Name: Adattamento del semiautomatico circolanti (CTC) Saggi Tumor Cell per applicazioni cliniche e di ricerca preclinica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Scopri il rilevamento e la caratterizzazione delle cellule tumorali circolanti (CTC) in campioni di sangue umano e murino utilizzando il sistema CellSearch. Questo metodo supporta la selezione di terapie mirate in oncologia.

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Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti dell&#39;Istituto Ontario di Ricerca sul Cancro (# 08NOV230), la Fondazione canadese per l&#39;innovazione (# 13199), Cancro alla prostata Canada, Janssen Oncologia, il Cancer Program Regionale di Londra, e il sostegno dei donatori da Giovanni e Donna Bristol attraverso il London Health Sciences Foundation (a ALA). LEL è supportato da un Frederick Banting e Charles Best Canada Graduate Scholarship Award di dottorato. ALA è supportato da un CIHR New Investigator Award e un ricercatore Award anticipata dal Ministero della Ricerca e Innovazione Ontario.

Tutti gli studi umani descritti in questo manoscritto sono state effettuate secondo protocolli approvati da Research umano Comitato Etico della Western University. Tutti sono stati condotti studi su animali in conformità con le raccomandazioni del Consiglio canadese per la cura degli animali, secondo protocolli approvati dalla Western University uso di animali sottocommissione. 1. Standard CTC Enumeration da paziente campioni di sangue Utilizzo del CSS 1. Sangue umano Raccolta dei campioni e preparazione per la trasformazione in strumento di preparazione <ol><li> Utilizzando tecniche salasso standard di asepsi, disegnare un minimo di 8,0 ml di sangue umano in una provetta CellSave 10 ml (di seguito denominato il tubo conservanti CTC), che contiene etilene acido diaminetetraacetic (EDTA) e un conservante cellulare proprietaria. Invertire le 5x tubo per impedire la coagulazione del sangue. I campioni possono essere trattati immediatamente o conservate a temperatura ambiente per un massimo di 96 ore. </li><li> Removreagenti e CSS dal frigo e lasciare che raggiungano la temperatura ambiente prima dell&#39;uso. </li><li> Usando una pipetta monouso 10 ml e pipetta automatizzata, raccogliere 7,5 ml di sangue dal tubo conservante CTC e lentamente dispensare il sangue in un tubo preparazione trasformazione strumento adeguatamente etichettati. </li><li> Aggiungere 6,5 ml di tampone di diluizione per ogni campione. Miscelare capovolgendo campione 5x. Campione centrifugare a 800 xg per 10 min con il freno in posizione &quot;off&quot;. Seguire le istruzioni sullo schermo sullo strumento di preparazione per caricare tutti i campioni dei pazienti nel sistema per l&#39;elaborazione. I campioni devono essere trattati entro 1 ora di preparazione. </li></ol> 2. Preparazione di controllo per la trasformazione in strumento di preparazione <ol><li> Vortice delicatamente il flacone di controllo e capovolgere 5x per mescolare. </li><li> Rimuovere con cautela il tappo dal flacone di controllo e inserire una preparazione tubo di elaborazione dello strumento capovolta sulla parte superiore del flaconcino scoperchiato. In un movimento rapido, invertire lacontrollare la fiala e versare il contenuto nel tubo di elaborazione. Mentre rovesciata, sfiora delicatamente i lati del flacone di controllo per rilasciare eventuali contenuti residui. </li><li> Rimuovere con attenzione il flacone di controllo invertita dal tubo di elaborazione, assicurando che nessun liquido si perde e mettere da parte. Usando una pipetta di 1.000 ml, raccogliere tutti i restanti contenuti della fiala e coperchio e pipettare delicatamente nel tubo di elaborazione. </li><li> Seguire le istruzioni sullo schermo sullo strumento di preparazione per caricare il controllo sul sistema per l&#39;elaborazione. </li></ol> 3. Scansione del campione sullo strumento di analisi <ol><li> Seguire le istruzioni sullo schermo sullo strumento di preparazione per scaricare tutti i campioni dal sistema. Cap Liberamente ogni cartuccia dispositivo magnetico e toccare il dispositivo magnetico con le mani o banco di laboratorio per liberare eventuali bolle che sono bloccati ai bordi della cartuccia. Una volta che tutte le bolle sono state rimosse, tappare bene la cartuccia, stesi il dispositivo magnetico piatto, e honcubate al buio per almeno 20 minuti a temperatura ambiente. I campioni devono essere analizzati entro 24 ore di preparazione. </li><li> Accendere l&#39;analizzatore e inizializzare la lampada. Una volta riscaldato (~ 15 min), caricare la cartuccia verifica del sistema sullo strumento di analisi e selezionare la scheda di test QC. Seguire le istruzioni sullo schermo per eseguire le necessarie misure di controllo di qualità. </li><li> Caricare un campione sullo strumento di analisi e selezionare la scheda test del paziente. Verrà visualizzato tutte le informazioni salvate dallo strumento di preparazione. Fare clic su Start per inizializzare la scansione del campione. Il sistema esegue un fuoco grossolana e rilevamento dei bordi sulla cartuccia dispositivo magnetico. </li><li> Regolare tutti i bordi se necessario utilizzando i tasti direzionali. Selezionare Accetta. Il sistema effettuerà un bel fuoco e avviare la scansione del campione. </li><li> Dopo il controllo la scansione dei risultati deve essere convalidato utilizzando i criteri definiti per le celle a spillo ad alta (CK + DAPI + CD45 - APC +) e bassa (CK + DAPI + CD45 - FITC +) concentrazioni. A seguito di campione del paziente scansione dei risultati dovrebbe essere riesaminata per CTC catturati utilizzando i criteri definiti CTC (CK + DAPI + CD45 -). </li></ol> 2. CTC Caratterizzazione di marcatori definiti dall&#39;utente utilizzando il CSS 1. Preparazione di marcatori definiti dall&#39;utente e strumento inizializzazione <ol><li> Diluire l&#39;anticorpo di interesse utilizzando legame primario diluente alla concentrazione desiderata in una tazza reagente marcatore utilizzando la seguente formula, in cui la concentrazione di lavoro è la concentrazione dell&#39;anticorpo dopo l&#39;aggiunta al campione e la concentrazione di calcio è la concentrazione di anticorpo nel Coppa del reagente. Per i più campioni, regolare i volumi di anticorpi, come descritto nella tabella 1. Posizionare la tazza reagente marcatore nella posizione 1 nella cartuccia reagenti e load la cartuccia su CSS. Archivio Concentrazione = (concentrazione di lavoro x 850 microlitri) / 150 ml </li><li> Raccogliere il sangue, preparare i campioni, e caricare lo strumento di preparazione come descritto nel precedente standard CTC Enumeration da paziente campioni di sangue usando il protocollo CSS. Per attivare marcatore Inoltre personalizzato, selezionare Definito dall&#39;utente Assay quando richiesto dallo strumento di preparazione. Immettere il nome del marcatore e selezionare Salva. Come i campioni vengono caricati sullo strumento, l&#39;operatore verrà richiesto di indicare quale dovrebbe ricevere marcatore personalizzato selezionando Sì o No, se necessario. </li></ol> 2. Esempio di scansione di marcatori definiti dall&#39;utente sullo strumento di analisi <ol><li> Accendere lo strumento di analisi, inizializzare la lampada, ed eseguire il controllo di qualità e verifica del sistema, come descritto nella Sezione 3.2 del CTC Enumeration standard da paziente campioni di sangue usando il CSS </strong&gt; protocollo. </li><li> Caricare un campione sullo strumento di analisi e selezionare la scheda Impostazione. Per inizializzare il canale FITC, selezionare CellSearch CTC come ID Kit nella sezione Test di protocolli. Da questo menu, selezionare CTC ricerca, fare clic sul pulsante Modifica e impostare il tempo di esposizione, se lo desideri. Si raccomanda un tempo di esposizione di 1.0 sec non superare quando si utilizza il kit CSS CTC come questo può aumentare sanguinare-through in altri canali fluorescenti utilizzati per l&#39;identificazione CTC. </li></ol> 3. Adattamento del CSSProtocol standard per l&#39;uso in modelli preclinici mouse ** Adattato da Veridex Mouse / Rat CellCapture Kit (non più disponibile in commercio) 1. Raccolta di sangue Mouse e bagagli <ol><li> Prima della raccolta del sangue, corrono ~ 30 ml di 0,5 M EDTA avanti e indietro attraverso un ago G 22, lasciando una piccola quantità di EDTA nel mozzo. </li><li>Raccogliere un minimo di 50 ml di sangue del mouse da topi precedentemente iniettate cellule tumorali umane attraverso vie ortotopici, coda vena, o intracardiaci. Raccogliere il sangue dalla vena safena (per l&#39;analisi seriale CTC) o mediante puntura cardiaca (per terminale analisi CTC). Rimuovere l&#39;ago e distribuire il sangue in una provetta con EDTA Microtainer raccolta del sangue 1 ml. Miscelare per inversione o il tubo dolcemente flick per prevenire la coagulazione del sangue. Il sangue può essere elaborato immediatamente o conservato a temperatura ambiente fino a 48 ore dopo l&#39;aggiunta di un volume uguale di CytoChex conservante cellulare. </li></ol> 2. CTC arricchimento <ol><li> Rimuovere i reagenti CSS dal frigorifero e lasciare che raggiungano la temperatura ambiente prima dell&#39;uso. </li><li> Trasferire l&#39;equivalente di 50 ml di sangue intero per un flusso x 75 mm 12 millimetri citometria tubo. Aggiungere 500 microlitri di tampone di diluizione per ogni campione, lavando giù qualsiasi sangue che rimane sui lati del tubo. Se necessario, una breve centrifuga centrifugapuò essere utilizzato per raccogliere il sangue residuo. </li><li> Vortice delicatamente il ferrofluido anti-EpCAM e aggiungere 25 microlitri di ciascun campione posizionando la punta della pipetta direttamente nel campione. Aggiungere 25 ml di reagente Valorizzazione Capture e vortice delicatamente per mescolare. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Mettere provette nel magnete e incubare per 10 min. Mentre provette sono ancora nel magnete, utilizzare una pipetta di vetro per aspirare accuratamente il liquido residuo senza toccare la parete del tubo vicino al magnete e scartare. </li></ol> 3. CTC colorazione <ol><li> Rimuovere le provette dal magnete e risospendere in 50 ml di acidi nucleici Dye, 50 ml di colorazione reagente, 1,5 ml di anti-topo CD45-APC, 5.0 ml di anti-umano HLA-Alexa Fluor 488, e 100 ml di Permeabilization reagente. Per campioni multipli, questi reagenti possono essere premiscelati e 206,5 ml di miscela possono essere aggiunti in ogni provetta. Vortex delicatamente per miscelaree incubare per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Aggiungere 500 ml di tampone di diluizione, vortice delicatamente, provette posto nel magnete, e incubare per 10 min. Mentre provette sono ancora nel magnete, utilizzare una pipetta di vetro per aspirare accuratamente il liquido residuo senza toccare la parete del tubo vicino al magnete e scartare. Rimuovere le provette dal magnete e risospendere in 350 ml di tampone di diluizione. Vortex delicatamente per mescolare. </li></ol> 4. Magnetic Carica <ol><li> Utilizzando una punta di caricamento del gel, trasferire accuratamente l&#39;intero volume dal tubo campione in una cartuccia nel dispositivo magnetico. Inizia nella parte inferiore della cartuccia e ritirare lentamente la punta come il campione viene erogato. </li><li> Una volta che l&#39;intero campione è stato trasferito, tappare bloccare la cartuccia dispositivo magnetico e toccare il dispositivo magnetico con le mani o banco di laboratorio per liberare eventuali bolle che sono bloccati ai bordi della cartuccia come descritto nella Section 3.1 del CTC Enumeration standard da paziente campioni di sangue usando il CSS. </li><li> Pop eventuali bolle utilizzando una sterile 22 ago G intrappolando tra lo smusso e il bordo della cartuccia. Una volta che tutte le bolle sono stati rimossi, ricoprire con fermezza la cartuccia, porre il dispositivo magnetico piatto, e incubare al buio per almeno 10 min. I campioni devono essere analizzati entro 24 ore di preparazione. </li></ol> 5. Scansione dei campioni separati manualmente sullo strumento di analisi <ol><li> Accendere lo strumento di analisi, inizializzare la lampada, ed eseguire il controllo di qualità e verifica del sistema, come descritto nella Sezione 3.2 del CTC Enumeration standard da paziente campioni di sangue utilizzando il protocollo CSS. </li><li> Caricare il campione attraverso lo strumento di analisi e selezionare la scheda Impostazione. Cancellare tutti i dati esistenti sul tasto dati del dispositivo magnetico facendo clic sul pulsante Formato Sample. Attivare il canale di FITCnd impostare il tempo di esposizione di 1.0 sec come descritto nella Sezione 2.2 della CTC Caratterizzazione di marcatori definiti dall&#39;utente utilizzando il CSS. </li><li> Fare clic sulla scheda Test Paziente e selezionare Modifica per inserire le informazioni sul campione. Selezionare CellSearch CTC come ID Kit e CTC ricerca come protocollo di test. Inserire il restante informazioni necessarie come indicato come l&#39;asterisco. Salvare le informazioni campione e fare clic su Avvia. </li></ol>

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L&#39;autore (ALA) ha ricevuto un finanziamento che è stato fornito da Janssen Oncologia, la cui casa madre Johnson &amp; Johnson detiene inoltre Janssen Diagnostics LLC, che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Nonostante lo sviluppo di molte nuove tecnologie CTC dopo l&#39;introduzione del CSS nel 2004, questa tecnica è ancora l&#39;unica tecnologia clinicamente approvato oggi sul mercato e, pertanto, è considerato il gold standard attuale per la rilevazione CTC e l&#39;enumerazione. Questo manoscritto ha dimostrato che, sebbene il CSS ha standard rigoroso controllo di qualità può essere soggetto a bias di interpretazione e che l&#39;identificazione CTC nei campioni dei pazienti è molto diverso da identificazione in campioni ...

Nel 2013 si stima che 580.350 persone muoiono di cancro e che i 1.660.290 nuovi casi di questa malattia viene diagnosticata in solo 1 negli Stati Uniti. La maggior parte di questi decessi si verifica in seguito allo sviluppo della malattia metastatica 2. L&#39;attuale mancanza di terapie efficaci nel trattamento di metastasi e di una comprensione limitata della cascata metastatica rende questo stadio della malattia altamente letale. La presenza di cellule tumorali circolanti (CTC) nel sangue sono stati dimostrati correlati con malattia metastatica 3. Queste cellule sono estremamente rari e la loro individuazione è indicativa di sopravvivenza globale in seno metastatico 4, 5 prostata e del colon-retto 6 cancro. In questi pazienti, la presenza di ≥ 5 (seno e prostata) o ≥ 3 (colon-retto) CTC in 7,5 ml di sangue è indice di prognosi peggiore rispetto ai pazienti con meno o nessun CTC rilevabili nelle samil volume e il sangue. Inoltre, la variazione del numero CTC durante o dopo l&#39;intervento terapeutico è stato dimostrato per essere utile come predittore di risposta al trattamento, spesso prima di tecniche attualmente utilizzate 7-10. È stato stimato che, in pazienti tumorali metastatiche, CTC verificano ad una frequenza di circa 1 a 10 CTC 5 -10 7 cellule mononucleate del sangue e in pazienti con malattia localizzata, questa frequenza può essere anche inferiore (~ 1 in 10 8). La natura rara di queste cellule può rendere difficile accurato e affidabile rilevare e analizzare CTC 11. Diversi metodi (recensito in precedenza 12-14) sono state utilizzate per arricchire e rilevare queste cellule sfruttando le proprietà che li differenziano dai circostante componenti del sangue. In generale, CTC enumerazione è un processo a due fasi che richiede sia una fase di arricchimento e una fase di rivelazione. Tradizionalmente, passaggi di arricchimento si basano su differenze di educazione fisicaProprietà iCal di CTC (dimensioni delle cellule, la densità, deformabilità) o sull&#39;espressione proteina marker (cioè di adesione delle cellule epiteliali molecola [EpCAM], citocheratina [CK]). Seguendo arricchimento, rilevazione CTC può essere eseguita in vari modi diversi, il più comune dei quali sono saggi a base di acido nucleico e / o approcci citometria. Ognuna di queste strategie sono uniche, avendo vantaggi e svantaggi, ma tutti mancano normalizzazione; una necessità per l&#39;ingresso in ambito clinico. Il sistema CellSearch (CSS) è stato quindi sviluppato per fornire un metodo standardizzato per il rilevamento e l&#39;enumerazione di rari CTC nel sangue umano usando la microscopia a fluorescenza e le tecniche di base di anticorpi 4-6. Questa piattaforma è attualmente considerato il gold standard nella CTC enumerazione ed è l&#39;unica tecnica approvato dalla US Food and Drug Administration (FDA) per l&#39;uso in clinica 15. Il CSS è una piattaforma a due COMPOSTE componentig, (1) il sistema CellTracks AutoPrep (di seguito denominato come strumento di preparazione), che automatizza la preparazione dei campioni di sangue umano, e (2) la CellTracks Analyzer II (di seguito indicato come strumento di analisi), che analizza questi campioni dopo la preparazione. Per distinguere CTC di contaminare leucociti strumento di preparazione impiega un anticorpo mediata, approccio separazione magnetica a base di ferrofluido-differenziale e la colorazione in fluorescenza. Inizialmente, il sistema etichette CTC utilizzando anticorpi anti-EpCAM coniugati a nanoparticelle di ferro. Il campione viene quindi incubato in un campo magnetico, e tutte le cellule non marcate vengono aspirati. Cellule tumorali selezionate vengono risospese e incubate in una macchia fluorescenza differenziale, costituito anticorpi di fluorescenza marcata e un reagente colorazione nucleare. Infine, il campione viene trasferito in una cartuccia magnetica, chiamato MagNest (di seguito denominato il dispositivo magnetico), e scanned usando lo strumento di analisi. Lo strumento di analisi è utilizzato per la scansione di campioni preparati usando diversi filtri di fluorescenza, ciascuno ottimizzato alla particella fluorescente appropriato, utilizzando una lente obiettivo 10X. CTC sono identificati come cellule che sono vincolati da anti-EpCAM, anti-pan-CK-ficoeritrina (PE) (CK8, 18, e 19), e la macchia nucleare 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Al contrario, leucociti contaminanti vengono identificati come cellule che sono vincolati da anti-CD45-allophycocyanin (APC) e DAPI. Seguendo la scansione, potenziali cellule tumorali informatici definiti vengono presentati all&#39;utente. Da queste immagini, l&#39;utente deve impiegare analisi qualitativa utilizzando i parametri definiti e colorazione differenziale discussi sopra per determinare quali eventi sono CTC. Oltre a fornire un metodo standardizzato per CTC enumerazione, il CSS permette per la caratterizzazione molecolare delle CTC sulla base di marcatori proteici di interesse. Questo interrogatorio cun essere effettuata a livello di singola cellula, utilizzando un isotiocianato di fluoresceina (FITC) canale di fluorescenza non richiesto per l&#39;identificazione CTC 16. Sebbene questa piattaforma fornisce la capacità di caratterizzazione molecolare, il processo dettagliato di protocollo di sviluppo e ottimizzazione non è ben definito. Tre marcatori disponibili in commercio sono stati sviluppati dal costruttore per l&#39;utilizzo con il CSS, compreso il fattore di crescita epidermico (EGFR), fattore di crescita epidermico umano del recettore 2 (HER2), e insulin-like growth factor 1 recettore (IGF-1R). Analisi HER2, in combinazione con il CSS, è stato utilizzato da diversi gruppi per illustrare il potenziale per la caratterizzazione CTC informare decisionale clinico e cambiare potenzialmente linee guida di trattamento esistenti. Ad esempio, Fehm et al. 17 dimostrato che circa un terzo dei pazienti con carcinoma mammario con tumori HER2-primario aveva HER2 + CTC. Inoltre, Liu et al.18 recentemente riportato che fino al 50% dei pazienti con HER + carcinoma mammario metastatico non ha avuto HER2 + CTC. Herceptin, un recettore HER2 interferire anticorpo monoclonale dimostrato di trarre enormi benefici pazienti i cui tumori esprimono sufficienti livelli di HER2, è un trattamento comunemente utilizzati per i pazienti con HER2 + tumori primari 19-21. Tuttavia, questi studi suggeriscono che Herceptin può essere essendo sub-ottimale utilizzati e che la caratterizzazione CTC può essere di aiuto nel predire la risposta al trattamento. In ultima analisi, caratterizzazione CTC può avere il potenziale per migliorare la cura personalizzata. La ricerca CTC è unico in quanto ha in gran parte utilizzato un approccio capezzale a banco. Questo metodo, a differenza di banco-to-capezzale di ricerca, che spesso può richiedere anni per urtare la cura del paziente, ha permesso CTC rapida entrata in ambito clinico. Tuttavia, i medici sono riluttanti a utilizzare i risultati dell&#39;analisi CTC nel trattamento dei pazienti dei processi decisionalizione a causa di una mancanza di comprensione della loro biologia sottostante. Pertanto appropriati modelli preclinici murini di tecniche di metastasi e complementari analisi CTC devono essere utilizzati al fine di indagare su queste questioni in sospeso. In generale, esistono due tipi di modelli preclinici utilizzati per studiare la cascata metastatica, (1) modelli metastasi spontanea, che permettono lo studio di tutti i passaggi della cascata metastatica, e (2) modelli metastasi sperimentali, che consentono soltanto lo studio delle successive fasi del processo metastatico come stravaso e formazione del tumore secondario 22. Modelli metastasi spontanee, coinvolgono iniezioni di cellule tumorali in opportune sedi ortotopico (ad esempio iniezione di cellule tumorali della prostata nella prostata per lo studio del cancro alla prostata). Le cellule sono poi dato tempo per formare tumori primari e spontaneamente metastatizzare siti secondari come l&#39;osso, polmone e linfonodi. Incontrasto, modelli metastasi sperimentali implicano l&#39;iniezione diretta di cellule tumorali nel sangue (ad esempio via vena caudale o iniezione intracardiaca per indirizzare le cellule a posizioni specifiche) e quindi saltare le fasi iniziali di intravasation e diffusione di organi secondari 22. Finora la maggior parte delle analisi CTC in in vivo sistemi modello è stato eseguito utilizzando sia basato citometria-23 o adattate tecniche CTC basato umane (ad es AdnaTest) 24. Anche se utile, nessuna di queste tecniche riflette adeguatamente CTC censimento utilizzando il CSS gold standard. Sulla base del riconoscimento clinico, natura standardizzata, e l&#39;utilizzo diffuso di CSS, lo sviluppo di una cattura e rilevazione tecnica CTC in vivo modellazione che utilizza preparazione del campione equivalente, elaborazione e criteri di identificazione sarebbe vantaggiosa risultati sarebbero paragonabili a quelli ottenuti da campioni di pazienti. Tuttavia, a causa del volume di requirements dello strumento preparazione non è possibile realizzare piccoli volumi di sangue usando questa piattaforma automatizzata. . Inoltre, il lavoro precedente di Eliane et al 25 ha dimostrato che la contaminazione dei campioni con le cellule epiteliali del mouse (che soddisfano anche la definizione standard CTC [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) può portare ad errori di classificazione delle cellule epiteliali squamose del mouse come CTC. Per affrontare questi problemi una tecnica adattata che permette l&#39;utilizzo del kit reagenti CSS CTC unita ad una procedura di isolamento manuale è stato sviluppato. L&#39;aggiunta di un FITC marcato antigene leucocitario umano (HLA) anticorpo per il saggio permette alle cellule tumorali umane di distinguerli da cellule epiteliali squamose mouse. Questo manoscritto descrive lo standard, sviluppata commercialmente e il protocollo CSS ottimizzato per la lavorazione di campioni di sangue e le insidie ​​più comuni che si possono riscontrare, tra cui discrepanzeelementi t che possono portare ad errori di classificazione CTC. Inoltre, la personalizzazione del dosaggio CSS esaminare caratteristiche proteiche definite dall&#39;utente CTC catturate e una tecnica analoga CSS adattato che permette l&#39;arricchimento e rilevamento delle CTC da piccoli volumi di sangue in modelli preclinici murini di metastasi sono descritti.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano CD44-FITC</td><td>BD Pharmigen</td><td>555478</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano CD44-PE</td><td>BD Pharmigen</td><td>555479</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano HLA-Alexa Fluor 488</td><td>BioLegend</td><td>311415</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo CD45-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Bond Diluente per anticorpi primari</td><td>Leica</td><td>AR9352</td><td></td></tr><tr><td>CellSave Provette di conservazione</td><td>Veridex</td><td>952820 (confezione da 20) 79100005 (confezione da 100)</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch Kit di controllo CTC</td><td>Veridex</td><td>7900003</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch CTC Kit</td><td>Veridex</td><td>7900001</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch CXC Kit di controllo</td><td>Veridex</td><td>7900018RUO</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch CXC Kit</td><td>Veridex</td><td>7900017RUO</td><td></td></tr><tr><td>Strumento tampone</td><td>Veridex</td><td>7901003</td><td></td></tr><tr><td>Streck Conservante cellulare (noto anche come CytoChex)</td><td>Streck</td><td>213350</td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td><td></td><td></td><td></td>da 1 ml</tr><tr><td>10 ml Pipetta</td><td></td><td></td><td></td>sierologica</tr><tr><td>1.000 &; l Pipetta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 & micro; l Puntali</td><td></td><td></td><td></td>per pipette</tr><tr><td>12 mm x 75 mm Provette</td><td></td><td></td><td></td>di flusso</tr><tr><td>200 & micro; l Punte</td><td></td><td></td><td></td>di caricamento del gel</tr><tr><td>200 & micro; l Pipetta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 G Ago</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 in Pipetta Pasteur monouso</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta</td><td></td><td></td><td></td>sierologica da 5 ml</tr><tr><td>Pipettatore</td><td></td><td></td><td></td>automatizzato</tr><tr><td>Tubo per la raccolta del sangue capillare (EDTA)</td><td>BD Microtainer</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch Analyzer II</td><td>Veridex</td><td>9555</td><td>Include magneti e cartucce di verifica</td></tr><tr><td>Sistema CellSearch AutoPrep</td><td>Veridex</td><td>9541</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagCellect Magnet&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>MAG997</td><td></td></tr><tr><td>Lampadina in lattice piccola</td><td>VWR</td><td>82024-550</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

adattamento del semiautomatico circolanti (ctc) saggi tumor cell per applicazioni cliniche e di ricerca preclinica

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

La maggioranza dei decessi per cancro si verifica in seguito allo sviluppo della malattia metastatica. Questa fase malattia altamente letale è associata con la presenza di cellule tumorali circolanti (CTC). Queste cellule rare hanno dimostrato di essere clinicamente significativa in seno metastatico, della prostata e del colon-retto. Il gold standard attuale in clinica rilevazione CTC ed enumerazione è il sistema CellSearch approvato dalla FDA (CSS). Questo manoscritto descrive il protocollo standard utilizzato da questa piattaforma nonché due protocolli adattati aggiuntive che descrivono il processo dettagliato di ottimizzazione marcatore definito dall&#39;utente per la caratterizzazione di proteine ​​CTC paziente e un protocollo paragonabile per la cattura CTC molto bassi volumi di sangue, utilizzando lo standard reagenti CSS, per lo studio in vivo modelli preclinici murini di metastasi. Inoltre, differenze di qualità tra CTC sangue donatore sano addizionati con cellule di coltura tissutale rispetto paziente samp sangueles sono evidenziati. Infine, diversi oggetti comunemente discrepanti che possono portare ad errori di classificazione CTC sono delineati. Presi insieme, questi protocolli forniranno una risorsa utile per gli utenti di questa piattaforma interessati alla ricerca preclinica e clinica di pertinenza di metastasi e CTC.

Standard CTC Enumerazione Assay La sensibilità e la specificità del CSS è stata ben documentata in letteratura. Tuttavia, per validare il recupero CTC equivalente a spillo (cellule tumorali della prostata umana 1.000 LNCaP) e campioni di sangue umano unspiked da donatori volontari sani sono stati elaborati sulla CSS utilizzando il protocollo CSSCTC standard. Come previsto, i campioni unspiked erano liberi di CTC, 0.00 ± 0.00%, e il recupero CTC è stata dimostrata essere 86,9 ± 4,71% per i campi...

Cellule tumorali circolanti (CTC) sono prognostico in diversi tumori metastatici. Questo manoscritto descrive il sistema Gold Standard CellSearch (CSS) CTC piattaforma di censimento e mette in evidenza errori di classificazione comuni. Inoltre, due protocolli adattati sono descritti per l&#39;utente definito caratterizzazione marcatore delle CTC e CTC censimento in modelli murini preclinici di metastasi che utilizzano questa tecnologia.

Adattamento del semiautomatico circolanti (CTC) Saggi Tumor Cell per applicazioni cliniche e di ricerca preclinica

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Questo esperimento ha lo scopo di ottenere una rilevazione sensibile, il conteggio e la caratterizzazione delle cellule tumorali circolanti da campioni di sangue di xenotrapi umani e murini. In primo luogo, raccogliere i campioni di sangue da esseri umani e/o modelli murini di cancro ed eseguire una selezione positiva delle cellule EpCAM-positive per arricchire le CTC in un contesto di leucociti contaminanti. Successivamente, mediante colorazione differenziale di CTC e leucociti, identificare e contare le CTC.Eseguire la caratterizzazione molecolare desiderata di queste rare cellule tumorali circolanti in laboratorio per supportare la selezione di terapie mirate per i pazienti oncologici in ambito clinico. I risultati ottenuti utilizzando il sistema Cell Search dimostrano che l'analisi delle CTC può essere efficacemente effettuata sia su campioni di sangue umano che su campioni di sangue di xenotrapianti murini. Lo sviluppo di ulteriori protocolli di caratterizzazione delle CTC definiti dall'utente sul sistema Cell Search potrebbe in definitiva contribuire alla selezione di terapie mirate per i pazienti.Inoltre, saggi CTC comparabili adattati per l'utilizzo in xenotrapianti murini miglioreranno la nostra comprensione della biologia di base di queste cellule. Raccogliere 7,5 millilitri del campione di sangue da un tubo contenente conservante per CTC ed erogarli lentamente in un tubo di elaborazione. Aggiungere 6,5 millilitri di tampone di diluizione a ciascun campione di sangue.Rovesciare cinque volte per mescolare e centrifugare a 800 volte G per 10 minuti. Con l'interruttore in posizione spenta per la preparazione del controllo, vortexare delicatamente il flacone per cinque secondi e rovesciare cinque volte per mescolare. Quindi rimuovere il tappo superiore con un tubo di elaborazione capovolto e, con un unico movimento rapido, trasferire il campione.Battere leggermente i lati del vial di controllo per un trasferimento ottimale del campione. Rimuovere con attenzione il vial di controllo capovolto assicurandosi che nessun liquido venga perso. Raccogliere il contenuto rimanente dal vial e dal coperchio e aggiungerlo delicatamente al tubo di lavorazione.Seguire le istruzioni a schermo sullo strumento di preparazione per caricare tutti i campioni di controllo e dei pazienti sul sistema per l'elaborazione. Seguire le istruzioni a schermo sullo strumento di preparazione per scaricare tutti i campioni dal sistema. Ora chiudere leggermente ogni cartuccia del dispositivo magnetico e battere leggermente per far uscire le bolle dai bordi.Quindi chiudere saldamente il cartuccia, posizionare il dispositivo magnetico in piano e incubare al buio per almeno 20 minuti. Accendere lo strumento di analisi e inizializzare la lampada. Caricare il cartuccia di verifica del sistema sullo strumento di analisi.Selezionare la scheda del test di controllo qualità e seguire le istruzioni a schermo per eseguire le necessarie misure di controllo qualità. Successivamente, caricare un campione sullo strumento di analisi e selezionare la scheda del test del paziente. Fare clic su avvia per iniziare la scansione del campione.Regolare tutti i bordi secondo necessità utilizzando i tasti direzionali. Quindi selezionare accetta. Per preparare marcatori definiti dall'utente, diluire l'anticorpo di interesse con il diluente per anticorpi primari bond. Posizionare il contenitore del reagente marcatore nel primo alloggiamento del caricatore di reagenti e inserire il caricatore nel sistema di ricerca cellulare per abilitare l'aggiunta di marcatori personalizzati.Selezionare il saggio definito dall'utente quando richiesto dallo strumento di preparazione. Inserire il nome del marcatore e selezionare salva. Al termine dell'elaborazione del campione, caricare un campione sullo strumento di analisi e selezionare la scheda di configurazione.Per inizializzare il canale ZI, selezionare la ricerca cellulare CTC come ID del kit nella sezione protocollo del test. Da questo menu, selezionare ricerca CTC. Fare clic sul pulsante modifica e impostare il tempo di esposizione desiderato.Raccogliere almeno 50 microlitri di sangue di topo in un tubo microcentrifuga da un millilitro contenente EDTA e mescolare per inversione per prevenire la coagulazione. Per l'arricchimento delle CTC, trasferire l'equivalente di 50 microlitri di sangue intero in un tubo per citometria a flusso. Aggiungere 500 microlitri di buffer di diluizione a ogni campione.Lavare delicatamente il sangue dalle pareti del tubo, vortexare delicatamente il fluido anti-chem e aggiungere 25 microlitri a ogni campione. Aggiungere inoltre 25 microlitri di reagente di potenziamento della cattura. Vortexare delicatamente i campioni e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.Successivamente, posizionare le provette del campione sul magnete per 10 minuti. Aspirare con attenzione il liquido residuo senza toccare la parete della provetta vicina al magnete e scartarlo, rimuovere le provette del campione dal magnete e aggiungere 50 microlitri di colorante per acidi nucleici. 50 microlitri di reagente di marcatura, 1,5 microlitri di anti-US CD45 APC, 5,0 microlitri di anti-human HLA-DR 488 e 100 microlitri di reagente permeabilizzante; vortexare delicatamente e incubare al buio per 20 minuti.A temperatura ambiente. Aggiungere ora 500 microlitri di buffer di diluizione e vortexare. Posizionare delicatamente le provette del campione sul magnete per 10 minuti.Aspirare con attenzione il liquido residuo e scartarlo. Successivamente, risospendere i pellet in 350 microlitri di tampone di diluizione e vorticare delicatamente per mescolare. Aspirare il campione in una punta per caricamento su gel e trasferirlo nel dispositivo magnetico partendo dalla base della cartuccia ed estraendo lentamente la punta mentre il campione viene dispensato.Dopo aver eliminato le bolle d'aria, utilizzando un ago sterile da 22 gauge, chiudere saldamente la cartuccia, posizionare il dispositivo magnetico in piano e incubare al buio per almeno 10 minuti. Caricare il campione sull'apparecchio di analisi e selezionare la scheda di configurazione. Per cancellare i dati esistenti, fare clic sul pulsante formatta campione.Selezionare CTC per la ricerca cellulare come ID del kit e CTC research come protocollo del test. Da questo menu, assicurarsi che sia stato selezionato il tempo di esposizione appropriato. Selezionare la scheda del test del paziente e quindi selezionare modifica.Per inserire le informazioni del campione, compilare le restanti informazioni necessarie come indicato. Quindi salvare le informazioni del campione e fare clic su inizia per convalidare. Il recupero delle cellule tumorali circolanti, le cellule di cancro alla prostata umane aggiunte artificialmente e i campioni di sangue umano non aggiunti provenienti da donatori sani sono stati processati sul sistema Cell Search utilizzando il protocollo standard Cell Search CTC.Come previsto, i campioni non arricchiti erano privi di cellule tumorali circolanti. Il recupero delle CTC nei campioni arricchiti è stato dell'86,9%. Le immagini della galleria di ricerca cellulare ottenute dai campioni arricchiti sono di qualità ottimale e le CTC sono facilmente distinguibili dalle non CTC. L'identificazione delle CTC risulta leggermente più complessa nei pazienti affetti da cancro, con numerose cellule che appaiono di dimensioni ridotte e meno facilmente distinguibili dalle non CTC.Inoltre, durante la revisione dei campioni del paziente, sei categorie di eventi hanno presentato comunemente elementi discordanti tra gli osservatori. Si tratta di eventi di piccole dimensioni, eventi positivi per ZI, colorazioni deboli per citocheratina o di tipo dappy, immagini pixelate, passaggio indesiderato della citocheratina (bleed through) ed eventi di grandi dimensioni o con risoluzione dpi non sovrapposta. La scelta del kit CTC deve essere presa in considerazione quando si sviluppano marcatori definiti dall'utente utilizzando una linea cellulare nota per dimostrare una positività del 98 4% per i marcatori delle cellule staminali tumorali CD 44.Il kit CTC basato su FCI ha classificato solo il 69,3% dei CTC come positivi per CD44. Tuttavia, utilizzando il kit CX C basato su PE, il 98,8% dei CTC è stato classificato come positivo per CD44. Un'ottimizzazione adeguata di qualsiasi marcatore definito dall'utente richiede una validazione mediante linee cellulari con alta densità di antigene, bassa densità di antigene e negative per il marcatore di interesse, al fine di garantire sensibilità e specificità del saggio. Questo esperimento valuta la sensibilità e la specificità del protocollo adattato di ricerca delle cellule murine.Come previsto, i campioni arricchiti con cellule tumorali circolanti (CTC) erano privi di CTC utilizzando entrambi i saggi e il recupero delle CTC. L'utilizzo del kit murino adattato e del sistema automatico standard ha prodotto immagini comparabili; quelle ottenute mediante il protocollo manuale adattato per mouse non differivano da quelle osservate con la tecnica automatica standard.L'aggiunta di HLA fits E a questo saggio consente di distinguere facilmente le cellule tumorali umane dalle cellule epiteliali squamose murine, dalla diluizione seriale di campioni di sangue murino arricchito e dalla correlazione tra il numero previsto di cellule e il numero di cellule recuperate. Verificare che questa tecnica sia sensibile quanto il protocollo CSS standard per l'isolamento di un basso numero di CTC. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire l'arricchimento automatizzato e manuale di CTC da campioni di sangue xenotrapiantati umani e murini.Inoltre, dovresti avere una comprensione più approfondita dei passaggi necessari per progettare e ottimizzare protocolli di caratterizzazione delle CTC per l'uso in combinazione con il sistema di ricerca cellulare.

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Cellule tumorali circolanti sono isolate dal sangue di pazienti affetti da cancro senza infliggere danni cellulari. Isolamento di cellule tumorali viene eseguita utilizzando una superficie bimolecolare di E-selectina in aggiunta agli anticorpi contro marcatori epiteliali. Un rivestimento nanotubo favorisce espressamente adesione cellulare del cancro con conseguente purezze cattura elevate.

Isolamento rapido di cellule tumorali circolanti da campioni di sangue del paziente

Questo video descrive il test di immunofluorescenza delle cellule tumorali circolanti (CTC), una tecnica per caratterizzare i biomarcatori sulle cellule tumorali circolanti in campioni di pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule. Questo test potrebbe essere utilizzato per monitorare i cambiamenti dinamici del tumore e la risposta immunitaria, che possono riflettere la risposta alla chemioterapia, alle radiazioni e ai possibili trattamenti immunoterapici.

Saggio di immunofluorescenza CTC: una tecnica per caratterizzare le cellule tumorali circolanti

È stato dimostrato che le cellule tumorali circolanti (CTC) svolgono un ruolo importante nelle metastasi tumorali. Qui, viene descritto un metodo per l'isolamento e la propagazione di CTC dal sangue intero di un modello di tumore murino singenico di metastasi da carcinoma epatocellulare (HCC).

Isolamento e propagazione di cellule tumorali circolanti da un mouse cancro modello

Un protocollo di utilizzare un poli (N--ISO propylacrylamide) (PIPAAm) microfiltro rivestito per la cattura e il rilascio efficace thermoresponsive delle cellule tumorali circolanti vitali (CTC) è presentato. Questo metodo permette la cattura di CTC dal sangue dei pazienti e il successivo rilascio di valida CTC per la cultura a valle off-chip, analisi e caratterizzazione.

Cattura e rilascio di vitali circolanti cellule tumorali del sangue

Questo protocollo è quello di recuperare e preparare cellule bersaglio rara da una miscela con cellule non-bersaglio della priorità bassa per la caratterizzazione genetica molecolare a livello di singola cellula. Qualità del DNA è uguale a cellule singole non trattata e permette per cella singola applicazione (entrambi screening basato e analisi mirate).

Amplificazione dell'obiettivo delle cellule pre-arricchimento e intero genoma per singola cella a valle caratterizzazione

Qui, presentiamo un flusso di lavoro integrato per identificare le caratteristiche fenotipiche e molecolari che caratterizzano le cellule tumorali circolanti (CTC). Combiniamo l'immunocolorazione dal vivo e la micromanipolazione robotica di CTC singoli e cluster con tecniche a singola cellula per l'analisi a valle e la valutazione dell'abilità di metastasi-semina.

Micromanipolazione delle cellule tumorali circolanti per l'analisi molecolare a valle e la valutazione del potenziale metastatico

La caratterizzazione delle cellule tumorali circolanti (CTC) è un argomento popolare nella ricerca traslazionale. Questo protocollo descrive un test di immunofluorescenza semi-automatica (IF) per la caratterizzazione PD-L1 e l'enumerazione dei CTC in campioni di pazienti affetti da cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC).

Caratterizzazione semiautomatica PD-L1 ed enumerazione delle cellule tumorali circolanti da pazienti affetti da cancro del polmone a cellule non piccole mediante immunofluorescenza

La coltura di CTC consente una caratterizzazione funzionale più profonda del cancro, attraverso l'analisi dell'espressione di marcatori specifici e la valutazione della resistenza ai farmaci e della capacità di colonizzare il fegato tra le altre possibilità. Nel complesso, la cultura CTC potrebbe essere uno strumento clinico promettente per la medicina personalizzata per migliorare l'esito del paziente.

Linee cellulari tumorali circolanti: uno strumento innovativo per la ricerca fondamentale e traslazionale

Il chip microfluidico clinico è un'importante tecnica di analisi biomedica che semplifica la pre-elaborazione del campione di sangue del paziente clinico e colora immunofluorescentmente le cellule tumorali circolanti (CTC) in situ sul chip, consentendo la rapida rilevazione e identificazione di un singolo CTC.

Piattaforma di chip microfluidici clinici per l'isolamento di cellule tumorali circolanti versatili

Le cellule tumorali circolanti (CTC) sono fondamentali per lo studio della progressione e delle metastasi del cancro. Questo articolo presenta un protocollo integrato ad alta produttività per l'arricchimento di CTC e il sequenziamento di CTC singolo, migliorando l'efficienza di cattura e la purezza delle CTC riducendo al contempo i costi di contaminazione e sequenziamento, facendo progredire la ricerca oncologica di precisione e le applicazioni cliniche.

Tecnologia di selezione delle cellule tumorali circolanti ad alto rendimento e sequenziamento di singole cellule basata sulla microfluidica

Scopri il rilevamento e la caratterizzazione delle cellule tumorali circolanti (CTC) in campioni di sangue umano e murino utilizzando il sistema CellSearch. Questo metodo supporta la selezione di terapie mirate in oncologia.

Adattamento del semiautomatico circolanti (CTC) Saggi Tumor Cell per applicazioni cliniche e di ricerca preclinica

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