Generazione di Myospheres Da hESCs di epigenetica Riprogrammazione

L'obiettivo generale di questa procedura è generare sfere di miosferiche. Strutture simili all'EB composte da cellule muscolari scheletriche provenienti da cellule staminali embrionali umane. Ciò si ottiene riprogrammando le cellule mediante infezione lentivirale di Baf 60 C.Il secondo passo della procedura consiste nell'infettare le stesse cellule con un secondo virus, il lentivirus myo D.

Le cellule infette vengono quindi indotte a formare aggregati simili a EB per cinque giorni in terreno di coltura a base di siero. Quindi il terreno EB viene sostituito con un terreno di differenziazione privo di siero e gli aggregati vengono coltivati per altre due settimane in sfere miosferiche. In definitiva, l'immunofluorescenza viene utilizzata per visualizzare sezioni di aggregati inclusi in OCT.

Il vantaggio principale di questa tecnica è la degenerazione ad alta resa delle cellule muscolari scheletriche che, allo stesso modo, derivano da progenitori mesenchimali o mesodermici, non richiedono lo smistamento dei fatti ed è quindi compatibile con un sistema di coltura tridimensionale. Il giorno prima dell'infezione alle cellule staminali embrionali umane in piastre a sei pozzetti, aggiungere il clonaggio di cellule staminali embrionali umane e il supplemento di recupero al terreno a 1000 x per una concentrazione finale di due micromolari il successivo giorno infettare le cellule staminali embrionali umane con un bagno ad alto titolo 60 CGFP lentivirus. Per prima cosa dissociare un pozzetto di cellule in una singola sospensione cellulare aggiungendo un millilitro di trippa e incubando la piastra per cinque minuti. Quindi raccogliere e trasferire la sospensione in un tubo da 15 millilitri.

Aggiungere nove millilitri del terreno preparato e far girare le cellule a 1.200 giri/min per cinque minuti in attesa di un millilitro di mt. Aggiungere il poly brain a sei microgrammi per millilitro di concentrazione finale e l'integratore per il recupero delle cellule staminali embrionali umane a due micromolari.

Quindi risospendere le cellule in questa soluzione e trasferirle in un singolo pozzetto di una piastra di attacco bassa a sei pozzetti. Ora aggiungete il virus concentrato del bagno 60 C ad una molteplicità di infezioni di 100 milioni. Incubare la piastra per tre ore con il virus.

Quindi raccogliere le cellule e dividerle in due pozzetti a piastre rivestiti di matrigel. A ciascuna piastra, aggiungere due millilitri di mt, SIR, uno con due supplementi micromolari, quindi incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, sostituire il supporto con un nuovo supporto.

Le cellule sembreranno essersi già raggruppate dopo 48 ore dall'inizio dell'infezione. Controllare la fluorescenza per valutare l'efficienza dell'infezione. Continuare i cambiamenti quotidiani del terreno fino a quando le cellule sono all'80% di confluenza, quindi dissociare le cellule e il virus myo D alle cellule utilizzando lo stesso protocollo.

Mantenere le cellule infette con cambi giornalieri del terreno fino a raggiungere l'80% di confluenza il giorno prima di questo punto di crescita. Piastra MES su piastre rivestite di matrigel a 1000 cellule per centimetro quadrato per far passare le cellule infette alla piastra ME'S. Il giorno dopo.

Utilizzare trip ALI per dissociarli e trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri alle cellule. Aggiungere nove millilitri di terreno di cellule staminali embrionali umane e centrifugarle. Aggiungere 1.200 giri/min per cinque minuti.

Sospendere nuovamente le cellule pellettate in un terreno di coltura di cellule staminali embrionali umane di sei millilitri freschi. Ora rimuovi il terreno da due piastre di mes e aggiungi le cellule infette. Incubare le cellule per diversi giorni.

Una volta, aggiungi l'80% di confluenza. Rimuovere tutto il terreno e aggiungere un millilitro di collagenasi quattro. Aggiungere un milligrammo per millilitro dopo cinque minuti in collagenasi a 37 gradi Celsius.

Sostituire la collagenasi con un millilitro di terreno di cellule staminali embrionali umane. Quindi, al microscopio da dissezione, raschiare le colonie con un puntale per pipetta da 10 millilitri, trasferire le colonie in una provetta da 15 millilitri e lasciarle depositare. Dopo tre minuti, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule nel terreno delle cellule staminali embrionali umane.

Quindi piastra le cellule con un rapporto di uno a quattro con le piastre di metanfetamina. Le cellule infette devono essere in numero elevato e aver formato colonie di buona qualità per questa procedura. Rimuovere il terreno da ogni pozzetto e aggiungere un millilitro di collagenasi. Quattro.

Aggiungere una concentrazione di un milligrammo per millilitro come prima e la reazione della collagenasi dopo cinque minuti sostituendola con un mezzo EB. E poi usa rapidamente un microscopio per raschiare le colonie. Utilizzando un puntale per pipetta da 10 millilitri, è possibile dissociare le cellule in piccoli grumi cellulari.

Raccogli questi aggregati in una provetta da 15 millilitri e, dopo che si sono depositati per circa tre minuti, rimuovi il surnatante, risospendi le cellule in tre millilitri di terreno EB e trasferisci il tutto in un singolo pozzetto di una piastra di attacco a sei pozzetti. Incubare questa piastra per una notte il giorno successivo. Controllali per grandi pezzi di colonia.

Se ne vengono trovati. Rompili facendoli passare alcune volte in una pipetta da cinque millilitri. Se ci sono molte celle singole galleggianti, raccogliere gli aggregati per sedimentazione e sostituirli con terreno EB fresco.

Sostituire il terreno a giorni alterni dopo cinque giorni di coltivazione. Raccogliere gli aggregati cellulari e lavarli una volta con due millilitri di PBS, lasciando che le cellule sedimentino in condizioni di gravità normale. Quindi sostituire il PBS con tre millilitri di terreno DM e riportare le cellule negli stessi pozzetti della piastra nei successivi 15 giorni di coltura.

Sostituire il mezzo ogni tre giorni. Durante questo periodo, si formeranno le mesosfere. Le cellule staminali embrionali umane sono state infettate con un bagno 60 C che trasporta fluorescenza GFP.

Dopo 72 ore, le celle sono state ordinate per i fatti. Le cellule che esprimono BAF 60 C sono state coltivate a circa il 75% di fluenza di co e quindi infettate con il lentivirus myo D. L'espressione genica esogena è stata rilevata nelle cellule infette mediante PCR quantitativa in tempo reale.

È stata esaminata l'espressione e la distribuzione a livello proteico. Successivamente la GFP corrisponde all'espressione di baf 60 C ed è stato utilizzato un anticorpo myo D per verificare l'espressione di myo D. 15 giorni dopo che le cellule staminali embrionali umane hanno iniziato a formare aggregati simili a EB.

Una parte delle sfere di mios è stata incorporata nel composto OCT e sezionata la sezione è risultata positiva per i marcatori a catena miogenica e a catena pesante della miosina. A partire dal decimo giorno, è stato possibile osservare una contrazione sporadica nelle sfere del mio. Alcune sfere di myos assumevano forme diverse o insolite, forse a causa della fusione tra le sfere di myos.

Questa tecnica farà progredire la ricerca nel campo della modellazione e della terapia delle malattie perché le miosfere possono essere generate da cellule staminali pluripotenti di pazienti affetti da diverse malattie muscolari. Per questo motivo, le miosfere forniscono un modello di malattia in edizione adatto per la pulizia dei farmaci e la patogenesi della malattia.