Slice Cervello biotinilazione: An Ex Vivo Approccio alla Misura Regione-specifica proteina Tratta plasma membrana in neuroni adulti

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i cambiamenti acuti nelle proteine della superficie neuronale. Nelle preparazioni di fette di cervello ex vivo, ciò si ottiene preparando prima fette di cervello acute vitali. Successivamente, le fette vengono trattate con farmaci di interesse.

Quindi le proteine della superficie cellulare vengono marcate utilizzando i reagenti di tonazione imperiale di membrana. Infine, le proteine biotinilate di superficie vengono isolate utilizzando la cromatografia streptococcica avid e di affinità. In definitiva, l'immuno plotting viene utilizzato per quantificare i cambiamenti nell'espressione della superficie proteica in seguito a trattamenti farmacologici.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'azione basata sulle cellule, è che il traffico proteico neuronale viene esaminato in situ piuttosto che in sistemi di espressione eterologhi o colture neuronali primarie. In generale, le persone che non conoscono questo metodo faranno fatica a preparare fette di marca valide. Ok. Per preparare le fette di cervello, inizia preparando un liquido cerebrospinale artificiale fresco o A CSF e saccarosio integrato A CSF o S-A-C-S-F secondo il protocollo di testo, freddo.

L'S-A-C-S-F su ICE utilizza il 95% di ossigeno con il 5% di anidride carbonica per saturare i tamponi con l'ossigeno facendo gorgogliare per 20 minuti sul ghiaccio. Dopo aver sacrificato da P 30 a 38 topi mediante lussazione cervicale e decapitazione e aver rimosso rapidamente il cervello, metterli in S-A-C-S-F ossigenato pre-raffreddato utilizzando un microtomo vibrante. Crea sezioni cerebrali di 300 micron nella regione di interesse e, se lo desideri, separa gli emisferi destro e sinistro da utilizzare rispettivamente come sezioni di controllo e sperimentali.

Utilizzando una pipetta pastier lucidata a fuoco, trasferire le fette in camere di contenimento del fondo della rete contenenti A CSF ossigenato. Lasciare riposare le fette per 40 minuti a 31 gradi Celsius con un gorgogliamento continuo e delicato. Dopo l'incubazione, trasferire le fette in camere a maglie individuali.

In 24 pozzetti impiattare e lavare le fette tre volte in preriscaldamento ossigenato A CSF con bolle costanti. Se si testano composti, aggiungere un decimo del volume di un farmaco concentrato 10 x e mescolare invertendo delicatamente dopo aver agitato delicatamente le piastre a bagnomaria alla temperatura desiderata. Usa il liquido cerebrospinale ghiacciato per raffreddare rapidamente le fette lavandole tre volte per acquistare le proteine superficiali dell'aato.

Preparare la biotina fresca da 1,0 milligrammi per millilitro di sulfamidico N-H-S-S-S in ghiaccio freddo A CSF Aggiungere 0,75 millilitri di soluzione alle fette e incubare in ghiaccio per 45 minuti. Dopo aver utilizzato il liquido cerebrospinale A ghiacciato per lavare rapidamente le fette tre volte, incubarle per 10 minuti in un liquido cerebrospinale A ghiacciato su ghiaccio, quindi utilizzare un tampone di quench a fette ghiacciato per lavare le fette tre volte e incubarle con 0,75 millilitri di fetta, tampone di estinzione due volte per 25 minuti ciascuna su ghiaccio per estinguere la biotina libera di suo N-H-S-S-S per preparare lisati tissutali. Lavare le fette tre volte in liquido cerebrospinale ghiacciato prima di utilizzare una pipetta per pasti lucidata a fuoco per trasferire ogni fetta in una provetta da microcentrifuga.

Pellettare delicatamente le fette con centrifusion a 200 GS per un minuto e aspirare con cura l'A CSF rimanente. Quindi aggiungere 400 microlitri di ghiaccio freddo, strappare un pi greco e utilizzare una pipetta P 200 per rompere il tessuto pipettando su e giù una volta per completare la lisi. Trasferire il tessuto dissociato in una provetta nuova e incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius con centrifuga rotante a 18.000 Gs per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Per pellettare i detriti cellulari isolare le proteine biotinilate e analizzarle mediante immuno blot. Secondo il protocollo di testo, il trasportatore neuronale della dopamina viene internalizzato in risposta all'attivazione della PKC nelle linee cellulari. Nonostante molti rapporti dimostrino che la dopamina indotta da PKC, il trasportatore attivo o le perdite di superficie del debito in una varietà di linee cellulari e sistemi di espressione, è stato difficile confermare questo risultato in neuroni dopaminergici in coltura, abbiamo utilizzato fette di AAL stri di topo per testare direttamente se dat internalizza in risposta all'attivazione di PKC nei neuroni dopaminergici adulti, come visto.

Qui abbiamo rilevato una robusta espressione di DA sulla superficie dello striato di topo in condizioni trattate con basilico o veicolo con 81,4 più o meno il 5,8% di debito totale sulla superficie cellulare Attivazione di PKC con quattro sfere 12. L'acetato di Myra State 13 ha ridotto significativamente l'espressione della superficie del dat al 60,8 più o meno il 5,2% del debito totale, che corrisponde a circa il 30% di perdita di debito dalla membrana plasmatica. Al contrario, solo l'1,6% più o meno lo 0,4% della tirosina idrossilasi totale è stato biotinilato coerentemente con la sua localizzazione intracellulare e confermando che il reagente di tonazione è stato escluso dall'interno cellulare dei neuroni dopaminergici.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare i cambiamenti nell'espressione delle proteine di membrana nei terminali neuronali intatti.