Name: In vivo Interrogatorio del Sistema Nervoso Centrale Translatome da Polyribosome Frazionamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Scopri la frazionamento dei poliribosomi nel sistema nervoso centrale per studiare il translatoma in vivo. Questo metodo consente di isolare mRNA associati ai ribosomi da campioni di tessuto cerebrale e spinale di topo.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal ministero federale tedesco dell&#39;Istruzione e della ricerca (BMBF), la Systems Biology di segnalazione in Cancro (Helmholtz Alliance on Systems Biology) e il tedesco Cancer Research Center (DKFZ).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali del DKFZ. Attenzione: Al fine di evitare la contaminazione RNAse dei campioni, adottare precauzioni di base per evitare la contaminazione RNAsi e preparare tutti i buffer con acqua trattata con DEPC. 1. Preparazione di saccarosio gradienti <ol><li> Preparare 17.5, 25.6, 33.8, 41.9 e soluzioni di saccarosio del 50% (cfr. tabella 1). Iniziare a preparare gradienti aggiungendo lentamente 2 ml di soluzione di saccarosio al 50% al fondo di un tubo polyallomer ultracentrifuga. Congelare lo strato posizionando provette per 20 minuti a -80 ° C. </li><li> Aggiungere strati successivi a ridurre le percentuali di saccarosio con passaggi di congelamento in mezzo, finendo al 17,5% di saccarosio. Mantenere pendenze su ghiaccio durante l&#39;aggiunta di soluzioni di saccarosio per evitare lo scongelamento di strati sottostanti. </li><li> Preparare gradienti di saccarosio appena un giorno prima dell&#39;uso e mantenere a 4 ° C. Alternatively, preparare gradienti in anticipo, conservare a -80 ° C e scongelare a 4 ° C la notte prima dell&#39;esperimento. </li></ol> 2. Preparazione Tissue (cavo e / o cerebrale spinale) <ol><li> Anestetizzare il mouse da una dose eccessiva di Xylazin e Ketamin in NaCl e transcardiaca profumato con 20 ml di soluzione di Hank equilibrata di sali (HBSS) contenente 200 CHX mg / ml, che immobilizza i ribosomi su trascrizioni associati. Verificare il corretto anestesia da non-responsività al pizzichi punta. </li><li> Estrarre il tessuto rapidamente. Aprire la dorsale del cranio ed estrarre il cervello. Eseguire laminectomia dell&#39;intero toracica e lombare della colonna vertebrale ed estrarre il midollo spinale. Utilizzare intero cervello (~ 400 mg) o 4 cm pezzo di midollo spinale (~ 90 mg), rispettivamente. </li><li> Trasferire il tessuto in ghiaccio freddo omogeneizzazione tampone A (vedi Tabella 1) (midollo spinale: 1 ml; cervello: 4 ml) e dadi in piccoli pezzi con un bisturi pulito per consentire un maggiore assorbimento di cycloheximide. Perform tutti gli ulteriori passi sul ghiaccio. </li><li> Incubare per 15 minuti e omogeneizzare il tessuto meccanicamente con un omogeneizzatore Dounce. Omogeneizzazione controllato con attenzione è necessaria per garantire che i nuclei rimangono intatti. Trattare tutti i campioni esattamente allo stesso modo per garantire la comparabilità. Nota: per il tessuto cerebrale: Disrupt tessuto da 5 colpi con un pestello tenuta perfetta. Per il tessuto del midollo spinale: distruggere da 5 colpi con un pestello vagamente di montaggio, seguiti da altri 5 colpi con un pestello tenuta perfetta. </li><li> Prendere aliquote (400 microlitri per il cervello e 200 microlitri per il midollo spinale), flash congelare e conservare a -80 ° C per l&#39;isolamento dell&#39;RNA totale. </li><li> Rimuovere nuclei e cellule undisrupted e frammenti di tessuto mediante centrifugazione a 500 xg per 10 min a 4 ° C. Centrifugazione a bassa velocità previene la perdita dei ribosomi. </li><li> Frammenti di membrana Lisare nel surnatante libero nuclei per 30 minuti aggiungendo NP-40 e detergenti sodio desossicolato (ciascuno ad una concentrazione finale di 1%). </li></ol><ol><li> Questo passaggio rimuove componenti grassi dal campione che altrimenti mascherare il segnale nel profilo polyribosome. In primo luogo, pre-raffreddamento secchi ultracentrifuga e rotore a 4 ° C e preparare 2 M, 1.1 M e 0,9 M soluzioni di saccarosio (cfr. tabella 1). </li><li> Mescolare lisato con un 1.22 volumi di soluzione 2 M di saccarosio e trasferire in un tubo di polietilene ultracentrifuga. Riempire tutte le provette a parità di volume di 10 ml con 1,1 M soluzione di saccarosio, successivamente sovrapporre accuratamente con 0,9 M soluzione di saccarosio. </li><li> Posizionare i tubi ultracentrifuga in secchi ultracentrifuga pre-refrigerati. Centrifugare per 3 ore a 100.000 xg a 4 ° C. Durante questo processo ribosomi depositarsi nel pellet che galleggiano componenti grassi e rimangono nel supernatante. </li></ol> 4. Gradiente di saccarosio frazionamento <ol><li> Rimuovere il surnatante e sciogliere pellet in tampone di omogeneizzazione B (vedi Tabella 1 </strong&gt;). Misurare l&#39;assorbanza a 260 nm per ciascun campione utilizzando un Nanodrop o apparecchio equivalente e normalizzare importi da caricare in base al valore di assorbanza. </li><li> Posizionare gradienti di saccarosio (preparazione è descritto in una sezione precedente) nei secchi ultracentrifuga pre-raffreddata. Campioni di livello con attenzione sulla parte superiore del gradiente. Aggiungere un gradiente di saccarosio vuoto come controllo tecnico. </li><li> Regolare il peso di ogni secchio con tampone di omogeneizzazione. Centrifugare i campioni per 1,5 ore a 285.000 xg a 4 ° C. </li><li> Iniziare a preparare Isco frazionatore 30 min prima della fine di centrifugazione. Se si utilizza un altro modello della colonna di frazionamento, seguire il protocollo del produttore. <ol><li> Impostare la sensibilità appropriata (0.2 AUFS per il cervello o 0,05 AUFS per il midollo spinale) per la lampada UV e accenderlo per il riscaldamento. Montare il piercer tubo, collegarlo tramite la pompa a rotazione soluzione di saccarosio del 60% attraverso il piercer tubo. </li><li> Verificare la configurazione pompando saccarosio (il flusso di rattoe: 1 ml / min), in particolare per assicurarsi che non ci sono perdite nei tubi che introdurrà bolle nella sfumatura. </li><li> Background blank assorbimento pompando manualmente tampone gradiente nel rivelatore UV e correzione della linea di base. </li></ol></li><li> Rimuovere con attenzione i secchi ultracentrifuga contenenti i gradienti di saccarosio con campioni sedimentati dal rotore e disporli sul ghiaccio. Evitare qualsiasi urto di gradienti per prevenire la perdita di risoluzione. </li><li> Gradienti Esegui sulla colonna di frazionamento. Eseguire prima di valutare l&#39;assorbimento di fondo e garantire la corretta configurazione tecnica gradienti vuote. <ol><li> Attaccare gradiente al rivelatore UV e perforare il fondo della provetta con il perforatore tubo. Avviare il pompaggio di 60% di saccarosio, che spostare il gradiente con campioni sedimentati verso l&#39;alto attraverso il rivelatore UV e nel dispenser a gocce. </li><li> L&#39;assorbanza a 260 nm è documentato per generare il profilo di assorbimento per il campione, con punte che indicano la sedimentazionezione di mRNA associati alla subunità ribosomiale, monosomes e, successivamente, un numero crescente di ribosomi. </li></ol></li><li> Raccogliere campioni in 20 frazioni tramite il dispenser a gocce (600 ml ciascuna, in 2 ml provette). </li></ol> 5. Isolamento RNA da singole frazioni <ol><li> Aggiungere 10% SDS ad una concentrazione finale di 1% per le singole frazioni e mescolare bene, al fine di spiegare le proteine ​​e dissociare ribosomi. A questo punto i campioni possono essere congelati a -80 ° C. A seconda questione da affrontare, frazioni possono essere raggruppati in base al profilo di assorbanza. </li><li> Isolare RNA con estrazione fenolo / cloroformio acida, che rimuove anche contaminanti tracce di DNA. <ol><li> Aggiungere un volume di acido fenolo / cloroformio (preriscaldata a RT) per ogni campione, calore per 10 min a 65 ° C e pressione di rilascio sotto la cappa dopo. </li><li> Centrifugare i campioni per 20 minuti a 17.000 xg a temperatura ambiente. Trasferire accuratamente fase acquosa a un nuovo 1,5 mltubo. Siate consapevoli di inversione di fase in dense frazioni saccarosio, in cui la fase acquosa potrebbe essere in fondo dopo la centrifugazione. </li><li> Aggiungere un volume di isopropanolo, 1/9 volumi di acetato di sodio (pH 5,2) e 1 ml GlycoBlue a ciascun campione allo scopo di precipitare l&#39;RNA. I campioni di almeno 1 ora a -80 ° C. </li><li> Centrifugare per 30 minuti a 17.000 xg e 4 ° C. GlycoBlue fornisce una visualizzazione del pellet. Rimuovere il surnatante, lavare pellet una volta con ghiaccio freddo 80% di etanolo e pellet aria secca. Sciogliere pellet in RNAsi acqua libera. </li></ol></li><li> Quantificare quantità di RNA da Nanodrop e analizzare l&#39;integrità dell&#39;RNA da un chip Bioanalyzer. RNA che viene ottenuta con il protocollo presentato è adatto per tutti stato dell&#39;arte saggi high throughput compresi microarray e sequenziamento. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Sebbene polyribosome frazionamento non è una tecnica innovativa, rimane particolarmente impegnativo. Sulla base del materiale in ingresso, sostanziale ottimizzazione può essere necessario. Questo è soprattutto il caso di campioni in vivo del sistema nervoso centrale, in cui la quantità di materiale è spesso un limite e grassi componenti del tessuto ostacolano l&#39;isolamento di mRNA traduzione. Protocolli di frazionamento maggior parte pubblicati trattano lievito o linee cellulari di mammifero, e ci sono protocolli stabiliti per il cervello 12,13,14. Al contrario, ci sono a malapena eventuali pubblicazioni che descrivono frazionamento del midollo spinale, e precedenti protocolli richiedono midollo spinale da un gran numero di animali da pool 15. Per queste ragioni, sono state apportate diverse modifiche necessarie per adattare il protocollo di frazionamento per tessuti SNC, inclusa singolo mouse midollo spinale. Immobilizzazione ribosoma con cycloheximide viene eseguita durante la perfusione degli animali al fine di evitare la dissociazione dei ribosomi During il lungo processo di estrazione del tessuto. Successivamente, RNA polisomi vengono estratti in modo specifico per massimizzare la resa polyribosome. Primo, controllata omogeneizzazione del tessuto da douncing, mantiene il nucleo intatto e previene la contaminazione del DNA. Il nucleo viene quindi rimosso in modo affidabile mediante centrifugazione. La combinazione dei detergenti NP-40 e sodio desossicolato assicura lisi del reticolo endoplasmatico e rilascio dei suoi ribosomi membrana associata. Inoltre, i componenti di assorbimento UV all&#39;interno del ricco mielina lipidi oscurano i profili polyribosome. La mielina flottazione è quindi necessario, dove i composti densi come poliribosomi sono pellet e composti leggeri, come mielina galleggiante e vengono rimossi 16. Poliribosomi vengono sedimentate su un gradiente di saccarosio 17,5% al ​​50%. Invece di stratificazione manualmente e congela ogni strato saccarosio, gradienti possono anche essere preparati utilizzando un mixer gradiente. Estrazione di RNA da frazioni utilizzando acido fenolo / cloroformio permette DNA essere rimosso con una minima perdita di RNA. Tuttavia, inversione di fase può verificarsi in frazioni di saccarosio dense (sopra frazione 16). Questo protocollo fornisce vantaggi rispetto ad altri metodi convenzionali che affrontano il livello di traduzione. Ad esempio, sia la misura di S6 fosforilata (un marcatore traduzione prominente) e etichettatura di catene nascenti con radioisotopi forniscono informazioni sui livelli di traduzione globali ma rivelano poco su quale importo viene tradotto. Polyribosome frazionamento, invece, permette non solo la valutazione della traduzione globale, ma anche l&#39;identità di mRNA traduzione e le relative proteine ​​regolatrici. Real time PCR può essere eseguita su RNA isolato per una rapida lettura su mRNA selezionate e microarray e sequenziamento di prossima generazione RNA può essere eseguita per studi genome wide. Le ottimizzazioni qui presentati permettono la tecnica per essere utilizzato con minime quantità di tessuto cerebrale, quindi diminuiscezione il numero di animali necessari e migliorare la qualità sperimentale complessivo riducendo il tempo di lavorazione del tessuto. D&#39;altra parte, questa tecnica non può distinguere ribosomi in stallo da quelle traduzione. Trascrizioni che trasportano ribosomi stallo si sedimenta in frazioni pesanti, e questo dovrebbe essere tenuto presente quando si interpretano i dati. Ci sono recenti tecniche riportate, vale a dire RiboTaq e TRAP, in cui ribosomi sono etichettati con tag o giornalisti epitopi rispettivamente in modo specifico tipo di cellula e mRNA isolati mediante immunoprecipitazione 17,18 associati. Questa tecnica può essere accoppiato a polyribosome frazionamento di offrire alta risoluzione leggere per specifiche popolazioni cellulari. Ribosoma piede-stampa è un&#39;altra tecnica innovativa che coinvolge nucleasi digestione per generare piccoli frammenti, o &quot;impronte&quot;, di mRNA che sono protetti dai ribosomi. Le biblioteche sono poi generati da queste impronte e sequenziati. Questo metodo provIDES tutta l&#39;analisi del genoma specifico codone sulla traduzione ed è in grado di identificare i ribosomi fase di stallo, non-agosto avviare codoni e piccoli a monte di lettura aperta, che non possono essere raggiunti da polyribosome frazionamento 19. Tuttavia, polyribosome frazionamento può essere accoppiato a profilatura ribosoma per l&#39;isolamento di frammenti digeriti contenenti singoli ribosomi, arricchendo così le specie molecolari necessari per la preparazione raccolta in cui è spesso richiesta un&#39;elevata purezza del campione. Presi insieme, polyribosome frazionamento è un metodo flessibile con importanza durevole e può essere accoppiato a varie applicazioni a valle, compresi ampi saggi genoma come sequenziamento di prossima generazione.

L&#39;espressione genica è determinata dall&#39;azione combinata di trascrizione, traduzione e stabilità di mRNA e proteine, con traduzione recanti l&#39;effetto più predominante 1. E &#39;ormai evidente che ognuno di questi passi è altamente regolamentato. Micro-RNA, formazione di granuli di RNA, alternativa e poliadenilazione citoplasmatica alcuni esempi di regolazione post-trascrizionale dell&#39;espressione genica 2,3. Ciascuno di questi meccanismi disaccoppia trascrizione da traduzione e influenza il proteoma nel sistema biologico di interesse. Così, ovviamente, i livelli di mRNA da soli sono una lettura imperfetta dei livelli della proteina 4. Proteomica quantitativa fornisce la valutazione più diretta dell&#39;espressione genica, ma nonostante i recenti progressi, vi sono ancora notevoli limitazioni sulla sensibilità e risoluzione sequenza proteica. Affrontando quindi il translatome, il repertorio di mRNA traduzione, offre un ottimo compromesso tra lo studio dellatrascrittoma e proteoma. E &#39;più preciso di trascrittomica nella valutazione dell&#39;espressione genica finale, e fornisce sia una maggiore copertura e una risoluzione sequenza di proteomica. Nei mammiferi, la maggior parte degli eventi di traduzione inizia con apertura cap-dipendente. Un gruppo di fattori di inizio eucariotiche insieme alla subunità ribosomiale 40S piccola assemblare al tappo 5 &#39;di un mRNA. Il complesso poi esegue la scansione del mRNA e al raggiungimento del codone di inizio agosto, recluta la subunità ribosomiale 60S grande per formare un completo 80S dei ribosomi. Il ricavato della fase di allungamento con il ribosoma si muove lungo l&#39;mRNA, con fattori di allungamento assistere l&#39;incorporazione di aminoacidi da tRNA caricati alla catena peptidica nascente. Diverse ribosomi possono procedere lungo un singolo mRNA simultaneamente e il numero di ribosomi associato è stato dimostrato essere correlato con il tasso di sintesi proteica 5,6. Questo rende ribosomiale carico un&#39;indicazione affidabile per translation e permette la separazione di tradurre attivamente mRNA basato su tasso di sedimentazione. Oltre alla quantificazione di tradurre mRNA, informazioni di sequenza può essere ottenuta per identificare motivi coinvolti nella regolazione traduzione. RNA anche proteine ​​leganti ed altri fattori di traduzione possono essere isolati da differenti frazioni, facilitando lo studio e la scoperta di proteine ​​regolatrici correlate. Nel sistema nervoso, controllo traduzionale è stato collegato a processi quali mRNA stoccaggio, trasporto e sintesi proteica locale. Coni di crescita hanno dimostrato di ospitare una determinata piscina localizzata di mRNA distinte dal resto dell&#39;assone 7. Inoltre, assoni possiedono la capacità di sintetizzare localmente proteine ​​8,9. Come risultato, il controllo locale della traduzione è diventato un tema cruciale di studio in neurobiologia. Il potenziale di polyribosome frazionamento per affrontare questo è stato illustrato in diversi studi, in cui la tecnica è stata utilizzata perindagare guida degli assoni nello sviluppo del midollo spinale, e dimostrato la definizione attività-dipendente di BDNF nel cervello 10,11.

<table><tbody><tr><td>Hank' s soluzione di sali bilanciati</td><td>Gibco</td><td>14170-138</td><td></td></tr><tr><td>Provetta, parete sottile, poliallomero, 14 ml, 14 x 95 mm</td><td>Coltro Beckman</td><td>331374</td><td></td></tr><tr><td>Dietilpirocarbonato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>cautela</td></tr><tr><td>Cicloesimide</td><td>Sigma</td><td>C7698</td><td>pericolo</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>avvertenza</td></tr><tr><td>Cocktail completo di inibitori della proteasi Compresse</td><td>Roche</td><td>11697498001 Soluzione di</td><td></td></tr><tr><td>fenilmetanosulfonilfluoruro</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td>pericolo</td></tr><tr><td>RNasin Plus RNase Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2611</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Roche</td><td>11332473001</td><td>pericolo</td></tr><tr><td>Sodio desossicolato</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>avvertenza</td></tr><tr><td>Acido-Fenolo: Cloroformio, pH 4,5 (con IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion</td><td>AM9722</td><td>pericolo</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dounce Tissue Macinacaffè, 1 ml/7 ml</td><td>Wheaton</td><td>357538/357542</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW 40 Ti Rotore, Secchio Oscillante, Titanio, 6 x 14 ml, 40.000 giri/min, 285.000 x g</td><td>Beckman Coulter</td><td>331302</td><td></td></tr><tr><td>Frazionamento a gradiente di densità</td><td>Teledyne Isco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalizzatore</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo interrogatorio del sistema nervoso centrale translatome da polyribosome frazionamento

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Più processi sono coinvolti nell&#39;espressione genica tra cui trascrizione, traduzione e stabilità di mRNA e proteine. Ognuno di questi passaggi sono strettamente regolati, influenzando le dinamiche finali di proteine ​​abbondanza. Esistono vari meccanismi di regolazione nella fase di traduzione, rendendo livelli di mRNA solo un indice affidabile della espressione genica. Inoltre, la regolazione locale della traduzione dell&#39;mRNA è stata particolarmente coinvolta nelle funzioni neuronali, spostando «translatomics &#39;al centro dell&#39;attenzione in neurobiologia. Il metodo proposto consente di trascrittomica ponte e proteomica. Qui descriviamo modifiche essenziali alla tecnica di polyribosome frazionamento, che interroga il translatome basato sull&#39;associazione di mRNA tradotte attivamente a più ribosomi e la loro sedimentazione differenziale gradienti di saccarosio. Tradizionalmente, lavorando con campioni in vivo, in particolare del central sistema nervoso (CNS), si è dimostrato impegnativo a causa della quantità limitate di materiale e la presenza di componenti di tessuto adiposo. Per risolvere questo problema, il protocollo descritto è specificamente ottimizzato per l&#39;uso con minima quantità di materiale CNS, come dimostra l&#39;uso di singolo mouse midollo spinale e cervello. In breve, i tessuti del sistema nervoso centrale vengono estratte e ribosomi traduzione sono immobilizzati su mRNA con cycloheximide. Mielina flottazione viene poi eseguita per rimuovere ricchi componenti lipidici. Frazionamento viene eseguita su un gradiente di saccarosio, laddove mRNA sono separati in base alla loro ribosomiale carico. Isolato frazioni sono adatti per una vasta gamma di test a valle, comprese le nuove tecnologie di analisi del genoma di larghezza.

La figura 2 mostra i profili polyribosome rappresentativi dopo frazionamento. I profili del cervello e del midollo spinale mostrano curve caratteristiche di assorbimento come descritto prima per linee cellulari. mRNA legati alle piccole subunità ribosomiale (40S) sedimenti in frazioni più leggere ed appaiono prima come picco sul profilo, seguita dalla subunità ribosomiale (60S) e monosome (80S) mRNA legati. mRNA legati a più ribosomi sedimentare in frazioni più pesanti, con i picchi successivi indicano un numero crescente di ribosomi associati. Traduzione globale può essere valutata dal profilo. Come esempio, tessuto cerebrale ha una polyribosome superiore a monosome rapporto di tessuto del midollo spinale, che indica più traduzione attiva. RNA estratto da singole frazioni sono stati valutati da Bioanalyzer, mostrando la distribuzione di 18S e 28S rRNA. 18S rRNA precedenza appare nel profilo, in conformità con le piccole subunità ribosomali sedimenta in sucr leggero<html> frazioni OSE. Le rese di RNA totale sono 10-20 mg per cervello e 2-4 mg per midollo spinale. Rendimenti RNA da singole frazioni sono fino a 4 mg e 0,8 mg per il cervello e il midollo spinale, rispettivamente, a seconda della frazione. Un gradiente di saccarosio vuoto contiene già alcune assorbimento sfondo a 260 nm, per la presenza di DTT. Questo sfondo può essere sottratto durante l&#39;analisi dei dati al fine di normalizzare i valori dei campioni. Trattamento EDTA crollato picchi polyribosome, dimostrando il profilo di sedimentazione è dovuta alla traduzione. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Workflow e potenziali applicazioni di in vivo polyribosome frazionamento.&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> Profili di Figura 2. (A) profili polyribosome tipici di cervello e midollo spinale, con la valutazione di RNA estratto da Bioanalyzer. (B) Distribuzione di GAPDH mRNA oltre frazioni di qRT-PCR. (C) Polyribosome di gradiente vuota e cervello con e senza trattamento EDTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> Buffer di gradiente 2x </td><td> 30 mM Tris-HCl pH7.4, 30 mM MgCl 2, 600 mM NaCl, 200 mg / ml cicloesimide (CHX), 2 mM ditiotreitolo (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> soluzione di saccarosio 17,5% </td><td> 8.67 g di saccarosio, 25 ml 2x tampone gradiente, fino a 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> soluzione di saccarosio 25,6% </td><td> 12,8 g di saccarosio, 25 ml 2x tampone gradiente, fino a 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> soluzione di saccarosio 33,8% </td><td> 16,9 g di saccarosio, 25 ml 2x tampone gradiente, fino a 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> soluzione di saccarosio 41,9% </td><td> 20,95 g di saccarosio, 25 ml 2x tampone gradiente, fino a 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> soluzione di saccarosio al 50% </td><td> 25 g di saccarosio, 25 ml 2x tampone gradiente, fino a 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> omogeneizzazionetampone A </td><td> 0,25 M saccarosio, 50 mM Tris / HCl, pH7.4), 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 200 ug / ml CHX, inibitore della proteasi completo 1x Roche, DTT 1 mM, phenylmethanesulfonylfluoride 1mM (PMSF), 100 U / ml RNasin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> Soluzione di saccarosio 2M </td><td> 68,4% di saccarosio, 50 mM Tris-HCl, pH7.4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 pg / ml CHX, inibitore della proteasi completo 1x Roche, 1 mM DTT, PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1.1M soluzione di saccarosio </td><td> 38,5% di saccarosio, 50 mM Tris-HCl, pH7.4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 pg / ml CHX, inibitore della proteasi completo 1x Roche, 1 mM DTT, PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0.9M soluzione di saccarosio </td><td> 30,8% di saccarosio, 50 mM Tris-HCl, pH7.4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 pg / ml CHX, inibitore della proteasi completo 1x Roche, 1 mM DTT, PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> homogenization tampone B </td><td> 0,25 M saccarosio, 50 mM Tris / HCl, pH7.4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1% NP-40, 1% sodio desossicolato </td><td> 200 ug / ml CHX, inibitore 1x Roche completo proteasi, 1mM DTT, 1 mM PMSF, 100 U / ml RNasin </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Elenco dei tamponi e soluzioni.

Questo protocollo illustra le modifiche essenziali della polyribosome frazionamento, al fine di studiare la translatome di vivo campioni SNC in. Permette valutazione globale della regolamentazione traduzione e trascrizione attraverso l&#39;isolamento e il confronto di RNA totale di ribosoma frazioni di RNA legati.

In vivo Interrogatorio del Sistema Nervoso Centrale Translatome da Polyribosome Frazionamento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare gli mRNA in fase di traduzione nel tessuto primario del SNC. Il protocollo inizia con l'estrazione dei tessuti pertinenti dal topo in cicloesimide. A questo segue l'omogeneizzazione meccanica e la lisi in detergente.Successivamente viene eseguita la fluttuazione della mielina, che rimuove i componenti lipidici grassi dei tessuti che altrimenti mascherebbero i profili dei poliribosomi. Il pellet, che contiene i ribosomi e gli mRNA ad essi associati, viene sedimentato su un gradiente di saccarosio per separare gli mRNA legati ai ribosomi. Il gradiente viene quindi frazionato per ottenere un profilo di poliribosomi, in cui ogni picco rappresenta mRNA associati a un determinato numero di ribosomi o di subunità ribosomiali.Le frazioni contenenti poliribosomi vengono quindi purificate per ottenere RNA destinato ad applicazioni successive. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che consente di lavorare con piccole quantità di tessuto del sistema nervoso centrale ed è versatile nelle sue applicazioni successive. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nello studio della traduzione nel sistema nervoso, come ad esempio i cambiamenti nei livelli di traduzione in diverse condizioni, nonché il ruolo della traduzione, dei fattori regolatori e dei motivi di sequenza.In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà perché i materiali del SNC in vivo sono solitamente limitati, e i componenti atic presenti nel tessuto potrebbero mascherare i profili di poliribosomi. Per un topo precedentemente perfuso transcardialmente con HBSS in presenza di cyclo Heide, iniziare rapidamente l'estrazione del tessuto. Aprire dorsalmente il cranio ed estrarre il cervello. Trasferire il cervello in tampone A freddo su ghiaccio e procedere immediatamente al trinciamento del tessuto cerebrale.Successivamente, eseguire una laminectomia della colonna vertebrale toracica e lombare. Rimuovere quattro centimetri di midollo spinale e trasferirli nel buffer A freddo su ghiaccio. Tritare separatamente i tessuti per aumentare il loro assorbimento di cyclo heide, quindi incubare sul ghiaccio per 15 minuti.Successivamente, omogeneizzare i tessuti con l'omogeneizzatore a discesa per assicurare che i nuclei rimangano integri. Il tessuto cerebrale richiede cinque passaggi con pestello stretto; trasferire il tessuto filtrato in provette. Il tessuto del midollo spinale richiede cinque passaggi con pestello largo, seguiti da altri cinque passaggi con pestello stretto.Ora raccogliere aliquote per l'isolamento dell'RNA totale, 200 microlitri di midollo spinale e 400 microlitri di cervello congelati rapidamente. Congelarli e conservarli a meno 80 gradi Celsius. Per rimuovere i nuclei, cellule non lisate e frammenti di tessuto, centrifugare i tessuti a 500 G per 10 minuti.Recuperare il soprannatante contenente il reticolo endoplasmatico con i suoi ribosomi legati e scartare il pellet contenente i nuclei. Successivamente, lisare i frammenti della membrana del reticolo endoplasmatico per liberare i ribosomi aggiungendo i detergenti NP-40 e deossicolato di sodio, ciascuno fino a una concentrazione finale dell'1%. Lasciare incubare i campioni per 30 minuti sul ghiaccio. Una delle difficoltà nel lavorare con tessuti del sistema nervoso è che la mielina e altri componenti ricchi di lipidi interferiscono con i profili di polisomi.Per affrontare questo problema, è necessario introdurre il processo di modellizzazione della galleggiamento per rimuovere questi componenti prima di iniziare. Raffreddare preventivamente a quattro gradi Celsius i becchi e il rotore dell'ultracentrifuga. Mescolare ora i lisati raccolti con 1,22 volumi di saccarosio due molare.Trasferire ogni miscela in un tubo da ultracentrifuga in polietilene e riempire i tubi fino a 10 millilitri con saccarosio 1,1 molare. Quindi sovrapporre con attenzione ai tubi saccarosio 0,9 molare. A questo punto trasferire i tubi nei becchetti refrigerati ed equilibrarli con il buffer B. Inserire i becchetti equilibrati nel rotore refrigerato ed eseguire la centrifugazione a 100.000 ×g per tre ore a quattro gradi Celsius; in queste condizioni, i ribosomi e gli RNA si depositeranno sotto forma di pellet, separandosi dai lipidi in sospensione.Dopo la centrifugazione di galleggiamento della mielina, rimuovere il sopranatante e sciogliere i pellet con i ribosomi nel buffer B. Successivamente, misurare l'assorbanza delle soluzioni di ribosomi a 260 nanometri utilizzando un apparato NanoDrop. Stimare le concentrazioni totali di RNA utilizzando questi valori. A questo punto, trasferire i campioni sui gradiente di saccarosio preparati.Si abbia cura di non alterare i gradienti e si includa un gradiente vuoto come controllo. Si equilibrino i contenitori refrigerati con i campioni come in precedenza. Quindi si faccia girare la centrifuga a 285.000 G per un'ora e mezza a quattro gradi Celsius.Mentre la centrifuga è in funzione, preparare il frazionatore. Innanzitutto, impostare la sensibilità della lampada UV. Successivamente, collegare il perforatore di tubi al frazionatore e connetterlo tramite un tubo a una bottiglia contenente saccarosio al 60%.Con una pompa peristaltica interposta, iniziare a pompare il saccarosio nel frazionatore a un millilitro al minuto. Controllare la presenza di eventuali perdite d'aria che introducano bolle e stringere le relative guarnizioni. Quindi pompare manualmente il tampone del gradiente nel rivelatore UV per impostare la linea di base.Dopo aver rimosso con attenzione i campioni dall'ultracentrifuga senza urtare il carico, inserirli nel frazionatore e quindi forare la parte inferiore del tubo con l'apposito ago. Iniziare a pompare la soluzione di saccarosio al 60% per spostare il gradiente oltre il rivelatore UV e farlo defluire nel dispensatore a gocce. Registrare il profilo di assorbanza a 260 nanometri.Raccogliere 20 frazioni dal dispensatore a goccia in provette da due millilitri. Raccogliere 600 microlitri per frazione e procedere con l'elaborazione dei gradienti del campione aggiungendo a ciascuna frazione SDS al 10% fino a una concentrazione finale di SDS all'1% e mescolare accuratamente. A questo punto, isolare l'RNA mediante estrazione acida con fenolo cloroformio.Iniziare aggiungendo un volume di fenile cloroformio acido a temperatura ambiente, quindi riscaldare le provette a 65 gradi per 10 minuti. Aprire con attenzione le fiale in una cappa per liberare la pressione dopo il riscaldamento. Successivamente, centrifugare le frazioni a 17.000 ×g per 20 minuti a temperatura ambiente e raccogliere la fase acquosa, che può trovarsi sopra o sotto il saccarosio.Successivamente, aggiungere un volume di isopropanolo, un nono di volume di acetato di sodio e un microlitro di glyco blue. Precipitare l'RNA per almeno un'ora a meno 80 gradi e quindi raccogliere il pellet mediante centrifugazione. Lavare quindi i pellet una volta con etanolo al 80% refrigerato e, dopo aver nuovamente effettuato la centrifugazione dell'RNA, asciugare i pellet all'aria, risospendendoli in acqua ed eseguire l'analisi successiva. In alternativa, i campioni possono essere conservati a meno 80 gradi fino all'uso. Un gradiente di saccarosio vuoto mostra un'assorbanza di fondo a 260 nanometri dovuta alla presenza di DTT. Questo fondo può essere sottratto durante l'analisi dei dati al fine di normalizzare i valori del campione; i profili di cervello e midollo spinale, l'RNA mostra curve di assorbanza caratteristiche: gli mRNA legati alle subunità ribosomiali piccole sedimentano in frazioni più leggere, posizionandosi all'inizio del profilo.Successivamente seguono la subunità ribosomiale grande e gli mRNA legati a un singolo ribosoma; gli mRNA legati a più ribosomi sedimentano in frazioni successive. Il trattamento dei campioni con EDTA determina il collasso dei picchi di poliribosomi, dimostrando che il profilo di sedimentazione è dovuto alla traduzione. Altri metodi, come Ribot attack e trap, possono essere abbinati a questa tecnica per eseguire studi specifici per tipo cellulare sulla traduzione.Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurobiologia per esplorare il ruolo della regolazione della traduzione nello sviluppo neuronale e nelle malattie. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la frazionatura dei polisomi a partire da piccole quantità di tessuto del sistema nervoso centrale e purificare l'RNA per successive applicazioni a valle di tua scelta.

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