Dimostrazione di un multi-resistente ai farmaci Mycobacterium tuberculosis Amplificazione Microarray
25 aprile 2014
Un microarray amplificazione combina asimmetrica amplificazione PCR e ibridazione microarray in una sola camera, che semplifica significativamente workflow microarray per l'utente finale. La semplificazione del flusso di lavoro microarray è un primo passo necessario per la creazione di sistemi diagnostici basati su microarray, che possono essere utilizzati di routine in ambienti inferiore di risorse.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di genotipizzare il microbatterio tubercolosis multiresistente ai farmaci, utilizzando un microarray di amplificazione. Ciò si ottiene eseguendo una PCR asimmetrica multiplex sulla parte superiore di un microarray all'interno di una singola camera di reazione microfluidica. Lì il campione viene amplificato simultaneamente, etichettato per la dimensione, reso a singolo filamento e ibridato al microarray.
Successivamente, dopo che il microarray è stato lavato, un lettore mostra se è presente il microbatterio tubercolosi e se contiene una mutazione del DNA nota per conferire resistenza alla rifampicina iso, al niazi etambutolo o alla streptomicina. Il vantaggio di questo metodo rispetto ai metodi esistenti di ibridazione con sonda a linea di microarray o acido nucleico è che un microarray di amplificazione semplifica significativamente l'interazione dell'utente con il test. Tuttavia, pur fornendo la sensibilità analitica della PCR e la capacità di multiplexing di un microarray Per questa procedura, avere uno spazio di lavoro pulito pulito pulito con una soluzione decontaminante e avere acidi nucleici sufficientemente puri per la PCR multiplex.
Dopo aver scongelato e mescolato tutte le soluzioni stock, assemblare la miscela master PCR. Quando si prepara questa miscela, preparare almeno un volume extra di miscela per il test della tubercolosi mostrato qui. Inoltre, aggiungi extra T polimerasi alla miscela master.
Oltre alla quantità di tack fornita con i reagenti stock, miscelare un'aliquota di microlitro di DNA campione con 49 microlitri di master mix. Aggiungere con cautela 48 microlitri di ciascuna miscela di reazione al centro del microarray appropriato. Non toccare il microarray stesso.
Quindi coprire e sigillare accuratamente il microarray in modo improprio. L'applicazione del vetrino coprioggetti può introdurre bolle che possono portare ad artefatti, evaporazione, scarsa amplificazione o ibridazione non uniforme. Ognuna di queste condizioni può portare a un risultato errato.
Quindi, caricare il micro tasso nel termociclatore. Con i substrati contro il blocco termico, l'opzione del coperchio riscaldato deve essere disattivata. Per i laboratori che seguono le precauzioni universali della PCR, è più efficiente includere diversi microarray di amplificazione per vetrino ed elaborare più test contemporaneamente.
Ora, eseguire il programma di cicli termici appropriato. Questo programma ha 50 cicli di amplificazione, che possono sembrare elevati ma necessari a causa della popolazione di amplicone prevalentemente a singolo filamento creata dalla reazione. Al termine della reazione, rimuovere i microarray e spegnere il termociclatore.
Aprire con cautela la camera del microarray con il piatto e la pinza. Rimuovere lo slittamento, il coperchio e la guarnizione. Il microarray può essere danneggiato da questo passaggio, quindi fai attenzione in modo improprio.
La rimozione del gruppo guarnizione può causare danni fisici al microarray. Fare attenzione a non piegare o flettere il vetrino coprioggetto e fare molta attenzione per evitare di graffiare la superficie del microarray con la pinza, ora trasferire i substrati del microarray su un supporto per vetrini istologici. Immergere i substrati nel tampone di lavaggio per 10 minuti a temperatura ambiente con una leggera agitazione, seguire il bagno di soluzione di lavaggio con altri due o tre lavaggi, il tutto in acqua deionizzata.
Asciugare i microarray prima di procedere con l'imaging. A questo scopo è possibile utilizzare un leggero flusso di aria compressa in questa dimostrazione, i parametri sono specifici per il test MDR TB e un imager portatile da campo Econ DX 2100. Una luce blu sulla termocamera indica che è pronta.
Accendere il computer. Aprire il software di sistema fornito da un conni e attendere che il software annunci di aver stabilito una connessione con la fotocamera. Quindi, inserire il microarray essiccato nell'imager.
Con il microarray rivolto verso l'obiettivo e lontano dall'utente. Il software fornirà ora un'immagine di anteprima dal menu a discesa. Selezionare lo script di analisi MDR TB.
Immettere un tempo di esposizione compreso tra 100 e 500 millisecondi. Verranno letti i pixel sovraesposti. Regola l'esposizione per ridurli al minimo.
Quando la saturazione è impostata per ridurre al minimo la sovraesposizione, avviare l'analisi. Il software posiziona una griglia MDRT TB sui punteggi delle immagini, sui campioni e sulle intensità di fondo, quindi riporta i risultati della resistenza ai farmaci e della genotipizzazione. Una volta completata l'analisi e salvata, rimuovere il chip dall'imager e avviare una nuova sessione di analisi per analizzare l'array successivo.
Continuare l'analisi per ciascuno dei microarray elaborati. Salvataggio dei dati ogni volta. L'analisi qualitativa delle immagini può fornire informazioni sulle fonti di rumore sperimentale o sulla variabilità che è difficile da identificare nelle tabelle di dati generate dal software di analisi automatizzata delle immagini.
Qui si vede una matrice di alta qualità priva di artefatti. Diversi artefatti possono portare all'introduzione di bolle che creano aloni. Nonostante gli artefatti dell'array, il software recupererà comunque i valori dalla scansione.
Un algoritmo di segnalazione diagnostica, nonostante l'ottenimento di valori, riconoscerebbe questa matrice come non valida. Una serie di diluizione del DNA genomico wild type H 37 RA è stata utilizzata su un modello di PCR microarray a 6,25 picogrammi, l'equivalente di 1.250 cellule. Tutte le sonde sono state rilevate.
Un valore SNR superiore a tre è un risultato positivo e i valori registrati erano molto più alti. Successivamente, sono stati genotipizzati gli isolati di riferimento dell'Organizzazione Mondiale della Sanità. I polimorfismi a singolo nucleotide presenti sull'array sono stati rilevati come mutazione corrispondente nel genoma MDR TB.
Erano evidenti anche diversi esempi di rilevamento di mutazioni vicine vicine. Una discussione è fornita nel protocollo di testo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa tre ore e mezza o sei ore e mezza, a seconda della concentrazione di DNA, del test specifico, dell'efficienza e dell'uniformità del termociclatore e della sensibilità e specificità analitica o clinica desiderata.
Inoltre, il numero di cicli di amplificazione e i tempi di ibridazione post-amplificazione possono essere facilmente ridotti o allungati per ottenere le caratteristiche prestazionali desiderate.
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Panoramica
Questo studio presenta un nuovo metodo di microarray con amplificazione per il genotipaggio di Mycobacterium tuberculosis multiresistente. Integrando l'amplificazione PCR asimmetrica e l'ibridazione su microarray in un'unica camera, il flusso di lavoro viene notevolmente semplificato, risultando adatto ad ambienti con risorse limitate.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Genetica
- Diagnostica
Sfondo
- Il micobatterio Mycobacterium tuberculosis resistente a più farmaci rappresenta una sfida significativa per la salute pubblica.
- I metodi tradizionali per il rilevamento possono essere complessi e richiedere molte risorse.
- Esiste la necessità di metodi diagnostici semplificati nei contesti con risorse limitate.
- Questo studio esplora un nuovo approccio basato sull'uso di microarray di amplificazione.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per il genotipaggio del micobatterio tubercolare resistente a più farmaci.
- Semplificare l'interazione dell'utente con il test diagnostico.
- Combinare i processi di amplificazione e ibridazione in una singola reazione microfluidica.
Metodi Utilizzati
- PCR asimmetrica multiplex eseguita su un microarray.
- Amplificazione, marcatura, selezione per dimensione e ibridazione simultanee.
- Lavaggio del microarray dopo l'ibridazione.
- Utilizzo di un lettore per rilevare la presenza di Mycobacterium tuberculosis e delle mutazioni associate.
Risultati principali
- Il metodo di microarray per l'amplificazione semplifica il processo diagnostico.
- Mantiene la sensibilità analitica della PCR.
- Consente una capacità di multiplexing simile a quella dei microarray tradizionali.
- I risultati indicano una rilevazione efficace delle mutazioni responsabili della resistenza ai farmaci.
Conclusioni
- L'amplificazione con microarray è uno strumento promettente per la diagnostica della tubercolosi.
- Questo metodo potrebbe migliorare le capacità diagnostica in contesti con risorse limitate.
- Sono necessarie ulteriori validazioni e ottimizzazioni per un uso diffuso.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo di microarray per l'amplificazione semplifica la genotipizzazione della TBC-MDR integrando in un'unica camera microfluidica la PCR asimmetrica, l'etichettatura e l'ibridazione, riducendo i passaggi manuali e permettendo l'impiego in contesti con risorse limitate. L'approccio mantiene la sensibilità tipica della PCR, consentendo al contempo il rilevamento multiplex di mutazioni responsabili della resistenza, offrendo così una strada verso diagnosi semplificate e scalabili per la sorveglianza delle malattie infettive. Riducendo al minimo l'interazione dell'operatore e il tempo di elaborazione, questo metodo colma importanti lacune nei flussi di lavoro della microbiologia traslazionale, in cui velocità, riproducibilità e bassa dipendenza da infrastrutture sono essenziali per la validazione precoce del bersaglio e lo sviluppo di saggi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di bersagli genetici associati ai meccanismi di resistenza ai farmaci in Mycobacterium tuberculosis.
- Valore operativo: Supporta la verifica di ipotesi mediante la rilevazione multiplex di SNP in una singola reazione, riducendo la variabilità derivante dalla suddivisione del campione.
- Valore traslazionale: Fornisce un sistema rilevante per la patologia per valutare le mutazioni responsabili della resistenza, facilitando la riduzione del rischio meccanicistica nei programmi di bersaglio anti-infettivo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera segnali di ibridazione quantitativi che si correlano con varianti alleliche, consentendo la discriminazione specifica per alleli.
- Valore operativo: Combina amplificazione e rilevamento in un sistema chiuso, riducendo al minimo il rischio di contaminazione e migliorando la riproducibilità tra diversi lotti.
- Prontezza del saggio: Utilizza una miscela master asimmetrica 9-plex compatibile con array a bassa densità, dimostrando una moltiplicazione scalabile per pannelli di genotipizzazione di patogeni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Genotipizza direttamente ceppi di TBC-MDR utilizzando isolati di riferimento dell'OMS, garantendo la rilevanza clinica delle mutazioni rilevate.
- Conferma predittiva: Raggiunge un rapporto segnale-rumore (SNR) >3 come soglia di positività, fornendo un parametro quantitativo per la valutazione delle prestazioni del saggio.
- Continuità del flusso di lavoro: Produce risultati di genotipizzazione compatibili con algoritmi successivi di interpretazione della resistenza, favorendo l'allineamento traslazionale dei biomarcatori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fino a quelli preclinici, fornendo un risultato di genotipizzazione rapido e in sistema chiuso che orienta le decisioni di validazione del bersaglio e di ottimizzazione del composto leader nei programmi anti-infettivi.
- Biologia della scoperta: Permette l'analisi a livello di pathway dei meccanismi di resistenza rilevando multiple mutazioni in geni come rpoB, katG e embB.
- Screening: Consente il profilo ad alto rendimento di ceppi con tempi minimi di manipolazione manuale, supportando lo screening di isolati clinici o librerie sottoposte a mutagenesi.
- Analisi: Fornisce letture fluorescenti multiplex che quantificano l'efficienza di ibridazione, permettendo il confronto dell'abbondanza degli alleli mutanti in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Utilizza input di DNA clinicamente rilevanti (fino a 1.000 equivalenti di cellule), collegando test su campioni sintetici e derivati da pazienti.
- Riutilizzo aziendale: Il formato di microarray con amplificazione microfluidica è adattabile ad altri pannelli di patogeni, promuovendo il riutilizzo della piattaforma su diversi bersagli di malattie infettive.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nel genotipaggio della resistenza fornendo un rilevamento multiplex simultaneo delle mutazioni.
- Valore operativo: Elimina i passaggi separati di amplificazione e ibridazione, riducendo il tempo di manipolazione manuale e la variabilità tecnica.
- Valore strategico: Consente decisioni più rapide di tipo go/no-go nella validazione dell'obiettivo, fornendo profili di resistenza entro 6,5 ore.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione basata sul rischio di composti mirati a ceppi resistenti, grazie a un genotipaggio affidabile di isolati preclinici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di microfluidica e nell'ottimizzazione della PCR asimmetrica per mantenere l'uniformità dell'amplificazione.
- Richiede termociclatori con impostazioni del coperchio regolabili e lettori di fluorescenza compatibili per il rilevamento del punto finale.
- Necessita di protocolli di lavaggio standardizzati per prevenire il trasferimento incrociato tra run nelle modalità di elaborazione batch.
- Deve tenere conto dei limiti di compatibilità dei primer nelle miscele master multiplex, poiché il grado di multiplexing è vincolato dalla compatibilità delle coppie di primer, non dalla densità delle sonde.
- Le prestazioni sono sensibili alla qualità e alla concentrazione del DNA in ingresso, richiedendo un controllo di qualità del materiale genomico prima dell'amplificazione.
