Name: Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Impara a isolare e coltivare cellule staminali epiteliali dentali dal topo adulto. Questo metodo di microdissezione consente studi affidabili sulla rigenerazione dei tessuti dentali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori ringraziano Xiu-Ping Wang aiuto iniziale con culture DESC. Gli autori sono finanziati in parte da borse di studio e sovvenzioni dal National Institutes of Health (K99-DE022059 a AHJ, K12-GM081266 a MGC, K08-DE022377-02 a OH e R01-DE021420 a ODK).

1. Sezionare inferiori Hemi-mandibole di topo adulto <ol><li> Prima di eseguire questo protocollo, avere necessaria l&#39;approvazione istituzionale ed essere sicuri di rispettare tutte le linee guida per la cura degli animali. Euthanize animale utilizzando lo standard IACUC procedure approvate. Per questo lavoro CO 2 asfissia stato usato seguita da dislocazione cervicale. <ol><li> OPTIONAL: testa separata dal resto del corpo utilizzando una lama di rasoio. </li></ol></li><li> Togliere la pelle dal labbro inferiore per la scollatura. </li><li> Usando un bisturi, fare un&#39;incisione tra i due incisivi inferiori, che sono vagamente collegati. Dopo l&#39;applicazione di pressione, la mandibola sarà diviso in due metà. </li><li> Incuneare il bisturi tra il condilo della mandibola e dell&#39;articolazione mandibolare temporale e tagliare lungo il massetere per staccare la mascella. </li><li> Rimuovere tutti i muscoli, tendini e legamenti fino a che solo l&#39;osso rimane. </li></ol> 2. Isolare la Incisor <ol><li> Usando un bisturi # 15, Radere accuratamente l&#39;osso con un angolo di 45 ° dall&#39;estremità distale all&#39;estremità prossimale della regione membranosa. Utilizzare la punta del bisturi per raccogliere via qualsiasi osso residuo compresi i frammenti ossei sul bordo. Lentamente inizia a raccogliere via alla piastra corticale linguale della mandibola, partendo appena sotto il 3 ° molare. </li><li> Continuare fino a quando l&#39;incisivo è pulito, lavorando con attenzione verso la zona contenente la CL. </li><li> Rimuovere inferiore fascio nervo alveolare. </li><li> Fare un taglio netto prima rimuovere l&#39;osso e tessuti prossimale al CL. </li><li> Fare un secondo taglio distale con il bisturi, più o meno sotto il molare 2 °. La regione degli incisivi prossimale è poi sezionato inserendo il bisturi tra l&#39;osso e la superficie mediale dell&#39;incisivo prossimale. Questo deve essere fatto con attenzione, in modo da non strappare il tessuto. Il movimento incisione è prossimale-distale. PASSO ALTERNATIVA: Rimuovere il più possibile osso lungo la zona sopra il incisor. Una zona è azzerato, rimuovere con attenzione tutta la incisivo utilizzando una dimensione di 5 pinze per gestire la porzione di smalto più vicino alla regione CL. </li><li> Posizionare il tessuto sezionato (sia CL isolato come in Figura 3E, o intero incisivo della Fase alternativa 2.5) in 2% di collagenasi in 1X PBS per 3-4 ore a 4 ° C in una piastra bassa aderenza. Per 1-10 incisivi, utilizzare 100 microlitri per pozzetto in una piastra 12 pozzetti. Per maggiore di 10 incisivi, utilizzare 500 microlitri per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti bassa aderenza. </li></ol> 3. Microdissect il Labial cervicale Loop <ol><li> Rimuovere regione CL dal collagenasi e il luogo in mezzi DMEM/F12 freddo. </li><li> Tirare leggermente all&#39;estremità inferiore del CL utilizzando dimensioni 5 pinze o una siringa da insulina (1 cc, 28 G ½); mesenchima cadrà a pezzi, mentre l&#39;epitelio rimane intatto. Il CL e l&#39;epitelio adiacente che si estende lateralmente come una struttura &quot;ad ala&quot; saranno visibili. </li><li> Rimuoveregemma apicale dall&#39;epitelio adiacente facendo un&#39;incisione a V su entrambi i lati, e collocare immediatamente in DMEM/F12 freddo su ghiaccio. </li><li> Ripetere per tutti i CL, raccogliere in 1,5 ml provetta per microcentrifuga. </li><li> Spin down provetta per microcentrifuga con campioni, rimuovere i supporti, sostituirli con 100 microlitri soluzione distacco delle cellule. </li><li> Incubare tessuti in soluzione distacco delle cellule per 30 min a 37 ° C. </li><li> Dissociare i tessuti a produrre una sospensione singola cella pipettando gentilmente su e giù con un 1.000 ml a bassa aderenza punta della pipetta. Le cellule possono anche essere immessi attraverso un colino cellula sterile per ottenere dissociazione. </li><li> Contare le cellule con emocitometro, sulla piastra di coltura tissutale di plastica o altro materiale desiderato. </li></ol> 4. Cultura primaria di desc <ol><li> Cellule piastra in una piastra da 6 pozzetti a 1-6 x 10 4 cellule / ml in mezzi desc, che consiste DMEM/F12 addizionato con il mouse EGF proteina ricombinante ad una concentrazione di 20 ng / ml, FGF proteina ricombinante ad una concentrazione di 25 ng / ml, 1X B27 supplemento, e la soluzione 1% di antibiotici (penicillina, 100 U / ml, streptomicina, 50 pg / ml). </li><li> Crescere cellule piastrate su una piastra da 6 pozzetti a 37 ° C in 5% CO 2 in 1 ml di DECR media. Non disturbare culture iniziali per 5 giorni dopo placcatura per consentire l&#39;adesione cellulare e la formazione di colonie. </li><li> Per la prima modifica di supporto, sostituire la metà del volume (500 ml) di vecchi media con metà del volume (500 ml) di nuovi media. Controllare colonie sotto il microscopio quando si cambia supporto. </li><li> Dopo il primo cambio media, continuerà a cambiare media (1-2 ml) ogni 2 giorni. Controllare colonie sotto il microscopio quando si cambia supporto. </li></ol> 5. Desc Passage <ol><li> Aspirare il terreno e lavare le cellule 3x con pre-riscaldato PBS. </li><li> Aggiungere preriscaldata 0,25% tripsina-EDTA in soluzione salina e incubare a 37 ° C per 10-15 min per le desc da staccare. </li><li> Aggiungi mezzi DESC per neutralizzare la tripsina, pipettare delicatamente lungo il tessuto piastra di coltura per raccogliere le cellule, e posto in una provetta da 15 ml. </li><li> Spin le cellule a 800 xg per 2 minuti. </li></ol>

<ol><li>Sharpe, P. T., Young, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Test-tube+teeth.%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Am%22%5BJournal%5D)">Test-tube teeth.</a> Sci Am. 293, 34-41 (2005).</li>
<li>D'Souza, R. N., Klein, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+molecular+mechanisms+that+lead+to+supernumerary+teeth+in+mice+and+men%3A+Current+concepts+and+novel+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Unraveling the molecular mechanisms that lead to supernumerary teeth in mice and men: Current concepts and novel approaches.</a> Cells Tissues Organs. 186, 60-69 (2007).</li>
<li>Jernvall, J., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tooth+shape+formation+and+tooth+renewal%3A+evolving+with+the+same+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tooth shape formation and tooth renewal: evolving with the same signals.</a> Development. 139, 3487-3497 (2012).</li>
<li>Yen, A. H., Yelick, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+Tissue+Regeneration+A+Mini-Review%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">Dental Tissue Regeneration A Mini-Review.</a> Gerontology. 57, 85-94 (2011).</li>
<li>Jheon, A. H., Seidel, K., Biehs, B., Klein, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+molecules+to+mastication%3A+the+development+and+evolution+of+tooth+development%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">From molecules to mastication: the development and evolution of tooth development.</a> WIREs Dev Biol. 2, 165-182 (2013).</li>
<li>Wang, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+gene+regulatory+network+controls+stem+cell+proliferation+in+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">An integrated gene regulatory network controls stem cell proliferation in teeth.</a> PLoS Biol. 5, (2007).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> J Cell Biol. 147, 105-120 (1999).</li>
<li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2%2B+stem+cells+contribute+to+all+epithelial+lineages+of+the+tooth+via+Sfrp5%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors.</a> Dev Cell. 23, 317-328 (2012).</li>
<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+regulates+the+generation+of+ameloblast+progenitors+in+the+continuously+growing+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor.</a> Development. 137, 3753-3761 (2010).</li>
<li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+renewal+in+the+enamel+organ+and+the+odontoblast+layer+of+the+rat+incisor+as+followed+by+radioautography+using+3H-thymidine%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine.</a> Anat Rec. 183, 523-561 (1975).</li>
<li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+cell+turnover+in+the+enamel+organ+of+the+rat+incisor.+Evidence+for+ameloblast+death+immediately+after+enamel+matrix+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of cell turnover in the enamel organ of the rat incisor. Evidence for ameloblast death immediately after enamel matrix secretion.</a> Anat Rec. 187, 63-98 (1977).</li>
<li>Parsa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+by+FGFR2b+controls+the+regenerative+capacity+of+adult+mouse+incisors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Signaling by FGFR2b controls the regenerative capacity of adult mouse incisors.</a> Development. 137, 3743-3752 (2010).</li>
<li>Chang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+multilineage+differentiation+of+mouse+dental+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and multilineage differentiation of mouse dental epithelial stem cells.</a> Stem Cell Res. 11, 990-1002 (2013).</li>
<li>Biehs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+represses+Ink4a%2FArf+and+Hox+genes+to+regulate+stem+cells+in+the+rodent+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bmi1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor.</a> Nat Cell Biol. 15, 846-852 (2013).</li>
<li>Hwang, W. S., Tonna, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoradiographic+Analysis+of+Labeling+Indices+and+Migration+Rates+of+Cellular+Component+of+Mouse+Incisors+Using+Tritiated+Thymidine+%28H3tdr%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Autoradiographic Analysis of Labeling Indices and Migration Rates of Cellular Component of Mouse Incisors Using Tritiated Thymidine (H3tdr).</a> J Dent Res. 44, 42-53 (1965).</li>
<li>Li, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+regulates+the+behavior+and+fate+of+epithelial+stem+cells+and+their+progeny+in+the+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">E-cadherin regulates the behavior and fate of epithelial stem cells and their progeny in the mouse incisor.</a> Dev Biol. 366, 357-366 (2012).</li>
<li>Smith, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+chemical+events+during+enamel+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oral+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular and chemical events during enamel maturation.</a> Crit Rev Oral Biol Med. 9, 128-161 (1998).</li>
<li>Lapthanasupkul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ring1a%2Fb+polycomb+proteins+regulate+the+mesenchymal+stem+cell+niche+in+continuously+growing+incisors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ring1a/b polycomb proteins regulate the mesenchymal stem cell niche in continuously growing incisors.</a> Dev Biol. 367, 140-153 (2012).</li>
<li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+mouse+incisor+with+two-dimensional+and+three-dimensional+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of dental epithelial stem cells from the mouse incisor with two-dimensional and three-dimensional platforms.</a> Tissue Eng Part C Methods. 19, 15-24 (2013).</li>
<li>Kawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+dental+epithelial+cell+line+%28HAT-7%29+and+the+cell+differentiation+dependent+on+Notch+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway.</a> Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).</li>
<li>Briggaman, R. A., Abele, D. C., Harris, S. R., Wheeler, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+a+viable+suspension+of+postembryonic+human+epidermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of a viable suspension of postembryonic human epidermal cells.</a> J Invest Dermatol. 48, 159-168 (1967).</li>
<li>Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+epidermal+cells+from+embryonic+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of epidermal cells from embryonic mouse skin.</a> Naturwissenschaften. 58, 421 (1971).</li>
<li>Fusenig, N. E., Worst, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+epidermal+cell+cultures.+I.+Isolation+and+cultivation+of+epidermal+cells+from+adult+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Mouse epidermal cell cultures. I. Isolation and cultivation of epidermal cells from adult mouse skin.</a> J Invest Dermatol. 63, 187-193 (1974).</li>
<li>Rheinwald, J. G., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+cultivation+of+strains+of+human+epidermal+keratinocytes%3A+the+formation+of+keratinizing+colonies+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells.</a> Cell. 6, 331-343 (1975).</li>
<li>Barrandon, Y., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+clonal+types+of+keratinocyte+with+different+capacities+for+multiplication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 2302-2306 (1987).</li>
<li>Blanpain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal%2C+multipotency%2C+and+the+existence+of+two+cell+populations+within+an+epithelial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche.</a> Cell. 118, 635-648 (2004).</li>
<li>Toma, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+multipotent+adult+stem+cells+from+the+dermis+of+mammalian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin.</a> Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).</li>
<li>Nowak, J. A., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of epithelial stem cells.</a> Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).</li>
<li>Rheinwald, J. G., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+and+the+multiplication+of+cultured+human+epidermal+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes.</a> Nature. 265, 421-424 (1977).</li>
<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).</li>
<li>Lesuisse, C., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+mouse+cortical+neurons+as+a+model+for+neuronal+development%2C+aging%2C+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death.</a> J Neurobiol. 51, 9-23 (2002).</li>
<li>Felszeghy, S., Suomalainen, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+is+required+for+the+survival+of+epithelial+stem+cells+in+the+continuously+growing+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Notch signalling is required for the survival of epithelial stem cells in the continuously growing mouse incisor.</a> Differentiation. 80, 241-248 (2010).</li>
<li>Fujimori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+the+dental+mesenchyme+regulates+incisor+development+by+regulating+Bmp4%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling in the dental mesenchyme regulates incisor development by regulating Bmp4.</a> Dev Biol. 348, 97-106 (2010).</li>
<li>Klein, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+FGF+signaling+loop+sustains+the+generation+of+differentiated+progeny+from+stem+cells+in+mouse+incisors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An FGF signaling loop sustains the generation of differentiated progeny from stem cells in mouse incisors.</a> Development. 135, 377-385 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Le cellule epiteliali erano di prima con successo coltivate oltre 40 anni fa 21-24 e, più recentemente, di successo isolamento di cellule staminali epiteliali 25-27 ha avanzato la nostra conoscenza della biologia epiteliale. Riportiamo un protocollo per isolare la desc dell&#39;incisivo topo adulto, una popolazione relativamente poco studiato delle cellule staminali che ha il potenziale per produrre importanti intuizioni in biologia dentale e la formazione dello smalto. Questo protocollo è stato in...

Una delle caratteristiche uniche di vertebrati è l&#39;evoluzione dei denti. Il dente è diventato un importante sistema modello per molte aree di ricerca, come le vie molecolari e specializzazioni morfologiche relativi a questo organo sono stati indagati da diverse prospettive, anche biologi dello sviluppo ed evolutivi 5. Più recentemente, il campo della medicina rigenerativa ha iniziato a ottenere preziose informazioni utilizzando il dente come modello. In particolare, la scoperta delle cellule staminali epiteliali Dental è un importante progresso 6-13. Tutti i roditori possiedono incisivi in ​​continua crescita la cui crescita è alimentata dalle cellule staminali, rendendo questi denti di un sistema modello accessibile a studiare regolamento sulle cellule staminali adulte. Esperimenti di etichettatura nel 1970 10,11, seguita da lignaggio genetico esperimenti di tracciamento 8,9,12,14, hanno dimostrato che desc risiedono nella regione prossimale del incisivo. Lo steloprogenie di cellule nel compartimento epiteliale sul lato labiale mossa dalla nicchia putativo, noto come il ciclo cervicale labiale (CL), e contribuire ad una popolazione di cellule chiamate transito amplificando (TA) cellule (Figura 1). In particolare, desc risiedono nell&#39;epitelio esterno dello smalto (OEE) e stellate reticolo (SR) 8,9,14, e lo smalto epitelio interno (IEE) dà origine alle cellule TA che il progresso attraverso un numero limitato di cicli cellulari e poi mossa distalmente lungo la lunghezza della incisivo (Figura 1). Le ameloblasts differenziazione nel incisivo topo continuano a muoversi distalmente lungo l&#39;incisivo ad un tasso notevole di circa 350 micron in un solo giorno 15,16. Come si muovono, le cellule si differenziano in ameloblasts maturi e strato e transizione (SI) cellule. Dopo aver depositato l&#39;intero spessore della matrice dello smalto, molti dei ameloblasts subiscono apoptosi, e le cellule rimanenti ridursi in dimensione e regolare smalto maturazione &lt;sup&gt; 17. La stirpe degli altri tipi di cellule del labiale CL, come la SR, è meno chiaro, e dati relativi alle cellule staminali nel mesenchima 18 e nella linguale CL stanno solo iniziando a emergere. Utilizzando il modello incisivo del mouse, un certo numero di gruppi hanno lavorato per chiarire i percorsi genetici e cellulari processi biologici coinvolti nella naturale a base di cellule staminali rinnovo dell&#39;organo. Tuttavia, il labiale CL contiene un numero relativamente piccolo di cellule, stimato in circa 5.000 a incisivo mouse, che rende il lavoro con cellule primarie impegnativo. Pertanto, gli sforzi sono stati fatti per la cultura ed espandere queste cellule in vitro 6,16,19,20 per aprire nuove porte per approcci sperimentali che non sono realizzabili in vivo. Lo studio più recente ha dimostrato che queste cellule possono sia auto-rinnovarsi e di differenziarsi in cellule che esprimono amelogenin quando coltivate 13. Qui, descriviamo e dimostrare un metodo per ªe cultura affidabile e coerente delle cellule dal labiale del mouse CL.

<table><tbody><tr><td>Pinze, misura 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>FST di Dumont, Dumoxel</td></tr><tr><td>Pinze dritte, fini, 3,5</td><td>Roboz</td><td>RS5070</td><td></td></tr><tr><td>Lame di rasoio Servizi</td><td>di microscopia elettronica</td><td>#71960</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi n. 3</td><td>Lama di piuma VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>n. 15</td><td>Servizi di microscopia elettronica</td><td>#72044-15</td><td>Chirurgico Acciaio inossidabile</td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo 1 filtrata</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td> <td># 4214</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina</td><td>BD</td> <td># 329424</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>EMD Millipore</td><td>#SCR006</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R & D</td><td>2028-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R& D</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplemento</td><td>Gibco</td><td>10889-038</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e cultura della dental epiteliali cellule staminali del topo adulto incisor

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

La comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari che sono alla base di rigenerazione del dente e di rinnovamento è diventato un argomento di grande interesse 1-4, e l&#39;incisivo del mouse fornisce un modello per questi processi. Questo notevole organo cresce continuamente per tutta la vita dell&#39;animale e genera tutti i tipi di cellule necessarie dal pool attivi di cellule staminali adulte ospitate nella labiale (verso il labbro) e linguale (verso la lingua) ciclo cervicale (CL) le regioni. Solo le cellule staminali dentarie dal labiale CL danno luogo a ameloblasts che generano smalto, il rivestimento esterno dei denti, sulla superficie labiale. Questa formazione smalto asimmetrico permette all&#39;abrasione sulla punta degli incisivi, e progenitori e cellule staminali nel incisivo prossimale garantire che i tessuti dentali sono costantemente rifornite. La capacità di isolare e coltivare cellule progenitrici o staminali in vitro permette loro espansione e apre porte a numerosi esperimenti non realizzabili in vivo, come high velocità sperimentazione delle potenzialità delle cellule staminali fattori regolatori. Qui, descriviamo e dimostrare un metodo affidabile e coerente per le cellule di coltura dalla CL labiale dell&#39;incisivo mouse.

Il mouse emi-mandibola comprendere una continua crescita incisivo e tre molari radicate (Figura 1A). Tutti i denti sono costituiti da smalto e dentina, i due componenti mineralizzate della corona del dente (Figure 1A e 1A &#39;). Le case incisivi due nicchie staminali chiamato il labiale e linguale CL CL, e smalto è formato esclusivamente sul lato labiale (Figura 1A &#39;). Desc sono responsabili della formazione incisivo smalto e sono alloggiati nella ...

Il mouse in continua crescita incisivo fornisce un modello per lo studio rinnovamento dei tessuti dentali da cellule staminali epiteliali dentali (desc). Un sistema robusto per modo coerente e affidabile l&#39;ottenimento di tali cellule dal incisivo e in espansione in vitro è riportato qui.

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere cellule per la coltura dall'incisivo del mouse, specificamente dal labiale del ciclo cervicale, in modo affidabile e riproducibile. Questo risultato si ottiene innanzitutto dissezionando l'emimandibola inferiore dal mouse adulto e rimuovendo l'osso che ricopre la regione del ciclo cervicale. Il secondo passaggio consiste nell'isolare la regione del ciclo cervicale e separare il mesenchima dall'epitelio.Successivamente, il colletto cervicale viene microdissecato. L'ultimo passaggio consiste nel dissociare e quindi coltivare le cellule epiteliali isolate. In definitiva, questo video ha lo scopo di mostrare la procedura corretta per l'isolamento efficace delle cellule dal colletto cervicale labiale.La procedura sarà dimostrata da me stesso, dai postdoc Kirsten, SEL e Jimmy Hu e da ing Lee, un membro della facoltà ospite presso il laboratorio Klein. Dopo l'eutanasia dell'animale, rimuovere la pelle dal labbro inferiore fino alla linea del collo. Quindi utilizzare un bisturi per praticare un'incisione tra i due incisivi inferiori, che sono collegati in modo lasso.Applicando pressione, la mandibola si dividerà in due metà. Successivamen

isolation-culture-dental-epithelial-stem-cells-from-adult-mouse

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Un modo rapido, robusto di isolare vitali cellule staminali epiteliali adulte di pelle umana è descritta. Il metodo utilizza la digestione enzimatica della matrice di collagene della pelle, seguita da spiumatura dei follicoli piliferi e l'isolamento delle sospensioni singola cella o frammenti di tessuto per la coltura cellulare.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

Il metodo descritto l'isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali dentali umane Pulp (hDPSCs)...

Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

Il metodo di coltura degli organi di tipo Trowell è stato utilizzato per svelare complesse reti di segnalazione che governano lo sviluppo dei denti e, più recentemente, per studiare la regolazione coinvolta nelle cellule staminali dell'incisivo di topo in continua crescita. I modelli animali fluorescenti e i metodi di imaging dal vivo facilitano analisi approfondite delle cellule staminali dentali e del loro specifico microambiente di nicchia.

Uso della coltura di organi di tipo Trowell per studiare la regolazione delle cellule staminali dentali

Questo protocollo presenta un metodo per la coltura e la crescita 3D di cellule simili agli ameloblasti in microgravità per mantenere la loro forma allungata e polarizzata e l'espressione proteica specifica dello smalto. Sono inoltre descritte le condizioni di coltura per la coltura dei costrutti di ingegneria parodontale e degli organi polmonari in microgravità.

Propagazione di cellule e organi dentali e respiratori in microgravità

Il presente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di cheratinociti orali derivati dal palato del topo adulto. Viene anche riportato un metodo di valutazione che utilizza l'immunocolorazione.

Isolamento e coltura di cheratinociti orali primari dal palato del topo adulto

Qui presentiamo un metodo modificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali gengivali umane aggiungendo l'inibitore della roccia, Y-27632, al metodo tradizionale. Questo metodo è più semplice, richiede meno tempo, migliora le proprietà delle cellule staminali e produce un numero maggiore di cellule epiteliali ad alto potenziale sia per il laboratorio che per le applicazioni cliniche.

Isolamento e coltura di cellule epiteliali gengivali umane primarie utilizzando Y-27632

L'attuale protocollo presenta un metodo veloce, efficiente e delicato per isolare singole cellule adatte per l'analisi RNA-seq a singola cellula da un incisivo di topo in continua crescita, molare di topo e denti umani.

Isolamento rapido di singole cellule da denti di topo e umani

Il follicolo dentale contiene una popolazione epiteliale e cellule mesenchimali. La popolazione epiteliale è stata selezionata dalla popolazione eterogenea di cellule follicolari dentali fornendo un terreno di coltura distinto. Le cellule epiteliali sopravvissero e formarono colonie in un mezzo privo di siero.

Isolamento delle cellule epiteliali dal follicolo dentale umano

Presentiamo un protocollo per sviluppare colture organoidi epiteliali a partire dal dente umano. Gli organoidi sono robustamente espandibili e ricapitolano le cellule staminali epiteliali del dente, compresa la loro capacità di differenziazione degli ameloblasti. L'esclusivo modello organoide fornisce uno strumento promettente per studiare la biologia dentale umana (cellule staminali) con prospettive per approcci rigenerativi dei denti.

Stabilire gli organoidi dal dente umano come un potente strumento verso la ricerca meccanicistica e la terapia rigenerativa

L'incisivo del topo contiene preziose cellule che conservano l'etichetta nella sua nicchia di cellule staminali. Abbiamo un nuovo modo per rilevare e quantificare in modo imparziale le celle che conservano l'etichetta; il nostro studio ha utilizzato l'etichettatura EdU e un approccio di ricostruzione 3D dopo la pulizia del tessuto PEGASOS della mandibola.

Rilevamento e quantificazione delle cellule che conservano l'etichetta negli incisivi di topo utilizzando un approccio di ricostruzione 3D dopo la pulizia dei tessuti

L'imaging dal vivo ex vivo è una potente tecnica per studiare i processi dinamici dei movimenti e delle interazioni cellulari nei tessuti viventi. Qui, presentiamo un protocollo che implementa la microscopia a due fotoni per tracciare in tempo reale le cellule epiteliali dentali in incisivi di topo adulti interi in coltura.

Utilizzo dell'imaging dal vivo ex vivo per studiare le divisioni e i movimenti cellulari durante il rinnovamento dentale del topo

Impara a isolare e coltivare cellule staminali epiteliali dentali dal topo adulto. Questo metodo di microdissezione consente studi affidabili sulla rigenerazione dei tessuti dentali.

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Esplora altri video