Name: Slice Cervello biotinilazione: An Ex Vivo Approccio alla Misura Regione-specifica proteina Tratta plasma membrana in neuroni adulti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Scopri come quantificare i cambiamenti acuti delle proteine di superficie neuronali in fette cerebrali ex vivo. Questo metodo utilizza biotinilazione e cromatografia di affinità per analizzare il traffico proteico nella membrana plasmatica.

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Questo lavoro è stato finanziato dal NIH sovvenzioni DA15169 e DA035224 di HEM

Tutti movimentazione degli animali e la raccolta dei tessuti è stata effettuata in conformità con le linee guida della University of Massachusetts Medical School Institutional Animal Care Comitato Usa (IACUC), seguendo il protocollo # approvato A1506 (Melikian, PI). Soluzioni necessarie Liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) - Make fresco tutti i giorni 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1.2 mM MgCl 2, 2.4 mM CaCl 2, 26 NaHCO mm 3, e 11 mm di glucosio Nota: Preparare ACSF come una soluzione madre 10x, esclusi NaHCO 3 e glucosio. Rendere soluzioni di lavoro 1x ogni giorno dal magazzino 10x, che completa con fresco NaHCO 3 e glucosio. Saccarosio-integrato ACSF (SACSF) - Make fresco tutti i giorni 250 suc mMrosa, 2.5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1.2 mM MgCl 2, 2.4 mM CaCl 2, 26 NaHCO mm 3, e glucosio 11 mM Nota: Preparare SACSF come una soluzione madre 10x, esclusi NaHCO 3 e glucosio. Rendere soluzioni di lavoro 1x ogni giorno dal magazzino 10x, che completa con fresco NaHCO 3 e glucosio. Solfo-N-hydroxysuccinyl-SS-biotina (solfo-NHS-SS-biotina, Pierce Chemical Company) Le soluzioni madre dovrebbero essere 200 mg / ml in DMSO e sono resistenti a molteplici cicli di congelamento / scongelamento. Aliquote vengono conservati a -20 ° C. L&#39;estere succinil viene rapidamente idrolizzato in soluzione acquosa, quindi le soluzioni di lavoro deve essere preparata immediatamente prima di applicare a fette. Slice Quench Solution ACSF integrato con la glicina 100 mM RIPA Lysis Buffer Tris 10 mM, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 1% Triton-X-100, 0,1% SDS, 1% Na desossicolato RIPA con inibitori della proteasi (RIPA / PI) - Fare fresco tutti i giorni RIPA integrato con 1 mM leupeptina, 1 mM pepstatina, 1 micron aprotinin, e 1 mm phenylmethyl fluoruro sulfonyl. 1. Preparare cervello Fette <ol><li> Fai fresco SACSF 1x e 1x ACSF </li><li> Raffreddare SACSF sul ghiaccio in un piccolo bicchiere. Questo verrà utilizzato per contenere il cervello di topo appena raccolto. </li><li> Saturare il ACSF e SACSF con l&#39;ossigeno facendo gorgogliare con il 95% / 5% O 2 / CO 2, 20 min in ghiaccio. </li><li> P30-38 topi dovrebbero essere utilizzati per la vitalità del tessuto ottimale. Sacrificare animali per dislocazione cervicale e decapitazione e rapidamente rimuovere i cervelli in prechilled, SACSF ossigenato. </li><li> Utilizzando un microtomo vibrante, fare 300 sezioni di cervello micron nella regione di interesse. </li><li> Se lo si desidera, le fette possono essere ulteriormente sezionati prima del recupero per arricchire di particolari regioni del cervello o di diritto separato e emisferi sinistro da utilizzare come controllo e fette sperimentali, rispettivamente. </li><li> Utilizzando un incendio lucidato pipetta Pasteur, trasferire fette di maglia a fondo le camere fissati in piastre da 24 pozzetti. </li><li> Lasciare le fette di recuperare per 40 min, 31 ° C in ACSF ossigenato, con continui, gentile bubbling. </li></ol> 2. Trattamento farmacologico (se del caso) e Slice biotinilazione <ol><li> Una volta recuperato, lavare fette 3x in preriscaldata (37 ° C), ossigenato ACSF gorgogliamento costantemente con il 95% / 5% O 2 / CO 2. </li><li> Aggiungere composti di prova e incubare con l&#39;ossigenazione continua. <ol><li> Per comodità, aggiungere un secolo volume di 10x farmaco concentrato 1/10, e miscelare capovolgendo delicatamente. </li><li> Agitare delicatamente le piastre in un bagno di acqua alla temperatura desiderata. </li></ol></li><li> Dopo il trattamento farmaco, rapidamentefette freddo di lavaggio 3x in ghiaccio ACSF freddo. </li></ol> 3. Proteine ​​di superficie Biotinylate <ol><li> Preparare 1,0 mg / ml solfo-NHS-SS-biotina in ghiaccio ACSF fredda immediatamente prima dell&#39;etichettatura. </li><li> Aggiungere 0,75 ml sulfo-NHS-SS-biotina a fette e fette di incubare in ghiaccio, 45 min. </li><li> Lavare le fette tre volte velocemente con ghiaccio freddo ACSF, poi incubare per 10 min in ghiaccio ACSF freddo sul ghiaccio. </li><li> Lavare le fette tre volte con ghiaccio freddo tampone fetta quench e incubare con 0,75 ml fetta tampone di tempra due volte, 25 min, sul ghiaccio per placare la connessione solfo-NHS-SS-biotina. </li></ol> 4. Preparare lisati di tessuto <ol><li> Lavare le fette tre volte in ghiaccio ACSF freddo e trasferire ogni fetta in una provetta con una pipetta Pasteur fuoco lucido. </li><li> Pellet delicatamente fetta mediante centrifugazione a 200 xg, 1 min e con attenzione aspirare restante ACSF. </li><li> Aggiungere 400 ml di ghiaccio freddo RIPA / PI e rompere il tessuto pipettando su e giù una volta attraverso un pip P200ette. </li><li> Trasferimento dissociato fetta / RIPA in una nuova provetta e incubare 30 min, 4 ° C, rotazione, per completare lisi. </li><li> Pellet detriti cellulari mediante centrifugazione, 18.000 xg, 15 min, 4 ° C. </li><li> Determinare concentrazioni di proteine ​​lisato usando il saggio proteico BCA, con albumina di siero bovino (BSA) come standard. </li></ol> 5. Isolare Biotinylated Proteine <ol><li> Ottimizzare Bead / totale rapporto proteine. Nota: I singoli livelli di espressione della proteina può variare notevolmente tra le diverse regioni del cervello. A meno che tutte le proteine ​​biotinilato in una data quantità di lisato tissutale è stata ripresa, non è possibile rilevare con precisione i potenziali cambiamenti nell&#39;espressione superficie. Pertanto, è imperativo determinare empiricamente la ottimale tallone / rapporto proteine ​​totali per una particolare regione proteina / cervello prima di intraprendere un nuovo studio fetta biotinylation. <ol><li> Incubare 25 microlitri streptavidina agarosio perline con crescente quantitàs di lisato tissutale (intervallo di 25-200 mg), e poi procedere come descritto di seguito per l&#39;associazione, lavaggio e eluizione passi. </li><li> Quantificare le bande immunoreattive conseguenti e scegliere un rapporto tallone / lisato nel range lineare del legame che permetterà quantificazione accurata di una aumentata o diminuita espressione di superficie proteica. </li></ol></li><li> Preparare Beads streptavidina-agarosio <ol><li> Determinare il volume totale cordone necessario per tutti i campioni. Preparare un volume di cordone sufficiente per tale importo più uno supplementare (cioè 4 campioni a 25 ml / campione = 100 perline microlitri + uno supplementare = 125 perline microlitri. </li><li> Vortex streptavidina tallone stock e pipetta fuori desiderato volume. Se si utilizza una pipetta P200, tagliare l&#39;estremità della punta per evitare il blocco o il tallone danni. </li><li> Lavare perle 3 volte in 0,5-1,0 ml RIPA / PI per rimuovere i conservanti, vortex dopo ogni aggiunta RIPA e la raccolta di perle tra un lavaggio mediante centrifugazione 18.000 xg, 1 min, a temperatura ambiente temperamentoatura. </li><li> Aspirare il tampone tra un lavaggio con una pipetta Pasteur di vetro collegato a un pallone di vuoto. Un P200 punta di plastica attaccato alla fine della pipetta Pasteur di vetro offre un controllo più preciso durante l&#39;aspirazione. Non è necessario rimuovere assolutamente tutto il buffer per i primi due lavaggi, in quanto rischia di perline di aspirazione nella pipetta. Dopo l&#39;ultimo lavaggio, rimuovere quanto più il tampone in eccesso possibile senza aspirare le perline. </li><li> Aggiungi RIPA / PI per portare perle al loro volume originario, pipettare su e giù per risospendere. Evitare vortex, a questo punto, come perle si attaccano alla parete del tubo. </li><li> Perline aliquote in provette da microcentrifuga utilizzando un P200 con la punta tagliata. Pipetta su e giù parecchie volte tra il campionamento per assicurare perle rimangono uniformemente sospese e disperse tra i tubi. </li></ol></li><li> Proteine ​​biotinilate legarsi a streptavidina perline <ol><li> Distribuire lisati cellulari ai tubi contenenti le perline agarosio. Per gli esperimenti whe<html> re più campioni vengono confrontati, assicurarsi di utilizzare la stessa quantità di proteine ​​per ogni campione per confronti accurati. </li><li> Aggiungere ulteriori RIPA / PI per portare a campioni ad un volume di 200 microlitri minimo. Questo assicura che i campioni si mescoleranno in modo adeguato durante l&#39;incubazione e anche unifica le concentrazioni di proteine ​​di tutti i campioni. </li><li> Porre i tubi in un rotatore provetta e miscelare notte a 4 ° C. </li><li> In tubi separati, dispensare un equivalente del volume totale lisato utilizzato per ogni campione. In alternativa, se i volumi di campione sono alti, una frazione del volume totale lisato può essere riservato invece, per accogliere volumi carico massimo su gel SDS-PAGE. Questi saranno utilizzati per normalizzare l&#39;espressione di superficie alla quantità totale di proteine. </li><li> Aggiungere sia un uguale volume di 2x o 1/5 volume di 6x tampone campione SDS-PAGE e sia incubare a 4 ° C, in parallelo con i campioni di perline o conservare a -20 ° C fino vengono analizzati campioni. </li></ol></li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Elute e analizzare campioni <ol><li> Pellet perline mediante centrifugazione 18.000 xg, 2 min, a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare il surnatante e lavare perline tre volte con 0,75 ml RIPA. Per ridurre al minimo la perdita di tallone, lasciare un piccolo volume di testa di tampone sopra perline tra i lavaggi. Dopo l&#39;ultimo lavaggio, rimuovere il più RIPA possibile, senza disturbare il pellet tallone. </li><li> Eluire le proteine ​​biotinilate da perline streptavidina riducendo il legame disolfuro. Aggiungere 25 microlitri 2x SDS-PAGE riduzione tampone del campione, vortice bene e ruotare campioni di 30 minuti, a temperatura ambiente. Nota: Molte proteine ​​di membrana hanno una forte tendenza ad aggregarsi quando bollito in tampone campione SDS-PAGE, gravemente compromettere la loro mobilità elettroforetica. Se questo è il caso per la proteina indagato, evitare riscaldamento dei campioni e, invece, eluire lentamente a temperatura ambiente. Se bollente è assolutamente necessario (ad esempio, se un&#39;altra proteina valutati in parallelo richiede bollente), sample buffer può essere completato con 2 M urea (concentrazione finale) per ridurre al minimo l&#39;aggregazione. Mentre efficace nel ridurre l&#39;aggregazione in alcuni casi, urea compromette spesso apparenze banda. </li><li> Analizzare i campioni immunoblot. </li><li> Scongelare campioni totali lisato e ruotare in parallelo con i campioni del branello, 30 min, temperatura ambiente. </li><li> Proteine ​​separate su gel SDS-PAGE. </li><li> Identificare proteine ​​(s) di interesse mediante immunoblotting. <ol><li> Essere certi che le bande vengono rilevati nell&#39;intervallo lineare di rilevamento per una corretta quantificazione. </li><li> Per assicurare che il reagente biotinilazione non ha avuto accesso alle proteine ​​intracellulari via le cellule danneggiate / compromessi. Questo si realizza meglio mediante immunoblotting in parallelo per una proteina intracellulare specifiche per il tipo di cellule in fase di studio. </li><li> Quantificare densità band e calcolare la proteina relativa densità di superficie come percentuale del livello di espressione della proteina totale. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno interessi economici in conflitto con questo lavoro.

Nonostante la conoscenza di lunga data che il traffico endocytic criticamente l&#39;impatto segnalazione sinaptica nel cervello, si è dimostrato impegnativo per misurare quantitativamente cambiamenti nell&#39;espressione superficie della proteina nei neuroni adulti. In questo lavoro, riportiamo un metodo affidabile per etichettare proteina di superficie ex vivo in fettine cerebrali acute. Preparazioni fetta cervello hanno una lunga storia di utilità per le registrazioni elettrofisiologiche, in quanto mantengono...

Traffico endocitico è un meccanismo cellulare ubiquitario che perfeziona la presentazione membrana plasmatica di una varietà di proteine ​​integrali di membrana. Endocitosi fornisce nutrienti vitali per l&#39;ambiente intracellulare 1 e desensibilizza segnalazione dei recettori in risposta all&#39;attivazione del recettore 2. Riciclo indietro alla membrana plasmatica endocitosi può inoltre migliorare segnalazione cellulare aumentando i livelli di espressione della proteina sulla superficie cellulare 3. Inoltre, perturbazioni traffico di membrana sono implicati in numerose malattie e condizioni patologiche 4,5, sottolineando la necessità di studiare i meccanismi molecolari che governano la proteina traffico endocitico. Mentre molte proteine ​​utilizzano meccanismi di internalizzazione classici clatrina-dipendente, prova di montaggio nel corso degli ultimi anni dimostra che più i meccanismi di endocitosi clatrina-indipendente governano il potenziale endocitica di una serie crescente diproteine ​​6,7. Quindi, la necessità di indagare i meccanismi endocitiche agevolare il traffico nei sistemi pertinenti fisiologici è cresciuta notevolmente. Nel cervello, il traffico endocitico dei recettori, canali ionici e trasportatori di neurotrasmettitori ha un ruolo primario nella creazione di plasticità sinaptica 8-11 e risposta ai farmaci d&#39;abuso 12-15, in ultima analisi, un impatto eccitabilità neuronale e risposte sinaptiche. Ad oggi la maggior parte degli studi di traffico neuronali contare su entrambi i sistemi di espressione eterologa o neuroni primari in coltura, nessuno dei quali può riflettere in maniera affidabile i meccanismi in gioco in neuroni adulti. Qui riportiamo un approccio che utilizza biotinilazione superficie per misurare quantitativamente i livelli di proteina di superficie in fettine cerebrali acute derivanti da roditori adulti. Usando questo approccio, presentiamo i dati che dimostrano che il topo striato trasportatore della dopamina interiorizza rapidamente in rerisposta a forbolo estere mediata proteina chinasi C (PKC) attivazione.

<table><tbody><tr><td>sulfo NHS-SS-biotina</td><td>Pierce</td><td>21331</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina agarosio</td><td>Pierce</td><td>20347</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina senza IgG, senza proteasi</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Separatore di microtomo vibrante</td><td>vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua agitante</td><td>vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inserti a fondo di rete Millicell (8 & micro; </td><td>Millipore</td><td>PI8P 012 50</td><td>Questi possono essere lavati a mano e riutilizzati</td></tr></tbody></table>

slice cervello biotinilazione: an<em&gt; ex vivo</em&gt; approccio alla misura regione-specifica proteina tratta plasma membrana in neuroni adulti

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Traffico endocytic regolamentata è il meccanismo centrale facilitando una serie di eventi neuromodulatori, controllando dinamicamente recettore, canale ionico, e la cella presentazione superficie trasportatore su una scala minuti di tempo. C&#39;è una vasta diversità di meccanismi che controllano il traffico endocitico delle singole proteine. Gli studi che indagano le basi molecolari del traffico hanno fatto affidamento principalmente sulla biotinilazione superficie per misurare quantitativamente cambiamenti nell&#39;espressione superficiale proteina di membrana in risposta a stimoli esogeni e la manipolazione genetica. Tuttavia, questo approccio è stato limitato principalmente alle cellule coltivate, che potrebbero non riflettere fedelmente i meccanismi fisiologicamente rilevanti in gioco in neuroni adulti. Inoltre, gli approcci di cellule in coltura possono sottovalutare le differenze regionali specifici meccanismi di traffico. Qui, descriviamo un approccio che si estende biotinylation superficie cellulare per la preparazione fetta acuta cervello. Noidimostrano che questo metodo fornisce un approccio ad alta fedeltà per misurare rapidi cambiamenti nei livelli superficiali delle proteine ​​di membrana in neuroni adulti. Questo approccio rischia di avere un ampio programma di utilità nel campo del traffico endocytic neuronale.

Il trasportatore della dopamina neuronale è internalizzato in risposta all&#39;attivazione PKC in linee cellulari 16-20. Nonostante le molte relazioni che dimostrino la PKC-indotte perdite di superficie DAT in una varietà di linee cellulari e sistemi di espressione, è stato impegnativo per confermare questo dato nei neuroni dopaminergici in coltura 21-23. Abbiamo usato fettine striatali mouse per testare direttamente se DAT interiorizza in risposta all&#39;attivazione PKC nei neuroni dopaminergici ...

Traffico di membrana neuronale controlla dinamicamente la membrana plasmatica disponibilità di proteine ​​e gli impatti in modo significativo la neurotrasmissione. Ad oggi, è stato impegnativo per misurare neuronale traffico endocitico in neuroni adulti. Qui, descriviamo un metodo quantitativo altamente efficace per misurare rapidi cambiamenti nell&#39;espressione della proteina superficie ex vivo in fettine cerebrali acute.

Slice Cervello biotinilazione: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approccio alla Misura Regione-specifica proteina Tratta plasma membrana in neuroni adulti

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è quantificare i cambiamenti acuti nei proteine di superficie neuronali. In preparati di fette cerebrali ex vivo, ciò si ottiene preparando innanzitutto fette cerebrali acute vitali. Successivamente, le fette vengono trattate con farmaci di interesse.Successivamente, le proteine della superficie cellulare vengono marcate utilizzando reagenti per la biotinilazione impermeabili alla membrana. Infine, le proteine biotinilate di superficie vengono isolate mediante cromatografia a affinità con streptavidina. In ultima analisi, il saggio immunoistochimico viene utilizzato per quantificare le variazioni nell'espressione proteica di superficie in seguito a trattamenti farmacologici.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'espressione cellulare, è che il traffico delle proteine neuronali viene esaminato in situ piuttosto che in sistemi di espressione eterologa o in colture primarie di neuroni. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo avrà difficoltà nel preparare sezioni cerebrali vitali. Per preparare le sezioni cerebrali, iniziare preparando una soluzione fresca di fluido cerebrospina

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Endocitosi regolata regola i livelli di superficie cellulare espressione della maggior parte delle proteine ​​di membrana. Qui utilizziamo riducibili, reagenti biotinilazione impermeant membrana per misurare la velocità endocitico del trasportatore della dopamina (DAT), una proteina di membrana politopica. Il metodo favorisce un approccio diretto per misurare il tasso endocitico della maggior parte delle proteine ​​di membrana plasmatica.

Misurazione delle proteine ​​plasmatiche Tariffe endocitico membrana da biotinilazione reversibile

Questo rapporto descrive l'uso di imaging cellulare dal vivo e le tecniche di fotosbiancante per determinare l'espressione di superficie, vie di trasporto e la cinetica di traffico esogeno espresso, sensibile al pH GFP-tagged proteine ​​a livello della membrana plasmatica dei neuroni.

Diffusione laterale e esocitosi delle proteine ​​di membrana in neuroni in coltura valutata utilizzando Recovery fluorescenza e fluorescenza-loss photobleaching

Descriviamo un metodo per etichettare proteina sulla superficie dei neuroni viventi utilizzando un anticorpo policlonale specifico per epitopi extracellulari. Proteina legata per l'anticorpo sulla superficie cellulare e successivamente internalizzato tramite endocitosi può essere distinta dalla proteina rimanente, o trafficate, la superficie durante l'incubazione.

Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine ​​dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni

Forniamo un protocollo dettagliato per l'induzione del potenziamento a lungo termine nella regione CA1 dell'ippocampo e il successivo isolamento di frazioni arricchite nucleari dalla zona tetanized della fetta. Questo approccio può essere utilizzato per determinare l'attività dipendente di importazione proteina nucleare in modelli cellulari di apprendimento e memoria.

Isolamento di CA1 nucleari arricchiti Frazioni di fettine di ippocampo per studiare l&#39;attività-dipendente nucleare Importazione di Messenger proteine ​​Synapto-nucleari

Il trasporto assonale di BDNF, un fattore neurotrofico, è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione di diverse popolazioni neuronali. Alcune malattie degenerative sono contrassegnate dalla rottura della struttura e funzione assonale. Abbiamo dimostrato le tecniche utilizzate per esaminare il traffico in tempo reale di QD-BDNF in camere di microfluidica con neuroni primari.

In tempo reale Imaging del trasporto assonale di Quantum Dot-etichettato BDNF in neuroni primari

Le tecniche di microscopia ottica abbinate a saggi biochimici chiariscono il coinvolgimento dell'esocitosi mediata da SNARE nella ramificazione degli assoni netrina-dipendente. Questa combinazione di tecniche consente l'identificazione dei meccanismi molecolari che controllano la ramificazione degli assoni e il cambiamento della forma cellulare.

Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi

Qui presentiamo un protocollo di frazionamento della membrana cerebrale che rappresenta una procedura robusta per isolare le proteine ​​appartenenti a diversi compartimenti sinaptici.

Frazione di membrana del cervello: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approccio per valutare la localizzazione della proteina subsynaptica

Due metodi basati sulla biotinilazione, progettati per determinare l'espressione della superficie cellulare e la percentuale endocitica di proteine ​​espressi alla membrana plasmatica, sono presentati in questa relazione.

Determinazione dell&#39;espressione della superficie cellulare e della velocità endocitica delle proteine ​​nelle colture primarie di astrociti usando la biotinilazione

Questo articolo presenta un metodo per studiare il recettore del glutammato (GluR) nel traffico di cellule ippocampali primarie dissociate. Utilizzando un approccio anticorpale-alimentazione per etichettare i recettori endogeni o sovraespressi in combinazione con approcci farmacologici, questo metodo consente l'identificazione di meccanismi molecolari che regolano l'espressione della superficie di GluR modulando processi di internalizzazione o riciclaggio.

Un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico di recettori del glutammato nelle culture ippocampali primarie dissociate

Questo metodo introduce una semplice tecnica per il rilevamento del rilascio endogeno di monoammina utilizzando fette di cervello acute. La configurazione utilizza una piastra a 48 pozzetti contenente un supporto in tessuto per il rilascio di monoammina. La monoammina rilasciata viene analizzata mediante HPLC accoppiato con il rilevamento elettrochimico. Inoltre, questa tecnica fornisce un metodo di screening per la scoperta di farmaci.

Un test basato su piastre per la misurazione del rilascio di monoamina endogena in fette cerebrali acute

Questo protocollo dimostra un metodo semplice e robusto per studiare la crescita degli assoni in situ e la dinamica dei coni di crescita. Descrive come preparare ex vivo fette di cervello acuto fisiologicamente rilevanti e fornisce una pipeline di analisi di facile utilizzo.

Sul posto Visualizzazione delle dinamiche dei coni di crescita e crescita degli assoni in colture di fette di cervello embrionali ex vivo acute

Scopri come quantificare i cambiamenti acuti delle proteine di superficie neuronali in fette cerebrali ex vivo. Questo metodo utilizza biotinilazione e cromatografia di affinità per analizzare il traffico proteico nella membrana plasmatica.

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