Name: Elicoidale Organization of Blood fattore VIII della coagulazione su Lipid nanotubi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Scopri la struttura del fattore VIII della coagulazione su nanotubi lipidici mediante criomicroscopia elettronica. Questo metodo computazionale combina ricostruzione 3D elicoidale e tomografia per analizzare proteine di membrana.

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Questo lavoro è supportato da una concessione nazionale scienziato sviluppo della American Heart Association: 10SDG3500034 e UTMB-BCN start up fondi per SSM. Gli autori riconoscono le strutture Cryo-EM e calcolo scientifico presso il Centro Sealy per la biologia strutturale presso UTMB ( <a href="http://www.scsb.utmb.edu">www.scsb.utmb.edu</a> ), così come Drs. Steve Ludtke e Ed Egelman aiuto con gli algoritmi di ricostruzione elicoidali 2D e 3D.

1. Preparazione del campione <ol><li> Scambio Buffer FVIII umano-BDD 14 e FVIII porcino-BDD 15 contro tampone HBS-Ca (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, 5 mM CaCl 2, pH = 7,4) e si concentrano a 1,2 mg / ml. Mantenere la soluzione proteica a -80 ° C. </li><li> Preparare nanotubi di lipidi (LNT) mescolando galactosylceramide (GC) e la fosfatidilserina (PS) a 1:4 w / w rapporto in cloroformio. Si evapora il cloroformio sotto argon e solubilizzare i lipidi in tampone HBS a 1 mg / ml. Mantenere la soluzione LNT a 4 ° C. </li></ol> 2. Cryo-microscopia elettronica di FVIII-LNT <ol><li> Cryo-EM Preparazione del campione <ol><li> Glow Discharge il 300 mesh Quantifoil R2 / 2 griglie di rame (lato carbonio up) in una miscela di O 2 e H 2 gas per 10 sec a 50 W. </li><li> Mescolare le soluzioni FVIII e LNT in tampone HBS-Ca 1:1 w / w rapporto e incubare per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Applicare una goccia di 2,5 pldi FVIII-LNT campione alla griglia microscopia elettronica idrofilo nel Vitrobot Mark IV camera umidificata (100% di umidità). </li><li> Blot e flash congelare la griglia (una macchia per 3,5 sec, forza tamponare 1) in un liquido C 2 H 6, raffreddato dal liquido N 2 per ottenere il ghiaccio amorfo. </li><li> Conservare griglie in scatole di stoccaggio sotto liquido N 2 (LN2). </li></ol></li><li> Raccolta dati Cryo-EM NOTA: Il JEM2100-LaB6 (2010) è dotato di un sistema operativo TEMCON costituito da un computer collegato al microscopio elettronico, uno schermo con finestre di lettura del sistema di aspirazione, sistema di illuminazione, HT, correnti lente e così via, e due pannelli: sinistra e destra, posizionato su entrambi i lati della colonna. Lo spostamento del fascio X, Y manopole (SHIFT Y, Y SIFT) e il multifunzione (DEF / STIG) manopole sono su entrambi i pannelli. Sul pannello di sinistra è la manopola di illuminazione (brigthness). Sul pannello di destra sono: l&#39;ingrandimento (MAG / CAM LUNGHEZZA) e messa a fuoco (FOCUS) manopole e tre imaging (MAG1, MAG2, LOWMAG) ed una di diffrazione (DIFF) modalità pulsanti. Noi acquistiamo i nostri dati in MAG1 in alpha 2. Le condizioni minime dosi di illuminazione (MDS) necessari per l&#39;acquisizione dati Cryo-EM sono impostati con i tasti da F1 a F6, riga in alto sul pannello di destra. In questo protocollo vengono utilizzate le impostazioni generiche: F1 - alzare / abbassare lo schermo, F2 - modalità SEARCH, F3 - Modalità FOCUS, F4 - modalità FOTO, F5 - MDS OFF / ON e F6 - BEAM BLANK, utilizzato per proteggere il campione dalla radiazione danneggiare deviando il fascio. <ol><li> Posizionare la crio-supporto nel crio-station e riempire il Dewar del titolare e la crio-stazione con LN2. Quando la temperatura raggiunge i -192 ° C, otturatore aperto sulla punta titolare, posto precedentemente congelato griglia di Cryo-EM nel luogo designato e fissarlo con una fascetta anello. </li><li> Inserire il crio-supporto nel microscopio elettronico. Riempire il Dewar del crio-porta e la camera anti-contaminante con LN2. Attendere che il titolare si stabilizzi per 30-60 min. Premere F6 su eaccendere il filamento su. Quando il filamento è saturo, premere F6 spento e aperto di scatto sul supporto per visualizzare la griglia. </li><li> Premere Basso Mag / alpha 1 (fissato a 200X MAG) e individuare le aree con ghiaccio sottile sulla griglia. </li><li> Passare a MAG 1/alpha 2 per impostare dose minima modalità (MDS) e acquisire i dati Cryo-EM a basse dosi di elettroni, senza danneggiare il campione. <ol><li> Premere F2 per impostare la modalità di ricerca. Ingrandimento fissato a 40.000 x. Ingrandisci fascio con la manopola brigtness di minima dose di elettroni ~ 0,04 e - / Å 2 · s. Premere DIFF per passare alla modalità di diffrazione. Impostare la lunghezza telecamera a 120 cm con manopola MAG / CAM LUNGHEZZA. Individuare aree sulla griglia nelle zone prescelte in LOWMAG che hanno nanotubi lipidi nei fori della pellicola di carbonio. </li><li> Premere F4 per impostare la modalità Foto a 40.000 X di ingrandimento e set di illuminazione con la manopola luminosità a dosi di 16-25 e - / A 2 · s. Premere il pulsante Standard Focus per impostare le condizioni di messa a fuoco regolando la Z-heightdel campione con i tasti Z UP / DOWN (pannello di controllo a destra). Impostare defocus tra -1,5 e -2,5 micron. </li><li> Allineare ricerca e la modalità PHOTO disegnando un quadrato nella finestra di visualizzazione in diretta sul monitor della fotocamera digitale in modalità SEARCH corrispondente all&#39;area da acquisire in modalità foto. </li><li> Premere F3 per impostare la modalità di messa a fuoco a 100.000 X di ingrandimento. Concentrarsi illuminazione a coprire il chip CCD (~ 4-5 cm di raggio) e fuori asse per non irradiare la zona per essere ripreso in modalità foto. Regolare defocus a ~ -1.5 e -2.5 micron con la manopola FOCUS e corretto per l&#39;astigmatismo dell&#39;immagine con manopole DEF / STIG. </li></ol></li><li> Selezionare il FVIII-LNT per essere ripreso in modo di ricerca con l&#39;acquisizione di immagini in diretta nella finestra di visualizzazione in diretta sul monitor della fotocamera digitale. Centrare il FVIII-LNT in piazza disegnata sulla finestra Live View. </li><li> Registrare una immagine digitale sulla fotocamera CCD a 52.000 X efficace ingrandimento e 0,5 sec di esposizione passando alla modalità Foto e facendo clic sul nell&#39;acquisireE Pulsante sul monitor della fotocamera digitale al microscopio. Le condizioni di acquisizione dell&#39;immagine sono impostate come il bianco fascio (SERRANDE) aperto solo quando l&#39;immagine viene acquisita in modalità foto. </li><li> Controllare la qualità e la sfocatura dell&#39;immagine acquisita premendo CTRL-F per ottenere un Fast Fourier Transform (FFT). </li></ol></li></ol> 3. Ricostruzione 3D NOTA: Il software di analisi dell&#39;immagine utilizzata per l&#39;analisi 2D e 3D: EMAN2 e IHRSR sono liberamente disponibili. EMAN2 può essere scaricato dal http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. Il software IHRSR può essere ottenuto dal Professor Egelman: egelman@virginia.edu. I filtri IHRSR finali vengono eseguiti sul Texas Advanced Computing centro cluster: http://www.tacc.utexas.edu/ presso l&#39;Università del Texas, Austin. L&#39;algoritmo di ricostruzione 3D mostrato in Figura 1 consiste di due fasi principali: in primo luogo la selezione di un insieme omogeneo di segmenti elicoidali (particelle) con il riferimento gratuito alignme 2Dnt (RFA) algoritmi implementati in EMAN 2, secondo conseguire una ricostruzione 3D basato sui parametri elicoidali e algoritmi retroproiezione incorporati in IHRSR. Il primo passo utilizza i programmi sviluppati per la selezione di insiemi di particelle omogenee per la ricostruzione 3D con SPA singola particella (algoritmi) per cui EMAN2 è stato specificamente sviluppato e distribuito: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Questo passo è stato adattato ai dati Cryo-EM. Il secondo passo si ottiene con l&#39;algoritmo IHRSR, che è specificamente progettato per il tipo di assemblee elicoidale ottenuti con le forme del fattore VIII ricombinante. Questo algoritmo è stato ampiamente documentato nella letteratura scientifica 12. <ol><li> Eseguire l&#39;analisi di immagini 2D con l&#39;EMAN2 scientifico suite di elaborazione delle immagini: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 per selezionare particella omogenea (segmento elicoidale) set per la ricostruzione elicoidale. <ol><li> Selezionare microscopio Cryo-EM con straight e ben organizzato tubi elicoidali con il software della fotocamera digitale e strumenti di visualizzazione. </li><li> Inverti, normalizzare e filtrare per raggi X pixel nella GUI e2workflow.py, ricostruzione particella singola opzione (spr): http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager </li><li> Importare le immagini invertite, normalizzati e X-ray pixel filtrata nella GUI e2helixboxer.py. Selezionare tubi elicoidali FVIII-LNT e segmento a 256 x 256 pixel (2.9 Å / pix) con il 90% di sovrapposizione con: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer </li><li> Valutare il defocus dalle micrografie originali e applicare la funzione di trasferimento di contrasto (CTF) di correzione (solo correzione di fase) per i segmenti elicoidali dagli stessi micrografie con l&#39;opzione e2ctf.py incorporata nel e2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf. </li><li> Genera particelle iniziali (segmenti elicoidali) imposta nella GUI e2workflow.py opzione - SPR: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow. </li><li> Calcolare le medie di classe 2D con l&#39;algoritmo e2refine2d.py applicando riferimento franco classificazione k-medio per selezionare insiemi di dati omogenei con lo stesso diametro e LNT grado di ordine elicoidale (Figura 2), seguendo lo script: &#39;e2refine2d.py - iter = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - path = r2d_001 - Ingresso = INPUT.hdf - NCL = 51 - simcmp = dot - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = dot - classraligncmp = fase - classiter = 2 - classkeep = 0.8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = medio - normproj-classkeepsig &#39;, cambiando il valore NCL conseguenza. <ol><li> Classificare i dati iniziali impostati in &#39;NCL = 151&#39; 150 classi con oltre 8 iterazioni con &#39;classkeep = 0.8&#39;, il che significa che particelle con meno del 80% di somiglianza alla media della classe sono esclusi dalla classe data. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d </li><li> Unisci particelle medie di classecon la diffrazione elicoidale pronunciata in e2display.py per creare set di dati intermedio. </li><li> Classificare i dati intermedi fissati in 50 classi &quot;NCL = 51 &#39;per differenziare le classi con lo stesso diametro e grado di ordine. </li><li> Unisci le particelle dalle classi con lo stesso diametro e grado di ordine in e2display.py per creare il set di dati definitivi per la ricostruzione tridimensionale: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector. </li></ol></li></ol></li><li> Eseguire ricostruzione elicoidale con l&#39;algoritmo iterativo elicoidale reale spazio ricostruzione (IHRSR), come descritto in Egelman 17, 18. <ol><li> Stimare l&#39;aumento, Az (Å) dell&#39;elica FVIII-LNT dal combinato Fourier trasformata di particelle nel set di dati definitivi. </li><li> Definire l&#39;angolo azimutale ΔΦ (º) eseguendo i parametri IHRSR parallelo con una costante Az, aumentando ΔΦ da 576; a 60 ° in incrementi di 5 °. </li><li> Eseguire 100 cicli IHRSR consecutivi per ogni finale set di dati con un cilindro informe come un volume iniziale ed i parametri elicoidali iniziali Az e ΔΦ come definito in 3.2.1. e 3.2.2. </li><li> Controllare i volumi finali di convergenza dei parametri elicoidali e la corrispondenza tra le medie di classe dalla classificazione 2D del set di dati definitivi e le proiezioni della ricostruzione finale IHRSR. </li><li> Imporre simmetria le ricostruzioni 3D finali, corrispondente alla distribuzione unità asimmetrica osservata nei volumi 3D asimmetrici finali: 4 volte per il FVIII umano-LNT e 5 volte per il FVIII porcino-LNT. Eseguire altri 100 cicli di perfezionamento per generare una ricostruzione 3D finale simmetrizzata. </li><li> Calcolare la curva di correlazione Fourier Shell sia per volumi in primo luogo separando i corrispondenti dati impostati in pari e dispari: &#39;e2proc2d.py &lt;infile&gt; &lt;outfile&gt; - split = 2 &#39;. Quindi eseguire 100 IHRSR filtri consecutivi come descritto in 3.2.3. Calcolare il FSC dei volumi 3D creati dai set di dati pari e dispari: &#39;e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc&#39;. </li></ol></li><li> Visualizza e segmento i volumi FVIII-LNT in UCSF chimera. </li><li><ol><li> Aprire i volumi finali dal punto 3.2.5. in UCSF Chimera e impostare il livello di contorno 0.005 nel TOOLS&gt; DATI VOLUME&gt; opzione Volume Viewer. </li><li> In Strumenti&gt; DATI VOLUME&gt; SEGMENTO MAP, selezionare volume in SEGMENTO scheda MAP e fare clic sul segmento segmento del volume. </li><li> I settori del Gruppo corrispondente ad una cella unitaria selezionando con CTRL + MAIUSC e facendo clic gruppo. </li><li> Colora i segmenti da cellule dell&#39;unità e helix con AZIONI&gt; opzione COLOR a sottolineare le caratteristiche strutturali. </li></ol></li></ol> 4. Electron Positron <ol><li> Negativamente Stained Preparazione del campione FVIII-LNT <ol> &lt;li&gt; Preparare i campioni FVIII-LNT come per gli esperimenti di Cryo-EM. </li><li> Glow scarichi griglia di rame ricoperto con carbone 300 mesh (lato carbonio alto) in una miscela di O 2 e H 2 gas per 10 sec a 50 W da per esperimenti Cryo-EM. </li><li> Applicare una goccia di 2,5 microlitri di sospensione FVIII-LNT con 6 nm nanoparticelle di oro colloidale alla griglia, asciugare il liquido in eccesso e macchiare negativamente applicando 5 ul di soluzione 1% acetato di uranile per 2 min. Asciugare il liquido in eccesso e asciugare la griglia. </li></ol></li><li> Raccolta dati Electron Positron <ol><li> Trasferire la griglia nel supporto tilt singolo. </li><li> Trasferire il supporto al microscopio elettronico. </li><li> Raccogliere serie tilt automaticamente con il software SerialEM 19 a 2 ° incrementi su un range angolare di -60 ° a +60 ° e registrare le immagini con una telecamera CCD a 52.000 X di ingrandimento efficace, -6 a -10 micron sfocatura e la dose di elettroni di 150 - 170 electrons / A 2 · s per tomogram. </li></ol></li><li> Electron Positron Ricostruzione di FVIII-LNT Nota: Ricostruire la serie inclinata pFVIII-LNT e hFVIII-LNT acquisita in 4.2. con l&#39;opzione ETomo del software MDI seguendo il tutorial: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html <ol><li> Utilizzando una finestra di terminale, aprire il tomogramma in 3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html. </li><li> Bin tomogramma dal 4 con il IMOD BINVOL comando per ridurre le dimensioni del tomogramma. </li><li> Selezionare la corretta angolazione per ruotare il nanotubo lipidico lungo l&#39;asse Y nel tomogramma categorizzata utilizzando il comando IMOD ROTATEVOL. </li><li> Ruotare la piena tomogramma con il comando IMOD ROTATEVOL. </li><li> Ritagliare il nanotubo lipidico selezionato orientato lungo l&#39;asse Y con il comando IMOD CLIP RIDIMENSIONAMENTO. </li><li> Aprire il ritagliata sub-tomogram con 3DMOD. </li><li> Clicca sul tomogramma per visualizzare la disposizione delle molecole di Fattore VIII lungole fette in Z e lungo l&#39;asse Y nel volume sub-tomogram. </li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario in competizione e possono essere contattati direttamente per quanto riguarda le procedure pubblicate in questo manoscritto.

In questo lavoro viene presentato un metodo per distinguere tra due organizzazioni membrana di proteine ​​altamente omologhe: FVIII umano e suino auto-assemblati su nanotubi lipidi nelle condizioni che si verificano nel corpo umano. Nella procedura descritta, FVIII umano e suino sono organizzati con successo elicoidalmente su nanotubi lipidi, che è la fase più critica. Il prossimo passo fondamentale è quello di preservare il campione in ghiaccio sottile amorfo da ...

Coagulazione del sangue Fattore VIII (FVIII) è un grande glicoproteina di 2332 aminoacidi organizzati in sei settori: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. Su trombina attivazione FVIII agisce come cofattore di Fattore IXa all&#39;interno del complesso tenasi legato alla membrana. Il legame di FVIII attivato (FVIIIa) per FIXa in maniera membrana seconda migliora FIXa efficienza proteolitica più di 10 5 volte, che è fondamentale per un efficiente coagulazione del sangue 4. Nonostante il ruolo importante FVIII svolge nella coagulazione e la formazione del complesso tenasi, la struttura FVIII legato alla membrana funzionale è ancora da risolvere. Per risolvere questo problema, nanotubi doppio strato lipidico (LNT) ricche in fosfatidilserina (PS), in grado di legarsi con alta affinità FVIII 8, 9 e assomiglia alla superficie delle piastrine attivate sono state sviluppate 10. Organizzazione elicoidale consecutivo di FVIII legato a LNT ha dimostrato di essere efficave per la determinazione della struttura di FVIII stato legato alla membrana da Cryo-EM 5. Funzionalizzati LNT sono un sistema ideale per studiare proteina-proteina e proteina-membrana di proteine ​​di membrana associate ad elica organizzato da Cryo-EM 11, 12. Cryo-EM ha il vantaggio rispetto ai metodi tradizionali strutturali come la cristallografia a raggi X e NMR, come il campione viene conservato in più vicino al ambiente fisiologico (buffer, membrana, pH), senza additivi e isotopi. Nel caso di FVIII, lo studio della struttura di membrana con questa tecnica è ancora più fisiologicamente rilevanti, come la LNT assomigliare per dimensione, forma e composizione pseudopodi delle piastrine attivate in cui i complessi tenasi assemblano in vivo. Difetti e carenza di FVIII causa Emofilia A, un grave disturbo della coagulazione che colpisce 1 su 5.000 maschi della popolazione umana 4, 6. La maggior parte delle eLa terapia stati efficaci per l&#39;emofilia A è la somministrazione per tutta la vita di FVIII ricombinante umano (hFVIII). Una complicazione significativa della terapia ricombinante FVIII emofilia A è lo sviluppo di anticorpi inibitori per la forma umana che colpisce circa il 30% dei pazienti emofilia A 13. In questo caso, viene utilizzato FVIII porcino (pFVIII) concentrato, come display FVIII suina bassa cross-reattività con anticorpi inibitori contro FVIII umano e forme complessi funzionali con FIXa umana 7. Stabilire l&#39;organizzazione di membrana sia suina e forme di FVIII umani è importante per capire le basi strutturali della funzione cofattore FVIII e implicazioni per emostasi del sangue. In questo studio, descriviamo una combinazione di nanotecnologie lipidi, Cryo-EM, e analisi della struttura progettata per risolvere l&#39;organizzazione di membrana delle due forme FVIII altamente omologhi. I dati presentati Cryo-EM e strutture 3D per Porci elicoidale organizzataFVIII ne ed umano carica negativa LNT mostra il potenziale del nanotecnologie proposto come base per la determinazione della struttura di FVIII e fattori e complessi in un ambiente membrana fisiologica coagulazione legata alla membrana.

<table><tbody><tr><td>JEM2100 con LaB6</td><td>JEOL Ltd.</td><td>JEM-2100</td><td>funziona a 200 kV</td></tr><tr><td>con il software TEMCON</td><td>JEOL Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gatan626 Cryo-holder</td><td>Gatan, Inc.</td><td>626.DH</td><td>raffreddato a -175 &deg; C</td></tr><tr><td>con unità di controllo della temperatura</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Telecamera CCD Gatan 4K x 4K</td><td>Gatan, Inc.</td><td>US4000</td><td>4.096 x 4.096 pixel a 15 &mu; m/pixel risoluzione fisica</td></tr><tr><td>Solarus Modello 950 pulitore al plasma</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Griglia in rame da 300 mm rivestita in carbonio</td><td>Ted Pella</td><td>01821</td><td>pulito al plasma per 10 secondi ad alta potenza</td></tr><tr><td>Quantifoil R2/2 300 mesh</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Q225-CR2</td><td>Griglie in Cu da 300 mesh rivestite in carbonio con fori da 2 mm di diametro.</td></tr><tr><td>Acetato di uranile diidrato</td><td>Ted Pella</td><td>19481</td><td>soluzione all'1%, filtrato</td></tr><tr><td>Galactosil ceramide</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td></td><td></td>860546</tr><tr><td>Dioleoyl-sn-glicero-fosfo-L-serina</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td></td><td></td>840035</tr><tr><td>software EM Micrografo digitale</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td><a href="http://www.gatan.com/DM/">http://www.gatan.com/DM/</a></td></tr><tr><td>EM software EMAN</td><td>download</td><td></td> gratuito<td><a href="http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/&nbsp; Download</td></tr> <tr><td>gratuito</td><td></td> del software </a><td>EM Spider</td><td><a href="http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a></td></tr><tr>EM download <td>gratuito</td><td></td> <td>del software IHRSR</td><td>Programmi disponibili da Edward H. Egelman</td></tr> <tr>Download <td>gratuito</td><td></td> <td>del software http://people.virginia.edu/~ehe2n/ EM (IMOD)</td><td><a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/">http://bio3d.colorado.edu/imod/&nbsp; </a></td></tr><tr><td>EM software (SerialEM)</td><td>download</td><td></td> gratuito<td><a href="ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/">ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/</a></td></tr><tr><td>UCSF-Chimera</td><td>download</td><td></td> gratuito<td><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</a></td></tr></tbody></table>

elicoidale organization of blood fattore viii della coagulazione su lipid nanotubi

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

<html> Crio-microscopia elettronica (Cryo-EM) 1 è un approccio efficace per indagare la struttura funzionale di proteine ​​e complessi in uno stato e membrana idratata ambiente 2. Coagulazione Fattore VIII (FVIII) 3 è un multi-dominio plasma sanguigno glicoproteina. Difetto o carenza di FVIII è la causa di emofilia di tipo A - un disturbo grave emorragia. Dopo l&#39;attivazione proteolitica, FVIII lega alla serina proteasi Factor IXa sulla membrana piastrinica carica negativa, che è fondamentale per la coagulazione 4. Nonostante il ruolo fondamentale FVIII svolge nella coagulazione, informazioni strutturali per il suo stato di membrana è incompleta 5. Ricombinante concentrato di FVIII è il farmaco più efficace contro il tipo emofilia A e commercialmente disponibile FVIII può essere espresso come umano o porcino, entrambi i complessi funzionali che formano con fattore IXa umano 6,7. &quot;&gt; In questo studio presentiamo una combinazione di crio-microscopia elettronica (Cryo-EM), lipidi nanotecnologia e la struttura di analisi applicato per risolvere la struttura di membrana delle due forme di FVIII altamente omologhi:. Umana e suina La metodologia sviluppata nel nostro laboratorio organizzare elicoidalmente le due forme Fattore VIII ricombinante funzionali su nanotubi lipidi carichi negativamente (LNT) è descritto. I risultati rappresentativi dimostrano che il nostro approccio è sufficientemente sensibile per definire le differenze nell&#39;organizzazione elicoidale tra i due altamente omologa in sequenza (86% di identità di sequenza proteine). protocolli dettagliati per l&#39;organizzazione elicoidale, Cryo-EM e tomografia elettronica (ET) di acquisizione dati sono dati. L&#39;bidimensionale (2D) e tridimensionali (3D) analisi della struttura applicate per ottenere le ricostruzioni 3D di umana e suina FVIII-LNT è discusso. Le strutture FVIII-LNT umane e suine presentati mostrano le potenzialità della metodologia proposta per Calculate il funzionale, organizzazione legata alla membrana della coagulazione del sangue Fattore VIII ad alta risoluzione.

FVIII suina umana ricombinante e sono stati organizzati con successo ad elica sul carico negativamente singolo LNT doppio strato, che assomiglia alla superficie delle piastrine attivate. L&#39;organizzazione elicoidale del FVIII umano e suino-LNT era coerente attraverso le micrografie digitali raccolti (Figura 2). La LNT controllo e l&#39;umano e tubi elicoidali FVIII-LNT suina sono stati selezionati e segmentati con la GUI e2helixboxer.py e insiemi di dati iniziali creati con la GUI e2...

Vi presentiamo una combinazione di crio-microscopia elettronica, lipidi nanotecnologie, e analisi della struttura applicata per risolvere la struttura di membrana delle due forme di FVIII altamente omologhi: umane e suine. La metodologia sviluppata nel nostro laboratorio per organizzare elicoidale le due forme contenenti Fattore VIII ricombinante funzionali su nanotubi di lipidi carichi negativamente (LNT) è descritto.

Elicoidale Organization of Blood fattore VIII della coagulazione su Lipid nanotubi

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di mostrare come definire la struttura dell'eli del fattore VIII organizzato su nanotubi lipidici mediante microscopia crioelettronica. Ciò si ottiene organizzando prima il fattore VIII purificato elicoidale su nanotubi lipidici e raccogliendo dati di microscopia crioelettronica alla temperatura dell'azoto liquido e a basse dosi di elettroni. Successivamente, la struttura legata alla membrana del fattore VIII viene calcolata combinando singole particelle e algoritmi di ricostruzione 3D elicoidale.Quindi vengono raccolti i dati della tomografia elettronica e viene generata la ricostruzione 3D. In definitiva, le strutture dei nanotubi lipidici del fattore VIII calcolate vengono convalidate segmentando i volumi 3D e confrontandoli con le ricostruzioni tomografiche. Il metodo dimostrato può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia strutturale e della coagulazione del sangue, come ad esempio qual è l'organizzazione legata alla membrana del fattore VIII e come si relaziona con la sua funzione nella coagulazione.Il GM 2100 lab six è dotato di un sistema operativo TE con costituito da un computer collegato al microscopio elettronico. Su entrambi i pannelli si trovano uno schermo con finestre che leggono il sistema di vuoto, il sistema di illuminazione, le correnti dell'obiettivo HT e due pannelli sinistro e destro posti su entrambi i lati della colonna, lo spostamento del fascio, le manopole XY e le manopole multifunzione o per sordi. Sul pannello di sinistra c'è la manopola di illuminazione o luminosità.Il pannello di destra ospita le manopole di ingrandimento e messa a fuoco e i tre pulsanti per l'imaging mag uno, mag due e low mag e uno per la modalità diffrazione. Per questo protocollo, acquisire i dati in mag one a alpha two utilizzando impostazioni generiche. Impostare le condizioni di illuminazione della dose minima o MDS necessarie per l'acquisizione dei dati cryo EM con i sei pulsanti da F1 a F situati nella riga superiore del pannello di destra.Utilizzare F1 per alzare o abbassare lo schermo, F due per la modalità di ricerca e F tre per mettere a fuoco. Scegliere F quattro per la modalità foto, F cinque per disattivare e attivare MDS e F sei per il raggio vuoto, che viene utilizzato per proteggere il campione dai danni delle radiazioni deviando il raggio. Dopo aver preparato i campioni di crio-EM, secondo il protocollo di testo, posizionare il supporto criogenico nella stazione criogenica e con azoto liquido, riempire l'esecutore del supporto e la stazione criogenica.Quando la temperatura raggiunge i -192 gradi Celsius, aprire l'otturatore sulla punta del supporto, posizionare la griglia cryo EM precedentemente congelata nel luogo designato e utilizzare un anello clamp per fissarlo. Quindi, inserire il supporto criogenico nel microscopio elettronico e utilizzare l'azoto liquido per riempire l'esecutore del supporto criogenico e la camera anticondensatore. Dopo che il supporto si è stabilizzato per 30-60 minuti, accendi il filamento.Quando il filamento è saturo, premere F sei e aprire l'otturatore sul supporto. Per visualizzare la griglia, premere basso magnitudine alfa uno e individuare le aree sulla griglia con ghiaccio sottile. Quindi passare a mag one alpha two per impostare la dose minima o la modalità MDS e acquisire i dati cryo EM a basse dosi di elettroni in modo da non danneggiare il campione.Scegliere F due per impostare la modalità di ricerca e impostare l'ingrandimento a 40.000 x. Utilizzare la manopola della luminosità per ingrandire il raggio fino alla dose minima di elettroni di circa 0,04 elettroni per angstrom al quadrato moltiplicato per secondi. Quindi premere diff per passare alla modalità di diffrazione con la manopola della lunghezza della camma magnetica.Impostare la lunghezza della fotocamera su 120 centimetri. Quindi individuare le aree sulla griglia che hanno nanotubi lipidici nei fori del film di carbonio all'interno delle aree preselezionate. Quindi, premere F quattro per impostare la modalità foto su un ingrandimento di 40.000 x e utilizzare la manopola della luminosità per impostare l'illuminazione a dosi comprese tra 16 e 25 elettroni per angstrom quadrato per secondi.Quindi premere il pulsante di messa a fuoco standard per impostare le condizioni di messa a fuoco, regolando l'altezza Z del campione con i pulsanti Z su giù Imposta la sfocatura tra 1,5 micrometri negativi e 2,5 micrometri negativi. Allineare la modalità di ricerca e foto disegnando un quadrato in modalità di ricerca nella finestra live view sul monitor della fotocamera digitale corrispondente all'area da riprendere in modalità foto, premere F tre per impostare la modalità di messa a fuoco su un ingrandimento di 100, 000x. Quindi focalizzare l'illuminazione per coprire il chip CCD e fuori asse per non irradiare l'area da riprendere.In modalità foto, regolare la sfocatura tra 1,5 e 2,5 micrometri negativi per correggere l'astigmatismo dell'immagine, se necessario. Nel modo di ricerca, selezionare F otto L e T da riprendere acquisendo immagini dal vivo nella finestra di visualizzazione dal vivo al centro del monitor della fotocamera digitale, i due F otto L e T nel quadrato disegnato nella finestra di visualizzazione dal vivo. Passare alla modalità foto e fare clic sul pulsante di acquisizione sul monitor della fotocamera a micrografo digitale.Per registrare un'immagine digitale sulla camera CCD, premere CTRL F per ottenere una trasformata di Fourier veloce per verificare la qualità e la sfocatura dell'immagine acquisita. Dopo aver utilizzato i software gratuiti di elaborazione scientifica delle immagini Eman two e I-H-R-S-R per eseguire l'analisi delle immagini 2D e la ricostruzione elicoidale secondo il protocollo di testo. Per visualizzare e segmentare i volumi F otto L e T, aprire le ricostruzioni 3D finali negli strumenti di selezione cera UCSF, nella mappa dei segmenti dei dati del volume e, nella scheda della mappa dei segmenti, selezionare il volume e fare clic su segmento per segmentare i dati del volume.Quindi premere il tasto Ctrl Maiusc e fare clic su Raggruppa per raggruppare i segmenti corrispondenti a una cella dell'unità. Per enfatizzare le caratteristiche strutturali, scegliere il colore delle azioni per colorare i segmenti in base alla cella unitaria e all'elica. Per raccogliere i dati della tomografia elettronica, la griglia di microscopia elettronica colorata negativamente viene trasferita in un singolo supporto di inclinazione prima di trasferire il supporto nell'inclinazione del microscopio elettronico.Serie di fattore VIII suino organizzato alleato su nanotubi lipidici sono state raccolte con il software EM seriale. Secondo il protocollo di testo, il Tom è stato ricostruito in IM e visualizzato in mod 3D per ridurre le dimensioni del per utilizzare imad bin Val tobin di quattro, quindi utilizzare il comando IM mod rotate vol per selezionare l'angolo corretto per ruotare il nanotubo lipidico lungo l'asse Y e ruotare l'intero tommo con il comando di ridimensionamento della clip mod IM ritagliare, il nano tubo lipidico selezionato lungo l'asse Y utilizza la mod 3D per aprire il sub tommo ritagliato. Infine fare clic sul Tommo Graham per visualizzare la disposizione delle molecole di fattore VII lungo le fette nell'asse Z e lungo l'asse Y nel volume sub tomo.Come mostrato qui, gli F otto ricombinanti umani e suini sono stati organizzati con successo su un singolo doppio strato caricato negativamente simile alla superficie piastrinica attivata. Questa figura mostra che l'ordine elicoidale degli F otto umani e suini legati alla membrana e il doppio strato lipidico nelle migliori medie di controllo LNT e F otto LNT 2D sono ben definiti e rivelano le variazioni nell'organizzazione elicoidale tra le due proteine. Questi pannelli rappresentano le ricostruzioni 3D iniziali per l'uomo e il suino F otto L e T che sono state effettuate con 1000 particelle rappresentative dal set finale di dati F otto L e T umani e suini qui, i grafici di correlazione del guscio di primo piano per l'uomo e il suino F otto LNT indicano una risoluzione di 20,5 angstrom con una correlazione del guscio di Fourier pari a 0,5 in questa figura.I volumi finali mostrano otto molecole umane F otto e 10 F 8 suine legate alla membrana organizzate attorno all'asse elicoidale. Ogni molecola F 8 umana viene traslata 41,2 angstrom e ruotata di 42,0 gradi rispetto alla precedente, e ogni molecola F 8 suina viene traslata 35,9 angstrom e ruotata di 35,2 gradi rispetto alla molecola precedente corrispondente ai parametri elicoidali delle ricostruzioni 3D finali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come acquisire i dati di crio-microscopia elettronica della membrana marrone proteica organizzata su nanotubi lipidici e calcolare una struttura 3D vicina alla condizione fisiologica.Questo video è un primo passo verso una struttura ad alta risoluzione legata alla membrana di una proteina della coagulazione, che può essere applicata ad altre proteine che funzionano in un ambiente lipidico.

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Misura di attività del Fattore V nel plasma umano usando un saggio di coagulazione Microplate

Segnaliamo un'applicazione intelligente di nanotubi di carbonio per la stabilizzazione cinetica di particelle lipidiche che contengono nanostrutture auto-assemblate nei loro nuclei. La preparazione di particelle lipidiche richiede concentrazioni piuttosto basse di nanotubi di carbonio che ne consentono l'uso in applicazioni biomediche come la somministrazione di farmaci.

Preparazione facile di Internamente auto-assemblato Lipid particelle stabilizzati da nanotubi di carbonio

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Elicoidale Organization of Blood fattore VIII della coagulazione su Lipid nanotubi

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