 secondi.Non utilizzare cellule elettrocompetenti. La concentrazione relativamente elevata di sale e quella bassa di DNA potrebbero causare un arco nelle cellule dopo la trasformazione. Rimettere le colture sul ghiaccio per due minuti, quindi aggiungere 750 microlitri di mezzo SOC o LB e lasciare riposare per 30 minuti a 37 gradi Celsius.Successivamente, piastrare la miscela su piastre di LB contenenti canamicina o un altro antibiotico appropriato e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte; selezionare 10 colonie mediante sequenziamento. Si noti che questo metodo può determinare un background più elevato e un numero maggiore di eventi di ricombinazione non specifici rispetto al tradizionale clonaggio basato sulla ligazione. La trasfezione biolistica del tabacco mediante gene gun è stata precedentemente descritta in JoVE.Qui vengono esaminati i passaggi chiave e le differenze rispetto ai protocolli precedenti. Dopo aver amplificato e isolato i costrutti, preparare le pallottole per la biolistica come descritto nell'articolo di JoVE di Woods e Zeto e caricarle nella biolistica per la trasfezione del tessuto epidermico delle foglie di tabacco Nico Tania Benham Miana. Scegliere una foglia grande vicina alla base di una pianta di tre a cinque mesi di et&agrave;.Posizionarlo con la faccia inferiore rivolta verso l'alto su tovaglioli di carta bagnati in una piastra di Petri da 15 centimetri indossando idonea protezione per gli occhi e le orecchie. Impostare la pressione dell'elio per la pistola genica tra 200 e 250 PS.I. Mirare con attenzione la pistola genica tra le nervature sulla faccia inferiore di una foglia, a circa tre-cinque centimetri di distanza. Disinnescare la sicura e consegnare le particelle alla foglia.Utilizzare ogni proiettile due volte nella stessa posizione sulla foglia. Passare a un'altra posizione e ripetere il processo se la foglia esplode, scartarla e iniziare con una nuova foglia. Esiste una certa variabilità nella resistenza delle foglie a causa delle condizioni di crescita, come l'età, l'umidità, ecc.Dopo aver effettuato tutti i trattamenti, coprire la foglia e conservarla per due o tre giorni in condizioni di luce tenue sul banco di lavoro. Esaminare la foglia al microscopio stereoscopico dotato di fluorescenza UV e cercare cellule singole che esprimono GFP. Quando si individuano cellule che esprimono GFP, utilizzare forbici da dissezione per estrarre con attenzione sezioni di foglia lunghe da cinque a dieci millimetri.Immergere immediatamente ciascun frammento fogliare nel pozzetto di un vetrino microscopico a pozzetti profondi contenente circa 200 microlitri di Triton X-100 allo 0,1%. Il detergente aiuta a prevenire la formazione di bolle d'aria sulla superficie e il vetrino a pozzetti profondi consente un'area maggiore per l'immagine del tessuto, permettendo l'analisi cellulare mediante microscopio confocale dotato di filtri appropriati e di un obiettivo ad immersione in acqua 40x. In questo studio, i tre diversi costrutti per il targeting di GFP a livello degli organelli sono stati confrontati con GFP non marcata e rubis.Coag.La microscopia confocale GFP è stata utilizzata per rilevare la fluorescenza GFP in singole cellule transitorieamente trasformate in esperimenti di controllo in cui era espressa GFP non marcata. La fluorescenza è osservata solo nel nucleo e nel citosol, ma non nei cloroplasti, che vengono identificati dalla autofluorescenza rossa della clorofilla come mostrato in questo esempio di una cellula trasfettata con un costrutto GFP solo per il cloroplasto Rubis Oag. Il costrutto GFP è stato espresso nei grandi organelli.La cellula è delineata in bianco. Il giallo indica le aree di colocalizzazione del costrutto con la clorofilla, indicando che il costrutto è diretto verso il cloroplasto, come mostrato in questa immagine di una cellula trasfettata con triag uno: l'espressione di GFP è visibile nel cloroplasto, nelle periferie, nel citosol e in piccole organelle puntiformi ritenute perossisomi. Analogamente, le cellule trasfettate con triag due esprimono GFP nel cloroplasto, nel citosol e nei perossisomi. Triag tre, che comprende un segnale perossisomiale inserito all'interno di una regione a bassa complessità della sequenza del cloroplasto, si localizza esclusivamente nel cloroplasto e nei perossisomi.Si noti che questa cellula si trova in un diverso strato della foglia. Questa figura riassume l'espressione osservata nei compartimenti di una tipica cellula epidermica della foglia di tabacco. Sono mostrate le dimensioni e le posizioni relative all'interno della cellula, nonché i livelli relativi di espressione osservati mediante trasfezione con gene gun e microscopia confocale.Si noti che la GFP non marcata si localizza nel citosol e nel nucleo, il controllo PIMT due GFP si localizza nel cloroplasto e triag uno GFP, triag due GFP e Triag 3G FP si localizzano nel cloroplasto e nei perossisomi come previsto. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come costruire un plasmide mediante assemblaggio Gibson, trasferirlo mediante biolistica alle foglie di tabacco e osservare l'espressione della GFP entro tre giorni. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare 150 nanogrammi per microlitro di DNA vettoriale per l'assemblaggio Gibson e 1500 nanogrammi per microlitro del costrutto finale di DNA per preparare i proiettili per la biolistica. Seguendo questa procedura, altri metodi come la trasfezione mediante agrobatterio possono essere eseguiti per ottenere un'espressione genica stabile anziché transitoria.

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