Generazione di Myospheres Da hESCs di epigenetica Riprogrammazione
21 giugno 2014
Qui, descriviamo un protocollo basato su riprogrammazione epigenetica di cellule staminali embrionali umane (hESCs) verso generare una popolazione omogenea di progenitori muscolari scheletriche che in condizioni di coltura permissive formano cluster tridimensionali delle miofibre contrattili (myospheres), che ricapitolano caratteristiche biologiche umana muscoli scheletrici.
L'obiettivo generale di questa procedura è generare sfere miogeniche, strutture simili a corpi embrionali composte da cellule muscolari scheletriche derivate da cellule staminali embrionali umane. Questo risultato si ottiene riprogrammando le cellule mediante infezione lentivirale con Baf60C. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'infectare le stesse cellule con un secondo virus, il lentivirus MyoD.
Le cellule infette vengono quindi indotte a formare aggregati simili a corpi embrionali (EB) per cinque giorni in un mezzo di coltura a base di siero. Successivamente, il mezzo per EB viene sostituito con un mezzo di differenziamento privo di siero e gli aggregati vengono coltivati per altre due settimane fino a formare miosfere. Infine, l'immunofluorescenza viene utilizzata per visualizzare sezioni di aggregati inclusi in OCT.
Il principale vantaggio di questa tecnica è l'elevata resa di differenziazione in cellule del muscolo scheletrico, che, a differenza della derivazione da progenitori mesenchimali o mesodermici, non richiede il sorting mediante fattori ed è pertanto compatibile con un sistema di coltura tridimensionale. Il giorno precedente l'infezione, aggiungere alle cellule staminali embrionali umane in piastre a sei pozzetti il supplemento per il clonaggio e il recupero delle cellule staminali embrionali umane al mezzo di coltura in un rapporto di 1000 x per una concentrazione finale di due micromolar. Il giorno successivo, infettare le cellule staminali embrionali umane con un lentivirus CGFP bath 60 ad alto titolo. Dissociare innanzitutto un pozzetto di cellule in una sospensione monocellulare aggiungendo un millilitro di tripe e incubando la piastra per cinque minuti. Successivamente, raccogliere e trasferire la sospensione in una provetta da 15 millilitri.
Aggiungere nove millilitri del mezzo preparato e centrifugare le cellule a 1.200 giri al minuto per cinque minuti, in attesa di un millilitro di mt. SIR, uno. Aggiungere polibrene a una concentrazione finale di sei microgrammi per millilitro e il supplemento per il recupero delle cellule staminali embrionali umane a due micromolari.
Quindi risospendere le cellule in questa soluzione e trasferirle in un singolo pozzetto di una piastra a sei pozzetti con superficie non aderente. Aggiungere ora il virus bath 60 C concentrato a una multiplicità di infezione di 100 milioni. Incubare la piastra per tre ore con il virus.
Quindi raccogliere le cellule e dividerle in due pozzetti di piastra rivestiti con matrigel. Ad ogni piastra aggiungere due millilitri di mt, SIR, uno con un supplemento di due micromolare, quindi incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, sostituire il mezzo con mezzo fresco.
Le cellule appariranno già raggruppate dopo 48 ore dall'inizio dell'infezione. Verificare la fluorescenza per valutare l'efficienza dell'infezione. Continuare a sostituire il mezzo ogni giorno fino a quando le cellule non raggiungono una confluenza dell'80%, quindi dissociare le cellule e aggiungere il virus myo D alle cellule utilizzando lo stesso protocollo.
Mantenere le cellule infette con cambi giornalieri di mezzo fino a quando non raggiungono l'80% di confluenza il giorno precedente questo punto di crescita. Piastrare le MES su piastre rivestite con matrigel a 1000 cellule per centimetro quadrato per passare le cellule infette nella piastra ME'S. Il giorno successivo.
Utilizzare trip ALI per dissociarli e trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri. Aggiungere nove millilitri di mezzo per cellule staminali embrionali umane e centrifugare. Aggiungere 1.200 giri al minuto per cinque minuti.
Risospendere le cellule pellettizzate in sei millilitri freschi di mezzo per cellule staminali embrionali umane. Rimuovere ora il mezzo da due piastre di mes e aggiungere loro le cellule infette. Incubare le cellule per diversi giorni.
Una volta raggiunta l'80% di confluenza, rimuovere tutto il mezzo e aggiungere un millilitro di collagenasi IV. Aggiungere un milligrammo per millilitro dopo cinque minuti di incubazione con la collagenasi a 37 gradi Celsius.
Sostituire la collagenasi con un millilitro di mezzo per cellule staminali embrionali umane. Quindi, sotto un microscopio stereoscopico, staccare le colonie utilizzando una punta per pipetta da 10 millilitri, trasferire le colonie in un tubo da 15 millilitri e lasciarle sedimentare. Dopo tre minuti, rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule nel mezzo per cellule staminali embrionali umane.
Quindi si seminano le cellule in un rapporto da uno a quattro su piastre con metionina. Per questa procedura, le cellule infette devono essere presenti in numero elevato e devono aver formato colonie di buona qualità. Si rimuove il mezzo da ogni pozzetto e si aggiunge un millilitro di collagenasi.Four.
Aggiungere una concentrazione di un milligrammo per millilitro come in precedenza, quindi interrompere la reazione della collagenasi dopo cinque minuti sostituendola con mezzo EB. Successivamente, utilizzare rapidamente un microscopio per staccare le colonie. Utilizzando una punta per pipetta da 10 millilitri, è possibile dissociare le cellule in piccoli aggregati cellulari.
Raccogliere questi aggregati in un tubo da 15 millilitri e, dopo averli lasciati sedimentare per circa tre minuti, rimuovere il soprannatante, risospendere le cellule in tre millilitri di mezzo EB e trasferire il tutto in un singolo pozzetto di una piastra a sei pozzetti con superficie non aderente. Incubare la piastra durante la notte il giorno successivo. Verificare la presenza di grossi frammenti di colonie.
Se presenti, frammentarli facendoli passare alcune volte attraverso una pipetta da cinque millilitri. Se sono presenti molte cellule singole in sospensione, raccogliere gli aggregati mediante sedimentazione e sostituire con mezzo EB fresco.
Sostituire il mezzo ogni due giorni a partire dal quinto giorno di coltura. Raccogliere gli aggregati cellulari e lavarli una volta con due millilitri di PBS, lasciando sedimentare le cellule sotto la forza di gravità normale. Quindi sostituire il PBS con tre millilitri di mezzo DM e reinserire le cellule negli stessi pozzetti della piastra per i successivi 15 giorni di coltura.
Sostituire il mezzo ogni tre giorni. In questo periodo, si formeranno le mesosfere. Le cellule staminali embrionali umane sono state infettate con bath 60 C portante fluorescenza GFP.
Dopo 72 ore, le cellule sono state sottoposte a sorting mediante FACS. Le cellule che esprimevano BAF60C sono state coltivate fino a raggiungere una confluenza di circa il 75% e successivamente infettate con lentivirus MyoD. L'espressione del gene esogeno è stata rilevata nelle cellule infette mediante PCR quantitativa in tempo reale.
L'espressione e la distribuzione a livello proteico sono state esaminate. Il GFP successivo corrisponde all'espressione di baf 60 C, e un anticorpo anti-myo D è stato utilizzato per verificare l'espressione di myo D. 15 giorni dopo che le cellule staminali embrionali umane hanno iniziato a formare aggregati simili a corpi embrionari (EB).
Una porzione delle sfere miotiche è stata inclusa in composto OCT e sezionata; la sezione ha mostrato una colorazione positiva per i marcatori miogenici e della catena pesante della miosina. A partire dal giorno 10, è stato possibile osservare contrazioni sporadiche nelle sfere miotiche. Alcune sfere miotiche hanno assunto forme diverse o insolite, forse a causa della fusione tra sfere miotiche.
Questa tecnica farà progredire la ricerca nel campo della modellizzazione delle malattie e della terapia, poiché le sferoidi miogeniche possono essere generate a partire da cellule staminali pluripotenti di pazienti affetti da diverse patologie muscolari. Per questo motivo, le sferoidi miogeniche forniscono un modello di malattia in vitro adatto alla selezione di farmaci e allo studio della patogenesi delle malattie.
Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo per la riprogrammazione epigenetica di cellule staminali embrionali umane (hESCs) al fine di generare progenitori del muscolo scheletrico. In condizioni di coltura specifiche, questi progenitori formano aggregati tridimensionali di miotubi contrattili, noti come miosfere, che riproducono le caratteristiche biologiche dei muscoli scheletrici umani.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia delle cellule staminali
- Rigenerazione muscolare
Sfondo
- Le cellule staminali embrionali umane (hESCs) possono differenziarsi in vari tipi cellulari.
- Le tecniche di riprogrammazione possono aumentare il rendimento di specifiche cellule progenitrici.
- Le miosfere forniscono un modello per lo studio dello sviluppo e della funzione muscolare.
- Le tecniche di immunofluorescenza sono utilizzate per visualizzare le strutture cellulari.
Scopo dello studio
- Stabilire un metodo affidabile per generare progenitori del muscolo scheletrico da cellule staminali embrionali umane (hESC).
- Creare miosfere che replicano le proprietà del muscolo scheletrico umano.
- Facilitare ulteriori ricerche sulla biologia muscolare e su potenziali applicazioni terapeutiche.
Metodi Utilizzati
- Infezione lentivirale di hESC con Baf 60 C e Myo D.
- Formazione di aggregati simili a corpi embrionidi in mezzo di coltura a base di siero.
- Passaggio a mezzo di differenziamento senza siero per lo sviluppo di miosfere.
- Colorazione mediante immunofluorescenza per valutare i marcatori miogenici.
Risultati principali
- Generazione con successo di miosfere da cellule staminali embrionali umane (hESCs).
- Espressione dimostrata di marcatori miogenici nelle cellule differenziate.
- Elevata resa di cellule del muscolo scheletrico senza necessità di ordinamento mediante FACS.
- Le miosfere hanno mostrato proprietà contrattili simili a quelle del muscolo scheletrico umano.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo efficiente per generare progenitori muscolari.
- Le miosfere possono rappresentare uno strumento prezioso per lo studio della biologia muscolare.
- Questo approccio potrebbe avere implicazioni per la medicina rigenerativa e la riparazione muscolare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente la generazione scalabile di progenitori muscolari scheletrici omogenei da cellule staminali embrionali umane (hESC), affrontando i principali colli di bottiglia nella modellizzazione delle malattie neuromuscolari e nello sviluppo della terapia cellulare. Producento miosfere contrattili senza il ricorso al sorting mediante FACS, supporta una validazione predittiva con riduzione del rischio per l'identificazione di target e di composti promettenti nei programmi di scoperta legati al muscolo. L'approccio migliora la continuità traslazionale dalla fase iniziale di scoperta fino alla valutazione preclinica, fornendo un sistema tridimensionale rilevante per la malattia, adatto allo screening meccanicistico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche in una popolazione omogenea di cellule del muscolo scheletrico derivate da cellule staminali pluripotenti.
- Valore operativo: Riduce l'ambiguità meccanicistica fornendo un sistema definito e riprogrammabile per la validazione funzionale delle target.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio attraverso la generazione ad alto rendimento e riproducibile di miosfere contrattili che riproducono la biologia del muscolo scheletrico umano.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce sistemi biologici validati adatti per lo screening di composti in un formato tridimensionale.
- Valore operativo: Permette la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso il riprogrammamento lentivirale e condizioni di differenziamento definite.
- Scalabilità: Supporta il riutilizzo della piattaforma e la prontezza per lo screening mediante aggregazione in piastre a bassa adesione e maturazione in assenza di siero.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Genera miosfere da hESC derivati da pazienti per modellare disturbi neuromuscolari e sostenere studi sulla patogenesi.
- Continuità traslazionale: Collega la fase di scoperta alla validazione preclinica mantenendo l'espressione dei marcatori miogenici e la funzione contrattile durante colture prolungate.
- Avanzamento basato sul rischio: Orienta le decisioni di proseguimento o interruzione attraverso la maturazione strutturale e funzionale quantificabile delle miosfere.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione fino alla modellizzazione preclinica, consentendo un passaggio fluido tra i team di biologia e di screening.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante riprogrammazione indotta con BAF60C e MyoD.
- Screening: Fornisce uscite quantitative pronte per i saggi attraverso la valutazione basata sull'immunofluorescenza dei marcatori miogenici e della contrattilità.
- Analisi: Offre letture misurabili, inclusa l'espressione dei marcatori, la formazione strutturale e l'insorgenza sporadica della contrazione, per l'analisi comparativa delle condizioni.
- Ricerca Translazionale: Si collega alla continuità preclinica mediante la formazione di sferoidi rilevanti per la malattia a partire da hESC geneticamente corrispondenti.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma di differenziazione riutilizzabile, applicabile a diversi bersagli neuromuscolari e contesti genetici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie alla riduzione dell'eterogeneità cellulare e al miglioramento della purezza miogenica.
- Valore operativo: Standardizzazione e scalabilità mediante riprogrammazione lentivirale e transizioni definite di mezzi, eliminando i passaggi di selezione cellulare.
- Valore strategico: Maggiore efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico nello sviluppo avanzato grazie a una fedeltà fenotipica precoce.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione basata sul rischio dei programmi mirati al tessuto muscolare, fondata sulla formazione e funzionalità riproducibili dei mioloidi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nelle tecniche di trasduzione lentivirale e di coltura delle cellule staminali.
- Dipende dall'accesso a vettori lentivirali BAF60C e MyoD ad alto titolo e a materiali per colture in condizioni di non adesione.
- Necessita di formulazioni standardizzate dei mezzi di coltura e di protocolli di differenziamento sincronizzati tra i diversi gruppi di lavoro.
- L'adattamento a sistemi modello alternativi potrebbe richiedere un'ottimizzazione della dose e dei tempi di espressione dei fattori di riprogrammazione.
- I limiti pratici includono la variabilità nella formazione degli aggregati e la dipendenza da cambi tempestivi del mezzo per la maturazione.
