Name: Istituzione di un In Vitro Modello di Rat barriera emato-encefalica (BBB): A Focus on BBB impermeabilità e Trasporti recettore-mediata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 26 s
Description: Impara a stabilire un modello in vitro della barriera emato-encefalica del ratto utilizzando co-culture di cellule endoteliali e astrociti. Questo metodo consente di studiare la permeabilità e i meccanismi di trasporto per la ricerca farmacologica.

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Sostegno finanziario alle VECT-HORUS è riconosciuta dal Fonds unico interministeriale (progetto FUI / MEDUL) e vect-HORUS e il laboratorio UMR7259 dalla Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC e PREVENTAD progetti di collaborazione) . Il laboratorio UMR7259 riconosce anche il sostegno finanziario del CNRS e da Aix-Marseille Université.

1. Produzione di Rat astrociti Per ogni preparazione utilizzare 10 neonatali ratti Wistar di entrambi i sessi. <ol><li> Sacrifica i ratti tagliando la testa con un paio di forbici e trasferire immediatamente in una capsula di Petri asciutto sotto una cappa a flusso laminare. Rimuovere il cervello dal cranio, senza il cervelletto e trasferire immediatamente in una capsula di Petri contenente tampone dissezione a freddo: HBSS integrato con 1% di sieroalbumina bovina (basso livello di endotossine BSA), penicillina 100 unità / ml e streptomicina 100 pg / ml. </li><li> Tagliare il cervello a metà, per separare i due emisferi cerebrali e trasferirli in un piatto di Petri pulita con buffer di dissezione su ghiaccio. Tagliare il nervo ottico e togliere le meningi sotto uno stereomicroscopio. </li><li> Lavare le parti corticali estesamente in 50 ml di tampone di dissezione a freddo. </li><li> Mettere i pezzi corticali da 3 cervelli in una provetta Falcon 15 ml e dissociare pipettando su e giù un colpo di statoLe volte con 10 ml pipetta monouso provvisto di punta blu in 6 ml di tripsina 0,05% - EDTA 0,02% per 5 min a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 24 ml di DMEM supplementato con 10% FBS e seguenti antibiotici, penicillina 100 unità / ml e streptomicina 100 pg / ml, un supporto multimediale denominato cellule gliali (GCM) e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Lotti FBS sono stati selezionati e validati per la crescita e la sopravvivenza di cutures astrociti. </li><li> Risospendere il pellet contenente le cellule dissociate in 10 GCM ml e la piastra in 75 cm 2 T-pallone (T75). Cambiare il mezzo giorno successivo per rimuovere i detriti cellulari e DNA. Sostituire la cultura dei media due volte a settimana. </li><li> Dopo 1 settimana di proliferazione, scuotere delicatamente le cellule gliali con un agitatore orbitale a 60 giri al minuto per 24 ore a 37 ° C in GCM. Se il T75 non può essere collocato in un incubatore con il 5% di CO 2/95% aria a 37 ° C ambiente umidificato, integrare il supporto con 5 mM HEPES. Lavare le cellule due volte per rTogliete le cellule microgliali non aderenti. </li><li> Tre settimane dopo la semina, lavare le cellule due volte con DPBS senza calcio e magnesio. Aggiungere 3 ml di tripsina 0,05% warm-EDTA 0,02%, incubare a 37 ° C e attendere che lo strato di cellule viene disperso (solitamente 5 min). Inibire l&#39;attività della tripsina aggiungendo 10 ml di GCM, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml Falcon e centrifugare a 120 xg per 8 min. </li><li> Risospendere il pellet astrociti nel 90% FBS - 10% DMSO, trasferirli in cryovials (2 x 10 6 cellule per esageratamente) e conservare in azoto liquido. </li></ol> 2. Isolamento di cervello di ratto microvasi Le nostre procedure sperimentali sono approvati dal Comitato Etico della Facoltà di Medicina di Marsiglia e conformi alle normative nazionali ed europee (direttiva UE n ° 86/609). Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza degli animali e ridurre il numero di animali utilizzati. <ol><li> Per ogni preparazione e per una Experimenter, utilizzare 3 cinque settimane ratti Wistar. </li><li> Lunedi della prima settimana, preparare 2 palloni T75 rivestendo con collagene di tipo IV e fibronectina, sia a 1 mg / cm 2 in acqua coltura sterile (10 ml per T75). Lasciare aderire a 37 ° C fino microvasi seeding. </li><li> Mercoledì mattina della prima settimana, i ratti eutanasia sotto un flusso crescente di CO 2 per indurre sonnolenza, perdita di postura e respirazione interruzione, seguita da una dislocazione cervicale. Spruzzare le teste con il 70% di etanolo. Tagliare le teste con un paio di forbici e trasferirli in una capsula di Petri asciutto sotto una cappa a flusso laminare. </li><li> Rimuovere il cervello dal cranio senza il cervelletto e dei nervi ottici, poi trasferirli in una capsula di Petri raffreddata su ghiaccio e riempita con tampone di dissezione a freddo (HBSS supplementato con 1% BSA, penicillina 100 unità / ml e streptomicina 100 mg / ml) . </li><li> Tagliare il cervello a metà per separare i due emisferi cerebrali e mesencefalo separati da perebrain. Trasferire le forebrains in un piatto pulito Petri su ghiaccio con tampone di dissezione. </li><li> Prendete un paio di emisferi in un nuovo piatto di Petri con tampone dissezione a freddo per rimuovere con attenzione le meningi dal forebrains allo stereomicroscopio con N ° 5 pinze curve. Poi, pulire l&#39;interno del cervello per rimuovere il piumone di mielina e ottenere un guscio di corteccia. Questi passaggi non devono assumere più di 2 ore per la conservazione dei tessuti e la sopravvivenza cellulare. </li><li> Dissociare la corteccia da 3 cervelli in 6 ml di tampone dissezione a freddo in un 7 ml Dounce omogeneizzatore da 10 in su e giù colpi con ciascuno dei due pestelli di diverse liberatorie, 71 micron seguita da 20 micron. </li><li> Dividere la sospensione per ottenere l&#39;equivalente di 1 corteccia in 1 ml di un tubo da 50 ml Falcon e centrifugare a 1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante. </li><li> Digerire la sospensione da 1 corteccia con 1 ml di una soluzione enzimatica contenente una miscela di collagenasi / dispasi (60 mcg / ml R11; 0,3 U / ml), DNasi tipo I (35 mg / ml - 20 K unità / ml) e gentamicina (50 mg / ml) in un agitatore per 30 min a 37 ° C. </li><li> Mescolare il 1 digest ml da 1 corteccia con 10 ml di 25% BSA / HBSS 1X e separata dalla densità centrifugazione dipendente a 3.600 xg per 15 minuti a temperatura ambiente. Trasferire con cautela il disco superiore (mielina e cervello parenchima) e il surnatante in un ambiente pulito 50 ml tubo Falcon e ripetere la centrifugazione. Mantenere il pellet risultante contenente i microvasi cerebrali a 4 ° C. </li><li> Eliminare attentamente il disco superiore e il surnatante. Risospendere entrambi i pellets risultanti contenenti i microvasi cerebrali con 1 ml di freddo HBSS 1X e trasferire in un ambiente pulito 50 ml tubo Falcon. </li><li> Lavare microvasi per aggiunta di 20 ml di HBSS 1X freddo e centrifugare a 1000 xg per 5 min. Scartare il surnatante. </li><li> Ulteriori digerire i microvasi da 1 corteccia di 1 ml della stessa soluzione enzimatica come descritto al punto 2.9 per 1 ora a 37 ° C in un shAker. </li><li> Poi, mescolare i microvasi digeriti da ciascuno dei 3 cortecce in una provetta e in seguito separare in due provette Falcon da 50 ml avere microvasi estratti da l&#39;equivalente di uno e mezzo (1,5) corteccia per provetta. Aggiungere 30 ml di tampone di dissezione a freddo e centrifugare a 1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere il pellet microvasi in 10 ml di DMEM/F12 addizionato con siero bovino 20% plasma povero di piastrine derivato, fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF, 2 ng / ml), eparina (100 mcg / ml), gentamicina (50 mg / ml) e HEPES (2,5 mm), denominato supporti cellule endoteliali (ECM) integrata con puromicina a 4 mg / ml. </li><li> Prendete i due palloni T75 rivestite dal termostato, aspirare l&#39;eccesso di rivestimento e piastra microvasi da ogni provetta in un pallone T75 (microvasi estratti da 1,5 corteccia per bombola T75). </li></ol> 3. Purificazione e proliferazione delle RBEC Primocultures <ol><li> Purificazione: Mercoledì a Venerdì, aggiungere puromycin a 4 mg / ml per terreni di coltura. Modificare il supporto su Giovedi. Venerdì scorso, lavare le cellule e aggiungere puromicina a 2 mg / ml fino a Lunedi. </li><li> Proliferazione: il Lunedi della seconda settimana, lavare le cellule e aggiungere insulina, transferrina e supplemento selenite di sodio al terreno di coltura fino a quando le culture raggiungono il 90% di confluenza il Mercoledì della seconda settimana. </li></ol> . 4 Differenziazione: Impostazione del modello in vitro BBB <ol><li> Lunedi della seconda settimana, preparare filtri (polietilene, 12 pozzi, dimensione dei pori 1.0 micron), rivestendo con un mix di collagene di tipo IV e fibronectina sia a 0.5μg/cm 2 in acqua coltura sterile (500 ml di mix nel vano superiore e 1,5 ml di acqua sterile cultura nel vano inferiore). Lasciare aderire a 37 ° C fino RBEC seeding. </li><li> Lunedi della seconda settimana, cinque giorni prima della costituzione della co-coltura, scongelare gli astrociti da cryovials a 37 ° C e il trasferimentoin 15 ml Falcon da 10 ml GCM. Centrifugare la sospensione a 120 xg per 8 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere il pellet in astrociti GCM e piastra ad una densità di 30 x 10 3 cellule per cm 2 in piastre da 12 pozzetti. </li><li> Mercoledì della seconda settimana, poco prima dissociazione di RBEC con tripsina, lavare due volte il filtro pre-rivestito con mezzo DMEM/F12. Pre-riempire le camere con ECM: 1,5 ml nel vano inferiore e 0,5 ml nel compartimento superiore. </li><li> Mercoledì della seconda settimana, lavare due volte la RBEC con DPBS senza calcio e magnesio. Aggiungere 4 ml di tripsina caldo 0,05% - EDTA soluzione 0,02% a 37 ° C al pallone T75 durante 30 sec esattamente. Quindi rimuovere 3,5 ml di soluzione di tripsina e osservare al microscopio. Quando lo strato di cellule inizia a staccarsi dalla matrice, aiutarli agitando leggermente il bordo del pallone T75 fino a quando tutte le celle sono galleggianti. </li><li> Aggiungere 9 ml di ECM per bombola T75 e trasferire in una provetta Falcon 15 ml. Molto dissociare delicatamente il cellularesospensione pipettando su e giù 4 volte con una pipetta 10 ml munito di una punta gialla (evitare la produzione di bolle nella soluzione). Contare le cellule in sospensione (circa 3 x 10 6 cells/T75) e piastra immediatamente su filtri pre-rivestiti e preriempite ad alta densità (160 x 10 3 cellule / filtro quindi circa 18 filters/T75) (Figura 8 ). Il giorno seguente (Giovedi), cambiate due volte la media del vano superiore per rimuovere i detriti cellulari. </li><li> Giovedi della seconda settimana, il giorno prima della costituzione della co-coltura, sostituire il mezzo di coltura astrociti di 1,5 ml di mezzi di differenziazione (ECM con idrocortisone a 500 nm), che possono essere integrati con un terzo mezzo condizionato dal compartimento basale di una precedente co-coltura (3 giorni di contatto tra cellule endoteliali e astrociti). </li><li> Venerdì della seconda settimana è definito come il giorno 0 di differenziazione; sostituire il mezzo di coltura dalla filtri Containing il RBEC con i media differenziazione. Trasferire i filtri RBEC nei pozzetti contenenti gli astrociti. In queste condizioni, i modelli in vitro e differenziare esprimono proteine ​​di giunzione connessi entro 3 giorni. </li><li> I modelli mantengono la loro differenziazione ottimale durante più di 3 giorni, tra Lunedi e Mercoledì della terza settimana. </li></ol>

Michel Khrestchatisky è direttore del laboratorio UMR7259, co-fondatore e consulente scientifico dell'azienda biotecnologica VECT-HORUS.

Descriviamo l&#39;attuazione di un protocollo riproducibile settimanale per l&#39;isolamento e la placcatura di microvasi cerebrali, seguendo la purificazione e la cultura di RBEC e ulteriore creazione di co-colture di astrociti primari di ratto per generare un modello in vitro BBB con caratteristiche proprietà BBB. Stabilire con successo standardizzato di culture BBB vitro richiede condizioni ottimali nelle diverse fasi sequenziali del processo. Il modello è stato (a) ottimizzato per avere la permeabilità paracellulare più bassa, che rimane il &quot;Santo Graal&quot; della vitro modelli BBB a, e (b) convalidato per efflusso ed i meccanismi RMT. Produzione, purificazione e proliferazione delle RBEC La sfida più grande quando coltivare RBEC è quello di raggiungere la riproducibilità tra culture diverse. Standardizzazione del protocollo richiede strumenti di alta qualità per dissezione, reagenti di alta qualità e il rispetto delle date di scadenza dei reagenti. Lo sperimentatore deve essere abile in micro-dissezione sotto stereomicroscopio per la rimozione rapida di meningi e grandi vasi dalla superficie corticale. Una volta che i cervelli sono isolati e meccanicamente dissociati, una delle principali sfide è la digestione enzimatica ottimale dei microvasi cerebrali appena isolate. Il tipo e la qualità degli enzimi utilizzati è fondamentale. Un mix di tipo collagenasi I e II e dispasi ad alta concentrazione con una bassa variabilità tra i lotti è stato utilizzato. Importanti sono anche la durata della digestione enzimatica e il rapporto tra peso concentrazione dell&#39;enzima / tessuto / volume di digestione. La migliore resa di produzione microvasi cervello è stato ottenuto con l&#39;equivalente di cortecce cerebrali da 1 a 1 ml di collagenasi / dispasi miscela a 60 mcg / ml durante entrambe le digestioni, rispettivamente 30 minuti e 1 ora. Inoltre critico è l&#39;eliminazione di contaminare cellas (astrociti e soprattutto periciti). Queste cellule proliferano a velocità superiore a quella delle cellule endoteliali e non stabiliscono giunzioni strette con quest&#39;ultimo, evitando così la creazione di un monostrato cellulare omogenea con una buona paracellulare restrittività. Considerando che le cellule endoteliali cervello esprimono livelli molto più alti di pompe di efflusso, specialmente P-gp, rispetto agli altri tipi di cellule presenti in microvasi, tollerano meglio le concentrazioni altrimenti tossiche di P-gp farmaci ligando, mentre le cellule non endoteliali sono eliminati. Trattamento puromicina a 4 mcg / ml per i primi due giorni seguito da altri due giorni a 2 ug / ml per ottenere una buona purezza delle cellule endoteliali. Questa selezione può anche favorire le cellule endoteliali dei capillari rispetto a quelli provenienti da venule, arteriole pre-capillari o microvasi più grandi, e portare a monostrati strette. Inoltre, l&#39;uso di poveri siero bovino derivato dal plasma è un imperativo per ottenere colture pure di cellule endoteliali 47,48. Il plasma-dersiero ived manca fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF), che è mitogenico per i fibroblasti, le cellule muscolari lisce e quindi per periciti. Abbiamo osservato che il trattamento di plastica e filtri con un mix di collagene tipo IV da topi e fibronectina umana produce un vantaggio significativo, con un aumento di 2 volte della resa proliferazione in confronto con il collagene di tipo tradizionalmente raccomandato io da ratto coda. Spunti importanti per la proliferazione cellulare sono ottenute dalla matrice extracellulare come integrine e fattore di crescita (bFGF) attivazione 49. Concentrazione del tampone e pH del terreno di coltura sono stati descritti per influenzare positivamente paracellular tenuta 50 e abbiamo osservato una migliore riproducibilità tra culture con l&#39;aggiunta di tampone HEPES a 5 mM. Differenziazione dei RBEC: Co-cultura Istituzione su Insert Filters Una volta che le cellule endoteliali cerebrali hanno been purificato e hanno proliferato per 6 giorni, possono essere piastrate su filtri. Placcatura cellulare ad alta densità è fondamentale per ottenere un monostrato perfetto. Una densità di semina di 160x10 3 celle per 12 filtri a piastre e era necessaria e sufficiente per ottenere un monostrato confluente 24 ore dopo la semina. Tuttavia, isolamento delle cellule endoteliali dei capillari del cervello primari dal loro ambiente è un paradosso nella costruzione di un modello BBB in vitro come è noto che le cellule primarie, e le cellule endoteliali dei capillari del cervello in particolare, sono fortemente regolati dal loro ambiente e fattori induttivi prodotte da i diversi tipi di cellule circostanti. Cellule endoteliali dei capillari cerebrali coltivate solo rapidamente de-differenziare e perdono alcuni marcatori specifici endoteliali cerebrali. Così, le cellule endoteliali primarie dovrebbero essere usati a partire passaggio (P1) e ricollegati, almeno in parte, con il loro ambiente mediante co-coltura con astrociti o mezzo condizionato da astrociti 47,51. Questo valevero per la differenziazione astrociti come cellule endoteliali cerebrali e astrociti sono coinvolti nell&#39;induzione due vie. Coltura RBEC con astrociti hanno portato a una forte induzione di TJ interendothelial 52,23. I meccanismi molecolari di re-induzione rimangono in gran parte sconosciute, e la ricerca è in corso in diversi laboratori di individuare specifici fattori di modulazione secreti dagli astrociti, che potrebbero promuovere ottimale differenziazione delle cellule endoteliali 53,54. Fattori secreti dalle cellule endoteliali cerebrali, tra cui il fattore inibente la leucemia (LIF) hanno dimostrato di indurre la differenziazione astrocitaria 55,56. Prima di stabilimento co-coltura, astrociti sono stati esposti a mezzo di differenziazione contenente glucocorticoidi agonista del recettore idrocortisone, e co-coltura condizionati medie. L&#39;idrocortisone è noto per migliorare la tenuta di cellule endoteliali cervello e viene utilizzato nei modelli BBB specialmente da 57 ratto e topo 58,59 cellule endoteliali. La medicina condizionataum viene raccolto dal vano inferiore della cella / astrociti sistema di co-coltura endoteliale dopo 3 giorni e congelati per un uso successivo. L&#39;uso di un terreno co-coltura condizionato ridotto il tempo di differenziazione delle cellule endoteliali a 3 giorni ad elevatissima permeabilità paracellular per ulteriori 2 giorni e anche migliorato la riproducibilità tra culture. Nel complesso, il protocollo descriviamo produce un TEER riproducibile su 300 ohm · cm 2 e un coefficiente medio paracellular permeabilità Pe (LY) di 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min, simile alle migliori modelli basati su cellule primarie BBB 22, 12. Il protocollo descriviamo nel presente manoscritto con la modulazione proposta di microvasi digestione enzimatica può essere esteso alle cellule endoteliali dal midollo spinale di ratto 60 e da topi cervello. Caratterizzazione molecolare e funzionale Inoltreall&#39;induzione TJ, astrociti contribuiscono anche l&#39;espressione di trasportatori di efflusso come P-gp in cellule endoteliali cerebrali 61. Noi mostriamo infatti espressione del trasportatore d&#39;efflusso P-gp nel modello BBB e dimostriamo la polarità della pompa di efflusso localizzazione P-gp utilizzando approcci biochimici e di attività P-gp utilizzando un saggio funzionale. GLT-1 è stato rilevato nella frazione di membrana basale di microvasi ma non è stato rilevato in RBEC coltura. Noi ipotizziamo che GLT-1 è stato regolato verso il basso nella nostra cultura RBEC in confronto con le condizioni in vivo e, di conseguenza, non rilevabili mediante analisi Western Blot. Glutammato in eccesso è neurotossico e in vivo, GLT-1 è responsabile di glutammato efflusso dal vano basale (parenchima) al compartimento apicale (circolazione del sangue). In colture di astrociti, GLT-1 rimane molto bassa e viene indotta mediante l&#39;aggiunta di glutammato nel medio 62,63. Abbiamo anche confIRM l&#39;espressione dei trasportatori afflusso a livello della membrana apicale come LRP1, LDLR e TFR. Funzionalità di TfR e LDLR stata dimostrata con il legame e trasporto esperimenti di Tf-Cy3 e DiLDL dal luminale al lato abluminale del monostrato come precedentemente indicato con una bovina in vitro modello BBB 64. È interessante notare, è stato dimostrato che requisito lipidi dagli astrociti aumenta l&#39;espressione di LDLR sulle cellule endoteliali dei capillari del cervello 65,66 conferma ulteriormente la diafonia fisiologica tra astrociti e cellule endoteliali cerebrali, compresi in vitro. Abbiamo scelto di esemplificare trasporto con coloranti fluorescenti come come Cy3 e DII considerando che l&#39;analisi spettrofluorimetrico è disponibile nella maggior parte dei laboratori, e può rivelarsi utile per validare modelli in vitro BBB. Tuttavia, la quantificazione della fluorescenza è molto meno sensibile di radioattività e richiede un aumento del numero di esperimenti per ottenere dati significativi.Idealmente, Tf e LDL sono di solito radioattivo (iodio 125) per tali vincolante / assorbimento e trasporto esperimenti. Mostriamo anche che il monostrato di cellule endoteliali differenziata ottenuti con il protocollo proposto alle infiammazione indotta da TNF-α, come rivelato dal rilascio CCL2 e apertura BBB. CCL2 (MCP-1) e il suo recettore CCR2 sono coinvolti nelle patologie del SNC come la sclerosi multipla, l&#39;encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) 67, CNS trauma 68 e sono noti come mediatori della migrazione dei leucociti nel SNC in condizioni neuroinfiammatori 69,70. Con il protocollo testato, non possiamo concludere su una secrezione polarizzata di CCL2 perché apertura BBB permette la concentrazione CCL2 di equilibrarsi tra i due (apicali) e inferiore (basale) vani superiori. Di conseguenza, sottovalutiamo chiaramente la quantità di prodotto dal CCL2 RBEC nel compartimento apicale a 24 ore (Figura 5A). Generale e limitazioni di BBB modelli in vitro: I n Vivo vs In Vitro ed Roditore contro Confronti umani Molti farmaci promettenti del sistema nervoso centrale che si sono dimostrati efficaci nel BBB passaggio in vitro falliti in studi clinici a causa della mancanza di prevedibilità da modelli in vitro di BBB spesso basati su cellule isolate da specie diverse umana. Per quanto a nostra conoscenza, i modelli in vitro BBB a sono probabilmente più predittivo quando si tratta di studiare gli aspetti meccanicistici delle reti di proteine, trasduzione del segnale, trasportatori e recettori. Ogni meccanismo, percorso o la destinazione ad essere studiato in vitro deve essere caratterizzata per la sua regolamentazione da stimoli ambientali complementari (altri tipi di cellule, sostanze chimiche, proteine) e combinati a studi in situ con le stesse specie animali, E quando possibile, con microvasi e le cellule endoteliali isolate da esseri umani, con le restrizioni e cautela evocati qui di seguito. In vitro modelli BBB devono essere visti come sistemi autonomi, isolati dal regolamento del corpo, ma comunque dotati di maggiori proprietà in vivo e un potenziale per la regolamentazione da stimoli ambientali. No &quot;ideale&quot; in vitro modello BBB è stato ancora proposto 71,72,73 perché i monostrati di cellule endoteliali mancano di un certo numero di importanti costituenti delle unità vascolare neuro-glia (NGVU) e sono isolati dal sangue e la regolazione del corpo. La mancanza di periciti 74,16 o neuroni 17,18 o diversi costituenti della matrice extracellulare utilizzato per il rivestimento di plastica o il terreno di coltura e siero utilizzato per la crescita cellulare nel più comune e più semplice &quot;misura&quot; in vitro in modelli BBB basato su endoteliale cellule differenziate con astrociti possono modulare l&#39;espressione della proteina in rispetto alla situazione in vivo 75. Questi modelli possono esprimere molti trasportatori sono in vivo, ma non tutti. In alcuni casi, i parametri di trasporto sono stati verificati nei microvasi isolate (più vicini alla situazione in vivo), e quindi studiate in sistemi di colture cellulari 76,61. Ricerche di biologia molecolare ha permesso la caratterizzazione di espressione genica e proteica in microvasi isolati e passaggio endoteliali colture cellulari bassi delle stesse specie e tra specie diverse, il più delle volte da piccoli animali come roditori (topi e ratti) o di mucca e maiale in confronto all&#39;uomo 77,78,75,15. Confronto tra transcriptomic in vivo e in cellule endoteliali microvascolari cerebrali in vitro hanno mostrato numerosi trascritti genici che erano differenzialmente espressi e più spesso significativamente inibiti in vitro. Trascritti codificanti trasportatori afflusso come TfR e proteins implicati nel traffico di vescicole vengono inibiti principalmente nelle cellule endoteliali cerebrali coltivate, suggerendo una generale diminuzione endocitosi e trasporto vescicolare in tali cellule. Manipolazione cultura in termini di purezza (trattamento puromicina) e il trattamento con idrocortisone può contribuire a ripristinare un &quot;in vivo-like&quot; profilo più espressione genica 77. Studi di trascrittomica anche rivelato importanti differenze tra le specie che complicano ulteriormente le previsioni sulla diffusione della droga negli esseri umani sulla base di roditore in modelli in vitro di BBB 75. Modelli in vitro BBB coinvolgono co-coltura di cellule endoteliali umane e astrociti sono stati descritti 15. Anche se del caso, questi modelli sono più difficili da attuare su base regolare in quanto richiedono l&#39;accesso regolamentato al tessuto umano post mortem e c&#39;è eterogeneità nelle qualità / proprietà delle cellule endoteliali cerebrali umane a seconda dell&#39;età, delle malattie, ed eventualmente medico treatment dei donatori. Gli sforzi devono essere fatti per sviluppare nuovi modelli in vitro che meglio riproducono la fisiologica, caratteristiche anatomiche e funzionali della BBB in vivo. Co-culture che coinvolgono tre tipi di cellule sono molto restrittive e appaiono di difficile attuazione di routine. Ad oggi, le vitro modelli più complessi in BBB sono i modelli dinamici in vitro (DIV-BBB), che comprendono l&#39;organizzazione nave-come con astrociti e comprendono un flusso di media che imita il flusso di sangue 75,79,80,81,82, 83,84,85. Quando le cellule endoteliali cerebrali sono esposti a un flusso, lo sforzo di taglio generato attiva mechanotransducers sulla superficie cellulare, che modulano l&#39;espressione di diversi geni coinvolti nella fisiologia delle cellule endoteliali, come la divisione cellulare, la differenziazione, la migrazione e l&#39;apoptosi 80. In vivo, shear stress generata dal flusso sanguigno è responsabile per l&#39;arresto mitotico al contatto cellula, che consente la creazione di unmonostrato di cellule endoteliali dei vasi sanguigni 80. Analisi genomica e proteomica delle normali cellule endoteliali microvascolari cervello umano ha mostrato l&#39;impatto dello stress di taglio a BBB endoteliale fisiologia 84. Shear stress è responsabile per la sopravvivenza cellulare, un grado di adesione delle cellule endoteliali superiore, induzione pompa di efflusso e migliore polarizzazione dei trasportatori 75, regolazione del metabolismo glucidico 75,86, ossidazione mediata da enzimi CYP450 75 e la regolazione della permeabilità paracellular aumentando l&#39;espressione di geni che codificano per elementi giunzionali intercellulari come occludina e ZO-1 87,75,80 e conseguentemente elevata TEER circa 1,500 - 2,000 ohm · cm 2, più vicino a noto in vivo Parametri 79,80 Nel settore della biotecnologia e farmaceutica, lo screening di routine di farmaci o addirittura ad alto throughput screening (HTS) e gli sforzi per ridurre la sperimentazione animale, ha portatoallo sviluppo di linee cellulari differenti da utilizzare in sostituzione della coltura primaria di cellule endoteliali cerebrali che rimangono più difficile set-up di routine. Nella maggior parte dei casi, colture primarie di cellule endoteliali cerebrali sono state trasdotte con un gene immortalando (SV40 o polioma virus grande T-antigene o adenovirus E1A), mediante trasfezione di DNA plasmidico o da infezione utilizzando vettori retrovirali 88,89,75. Diverse linee di cellule endoteliali di origine cerebrale sono stati sviluppati come il RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBs o rBCEC4 linee di cellule di ratto 88,75, la linea cellulare b.End3 topo 90,75, il PBMEC/C1 - 2 porcine linea cellulare 87,75, e la linea cellulare umana hCMEC/D3 89,75. Altri modelli sono basati su cellule di origine non cerebrale come il rene canino Madin-Darby (MDCK) o linee cellulari Caco2 12,75. Tra le diverse linee di cellule endoteliali cerebrali umani, il hCMEC/D3 è stato ampiamente citared e migliorato come modello di BBB sin dalla sua istituzione nel 2005, 91,92. Come colture primarie, linee cellulari presenti vantaggi e limitazioni. Essi sono più facili da gestire rispetto colture primarie, hanno una durata di vita estesa, sono ben caratterizzati e consentire la riproducibilità tra esperimenti su larga scala. Tuttavia, le linee cellulari possono perdere funzioni tessuto-specifici, perde la normativa ambientale e di acquisire un fenotipo molecolare molto diverse dalle cellule in vivo 75, 89. In particolare, monostrati generati da linee cellulari presenti tenuta ridotto, bassa Teer e profilo mostra trasportatore variazione 75,89. Così esperimenti su animali o studi in cellule primarie sono spesso preferiti nonostante la loro complessità.

Molti farmaci sviluppati per il trattamento di Sistema Nervoso Centrale (SNC) disturbi sono in grado di raggiungere il parenchima cerebrale in concentrazioni terapeuticamente rilevanti. La BBB protegge il tessuto nervoso cerebrale dalla fluttuazione della composizione plasma, dagli agenti patogeni, e mantiene l&#39;omeostasi del parenchima cerebrale limitando non specifico flusso di ioni, peptidi, proteine ​​e anche le cellule e verso il cervello 1. Caratteristiche BBB sono indotte e mantenuti da intima vicinanza e cross-talk tra la classe specializzata microvasi cerebrali cellule endoteliali e gli elementi adiacenti dell&#39;unità neuro-glia-vascolari (NGVU) come i neuroni, cellule gliali (più precisamente astrociti finali piedi), e periciti ensheathed nella membrana basale che consiste principalmente di collagene tipo IV, fibronectina, la laminina e proteoglicani 2,3. Periciti coprono circa il 22 - 32% dell&#39;endotelio a livello capillare e svolgono un importanteruolo nella regolazione della proliferazione dell&#39;endotelio, angiogenesi e processi infiammatori. Le cellule endoteliali formano un foglio continuo che copre la superficie interna dei capillari. Essi sono interconnessi da TJs, che formano una struttura di cintura in corrispondenza della zona apicale e che contribuiscono alla cella di polarizzazione. Gli astrociti regolano le proprietà BBB e sono fonti di importanti fattori normativi, come TGF-β, GDNF, bFGF e IL-6. Gli astrociti carenti di GFAP con funzionalità incomplete non sono in grado di regolare BBB proprietà 4. Neuroni non sono direttamente coinvolti strutturalmente nella formazione della BBB ma regolano anche aspetti importanti di espressione proteica e funzioni BBB 5. Per studiare ulteriormente la struttura, fisiologia e patologia del BBB, modelli in vitro della BBB sono stati sviluppati come strumenti di ricerca. Cellule endoteliali cerebrali sono stati estratti da varie specie di attuare in vitro modelli BBB basatoil passaggio colture basse primarie da bovini, suini 6,7 8,9, 10,11,12 ratto, topo 13 e anche umano 14,15. Questi modelli sono noti per imitare in vivo BBB, in particolare quando co-coltura con cellule gliali di ratto o murina e / o periciti 16,12, e / o derivati ​​da cellule progenitrici neurali astrociti 17 e / o 18 neuroni. I modelli &quot;in laboratorio&quot; sono spesso prodotti da roditori perché permettono esperimenti in vitro / in vivo e confronti e / o lo studio delle cellule endoteliali cerebrali prodotte da modelli transgenici 19. Di recente sviluppato in modelli in vitro di BBB sono stati progettati per aiutare a prevedere l&#39;assorbimento del cervello di potenziali candidati farmaci del sistema nervoso centrale prima del test in vivo 15,20,21,3,6,22,11,23. Modelli in vitro BBB sono di solito utilizzati per confrontare il trasporto di farmaci con: i) penetrazione noto nel SNC o con low permeabilità attraverso la BBB e senza effetti centrali, e ii) l&#39;apparente Pe degli stessi farmaci misurati in modelli animali della stessa specie. I farmaci che passano rapidamente la BBB sono prevalentemente lipofilo e attraversano le membrane delle cellule endoteliali cerebrali da lipidi mediata libera diffusione (caffeina, carbamazepina, ecc). I farmaci trasportati negativamente come la digossina, verapamil o ciclosporina A sono attivamente estrusi da endoteliali cerebrali trasportatori di efflusso come la P-gp. Tuttavia, molte delle molecole terapeutiche nuova concezione sono biofarmaceutici, come proteine ​​ricombinanti, siRNA o anticorpi monoclonali. La maggior parte di loro non attraversare la BBB a causa di: i) l&#39;assenza di trasportatori specifici, e ii) lo strato fitto di cellule endoteliali, che impediscono molecole ad alto peso molecolare dalla fase di passaggio paracellulare. Con questi limiti, le strategie di &quot;Trojan horse&quot;, sono state implementate utilizzando vettori (anticorpi, peptidi) contro i recettori noti al BBB, ha coinvolto in recettore trasporto mediato o transcitosi (RMT), come la transferrina (Tf) recettore (TfR), il recettore dell&#39;insulina (IR), o membri del recettore LDL (LDLR) connessi famiglia di recettori (LDLR, LRP1). Tali recettori sono stati trovati su isolati capillari cerebrali e nella BBB in vivo 24,25. Profili trascrizionali per questi recettori, in particolare quelli della famiglia LDLR, sono stati analizzati e confrontati tra cellule endoteliali cerebrali e le cellule endoteliali cerebrali in co-coltura con astrociti o nei capillari cerebrali direttamente dopo la loro estrazione dal cervello 26. Pardridge 24 aperto il campo con l&#39;anticorpo OX-26 contro il recettore della transferrina (TfR), seguito da anticorpi contro il recettore dell&#39;insulina e il fattore di crescita insulino recettore 27,28. Con questi vettori anticorpi basato, ArmaGen Technologies ha sviluppato una piattaforma tecnologica cavallo di Troia molecolare BBB per fornire farmaci, tra cui le proteine, attraverso la BBB 29. Illa letteratura è ricca di dati che mostrano l&#39;espressione LRP1 in cellule endoteliali cerebrali e il suo ruolo come un potente recettore endocytic / scavenger. Analisi Western blot ha suggerito che LRP1 è espresso in frazioni arricchite in capillari cerebrali di ratto e in cellule endoteliali capillari cervello 30. Aziende come Angiochem bersaglio LRP1 con vettori di peptidi derivati ​​da aprotinin che promuovono efficiente afflusso farmaco attraverso la BBB 31. Tuttavia, LRP1 si occupa anche di trasporto attivo di Ap e il suo efflusso / spazio da parenchima cerebrale al sangue 32. Tali dati implicano LRP1 in un trasporto bidirezionale di tutti i BBB a seconda dei suoi ligandi. biOasis sviluppa la tecnologia Transcend utilizzando un melanotransferrin proteina per il trasporto di farmaci biologici come gli enzimi lisosomiali e anticorpi attraverso la BBB 33 mentre VECT-HORUS sviluppa vettori peptidici che colpiscono il LDLR 34. Ci sono dati suggerendo che la LRP e LDLR possono essere utilizzati per il trasporto di differenti molecole come gli enzimi lisosomiali 35,36 o complessi di nanoparticelle attraverso la BBB 37. Il nostro campo di interesse è la somministrazione di farmaci al SNC utilizzando molecole vettoriali e vettorializzate droga candidati per il trattamento di malattie del SNC. In particolare, la somministrazione di farmaci attraverso la BBB deve essere considerato nel contesto di neuroinflammation, un processo che può variare nella sua estensione, ma che è probabilmente comune a tutte le lesioni e malattie del SNC, compreso l&#39;encefalite, sclerosi multipla, morbo di Alzheimer, ecc Neuroinflammation è associato con infiammazione BBB e potenzialmente con i cambiamenti nella fisiologia e BBB permeabilità considerando che paracellular e trasporto transcellulare possono essere amplificati in condizioni patologiche 38,39,40,41,42,43. Ad esempio, TNF-α, Tweak, e di altre citochine modulano l&#39;infiammazione, e gli esperimenti in vitro con modelli BBB a hanno dimostrato che possono alterare le proprietà paracellulare di secoloe monostrato di cellule endoteliali 38,39,40 e che il TNF-α porta anche ad un aumento del trasporto transcellulare di LDL 41, holotransferrin 42 e 43 lattoferrina. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare e caratterizzare un ottimizzato e altamente riproducibile ratto singenico modello BBB con co-colture di cellule endoteliali cerebrali primari e astrociti. Abbiamo usato 5 settimane vecchi e neonatali ratti Wistar per la produzione di cellule endoteliali cerebrali e la produzione di astrociti, rispettivamente. Una sfida era quella di stabilire un protocollo che consente la produzione di modelli BBB &quot;settimanale riproducibili&quot;. Per raggiungere questo obiettivo, ogni passo del disciplinare di produzione è stata eseguita in giorni fissi della settimana, a partire dalla produzione dei microvasi cerebrali il Mercoledì della prima settimana. Dissezioni sono stati eseguiti quasi ogni settimana nel corso degli ultimi 3 anni. Per migliorare ulteriormente la riproducibilità delle culture, è stato istituito un sistema di garanzia della qualità. Tutti Reagents e sostanze chimiche sono state utilizzate in una banca dati (data di entrata, magazzino, scadenze, ecc). Il modello è stato caratterizzato a seguito di una serie di criteri, quali l&#39;organizzazione delle cellule endoteliali e la purezza, TEER, LY permeabilità, risposta agli agenti pro-infiammatori, espressione qualitativa e quantitativa delle proteine ​​TJ, funzionalità dei trasportatori di efflusso come la P-gp, e recettori coinvolti in transcitosi di tutti i monostrato cellulare endoteliale come il TfR o il LDLR.

<table><tbody><tr><td>BSA frazione V bassa endotossina</td><td>PAA</td><td>K45-011-500g</td><td>4 gradi C&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122-20</td><td> C</td></tr><tr><td>0,05% tripsina-EDTA (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>DMEM alto glucosio</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td>4 gradi C&nbsp;</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Invitrogen</td><td>10270-098-20</td><td> C / 1 anno</td></tr><tr><td>Palloni T75</td><td>Becton Dickinson Falcon</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>tampone HEPES (1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>4 gradi C / 1 anno</td></tr><tr><td>Collagene di tipo IV topo (10 x 1 mg)</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>356233-20 &deg; C / 1 mese</td></tr><tr><td>Fibronectina humain plasma (5 mg)</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>356008-20 &deg; C / 1 mese</td></tr><tr><td>Forbici a molla Vannas, dritte (9 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Forbici, dritte (9 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Dumont #5/45 (11 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Graefe, larghezza punta 0,8 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Graefe, larghezza punta curva 0,8 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi / miscela di dispasi (2 x 5 mg)</td><td>Roche Diagnostics</td><td>05 401 054 001-20</td><td> C / 3 mesi</td></tr><tr><td>DNasi I (100 mg / 569 KU / mg)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25-100</td> <td>mg-20 &deg; C / 1 anno</td></tr><tr><td>Gentamicina (10 mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td>4 gradi C / 1 anno</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>31331-028</td><td>4 gradi C&nbsp;</td></tr><tr><td>Siero bovino da plasma povero di piastrine (500 ml)</td><td>Clinisciences</td><td>BT-214-100-20</td> <td>&deg; C / 1 anno</td></tr><tr><td>bFGF (10 &micro; g)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029-20</td> <td>&deg; C / 6 mesi</td></tr><tr><td>Heparine Na sale da mucosa suina Grado I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td>4 gradi C / 1 anno</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833-10</td> <td>mg-20 &deg; C / 6 mesi</td></tr><tr><td>ITSX</td><td>Invitrogen</td><td>51500-056</td><td>4 gradi C / 1 anno</td></tr><tr><td>Inserto per celle sospese in polietilene per piastre a 12 pozzetti</td><td>Millipore</td><td>PIRP15R48</td><td>Porosità: 1 & micro; m Superficie: 1,1 cm2</td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1</td> <td>g-20 &deg; C / 1 anno</td></tr><tr><td>Topo anti-CD31 / PECAM&nbsp;</td><td>Chemicon</td><td>MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td><td>1/200 - fissazione PFA 4%</td></tr><tr><td>Coniglio anti-Von Willebrand</td><td>Chemicon</td><td>AB7356</td><td>1/200 - fissazione PFA 4%</td></tr><tr><td>Topo anti-Desmine</td><td>Chemicon</td><td>MAB3430</td><td>1/200 - fissazione PFA 4%</td></tr><tr><td>Topo anti-Vimentina</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>08-0052 clone V9, (58 &; micro; g/ml)&nbsp;</td><td>1/50 - fissaggio PFA 4%</td></tr><tr><td>Topo anti-Claudin-5</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>35-2500, (500 &micro; g/ml)</td><td>1/200 - fissazione PFA 4%</td></tr><tr><td>Rabbit anti-ZO-1</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>61-7300 (250 &; micro; g/ml)</td><td>1/200 - fissazione PFA 4%</td></tr><tr><td>Coniglio anti-Occludina&nbsp;</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>71-1500 (250 &micro; g/ml)</td><td>1/200 - fissazione PFA 4%</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, 594 anticorpi secondari coniugati</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>1/800</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH, sale di dilitio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L0259-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>TNF-alfa umano</td><td>PeproTech</td><td>300-01A-20</td><td> C</td></tr><tr><td>Rat MCP-1 Kit ELISA</td><td>PeproTech</td><td>900-K59</td><td>4 gradi C / -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Topo anti-glicoproteina</td><td>P Covance, Eurogentec</td><td>SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)</td><td>1/400 - fissazione PFA 4% 1/200 (western blot)</td></tr><tr><td>Coniglio anti-GLT-1</td><td>Abcam</td><td>ab41621</td><td>1/1.000 (western blot)</td></tr><tr><td>Rodamina 123</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83702</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>Verapamil cloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V4629</td><td>4 gradi C</td></tr><tr><td>Ciclosporina A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30024</td><td>4 gradi C</td></tr><tr><td>Recettore monoclonale anti-a2 della macroglobulina (CD91, LRP1) contro la catena b dell'aminoacido 4291-4344 all'interno di una ripetizione EGF</td><td>American Diagnostica</td><td>3501 (100 &micro; g/ml)</td><td>1/5 - fissazione PFA 4%</td></tr><tr><td>Topo anti-LDLR</td><td>R& D systems</td><td>AF2255 (200 &micro; g/ml)</td><td>1/50 - fissazione PFA 4%</td></tr><tr><td>Transferrina di ratto-Cy3</td><td>Gentaur</td><td>JOR160050</td><td>4 gradi C</td></tr><tr><td>DiILDL</td><td>Invitrogen</td><td>L-3482</td><td>4 gradi E</td></tr></tbody></table>

istituzione di un<em&gt; in vitro</em&gt; modello di rat barriera emato-encefalica (bbb): a focus on bbb impermeabilità e trasporti recettore-mediata

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

La barriera ematoencefalica (BBB) ​​specificamente disciplina flusso molecolare e cellulare tra il sangue ed il tessuto nervoso. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare e caratterizzare un singenico ratto altamente riproducibile modello in vitro di BBB con co-colture di ratto cellule endoteliali cerebrali primari (RBEC) e astrociti a studiare recettori coinvolti nella transcitosi tutto il monostrato di cellule endoteliali. Gli astrociti sono stati isolati dalla dissezione meccanica seguendo la digestione tripsina e sono stati congelati per la successiva co-coltura. RBEC sono stati isolati da 5 settimane di età corteccia di ratto. I cervelli sono stati puliti delle meningi e sostanza bianca, e dissociate meccanicamente seguendo digestione enzimatica. Successivamente, il tessuto omogenato è stato centrifugato in sieroalbumina bovina per separare i frammenti del vaso da tessuto nervoso. I frammenti del vaso subito una seconda digestione enzimatica di cellule endoteliali liberi dalla loro matrice extracellulare. Le cellule contaminanti rimanenti come periciti sono stati fLTERIORI eliminato con placcatura i frammenti dei microvasi nel medio-puromicina contiene. Sono stati poi diversi passaggi su filtri di co-coltura con astrociti coltivate sul fondo dei pozzetti. RBEC espresso alti livelli di giunzione a tenuta (TJ) proteine ​​come occludina, claudin-5 e ZO-1 con una localizzazione tipica ai bordi della cella. La resistenza elettrica transendoteliale (TEER), del cervello monostrati endoteliali, che indica la tenuta del TJs raggiunto 300 ohm · cm 2 in media. I coefficienti di permeabilità endoteliale (PE) per lucifer yellow (LY) era altamente riproducibile con una media di 0.26 ± 0.11 x 10 -3 cm / min. Cellule endoteliali cerebrali organizzati in monostrati espressi trasportatore d&#39;efflusso P-glicoproteina (P-gp), hanno mostrato un trasporto polarizzato di rodamina 123, un ligando per P-gp, e mostravano trasporto specifico di transferrina-Cy3 e DiILDL attraverso il monostrato di cellule endoteliali. In conclusione, forniamo un protocollo per la creazione di un in vitroModello BBB che è altamente riproducibile a causa dei metodi di garanzia della qualità, e che è adatto per la ricerca sulle trasportatori BBB e recettori.

Lo scopo di questo studio era di convalidare la riproducibilità di un modello in vitro BBB coinvolge un singenici ratto co-coltura delle cellule endoteliali e astrociti. Il monostrato di cellule endoteliali presentato TEER alta e bassa permeabilità LY. Espressione di proteine ​​TJ specifici, sono state valutate le risposte funzionali ai infiammazione e la funzionalità dei trasportatori e recettori.

Istituzione di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello di Rat barriera emato-encefalica (BBB): A Focus on BBB impermeabilità e Trasporti recettore-mediata

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di allestire un modello in vitro altamente riproducibile della barriera ematoencefalica del ratto. Questo risultato si ottiene rimuovendo i nervi ottici, il cervelletto e le meningi al microscopio stereoscopico, separando successivamente i due emisferi cerebrali e dissezionandoli per ottenere un frammento di corteccia privo di contaminazioni. Il secondo passaggio consiste nell'isolare i microvasi dalla corteccia mediante trattamento enzimatico e centrifugazione basata sulla densità.Successivamente, i microvasi vengono seminati e incubati con puromicina per purificare le cellule endoteliali da cellule contaminanti come i parassiti. Colture pure di cellule endoteliali cerebrali proliferano fino a quando le cellule raggiungono una confluenza del 90%. L'ultimo passaggio consiste nell'indurre la differenziazione delle cellule endoteliali cerebrali del ratto posizionando le cellule nella camera superiore dei filtri ad inserto e co-coltivandole con astrociti di ratto che sono stati precedentemente preparati e seminati.In definitiva, il monocstrato di cellule endoteliali cerebrali differenziate può essere caratterizzato mediante l'espressione di specifiche proteine delle giunzioni strette e tramite l'indice di permeabilità di un composto di riferimento attraverso il monocstrato di cellule endoteliali dal compartimento superiore. I modelli in vitro della BEE, come quello qui presentato, sono utili per esplorare la distribuzione cellulare di molecole chiave e per chiarire i meccanismi cellulari e molecolari di base del funzionamento della BEE. In particolare, tali modelli permettono di studiare i recettori della BEE e il loro coinvolgimento nel traffico endocitico e nella transcitosi, secondo le nostre osservazioni.I modelli in vitro della BEE sono utilizzati principalmente per studiare il targeting di recettori specifici mediante vettori peptidici che sviluppiamo. Per facilitare il rilascio di farmaci al sistema nervoso centrale attraverso la BEE, utilizziamo un processo chiamato transcitosi mediata da recettore, noto anche come approccio del cavallo di Troia. La descrizione visiva è fondamentale, poiché chi si approccia per la prima volta a questo metodo dovrà possedere abilità di dissezione e dovrà utilizzare un microscopio con sufficiente rapidità e precisione da garantire la sopravvivenza del tessuto durante il processo di produzione cellulare.Un altro punto fondamentale è la chiusura precoce della zona fragile e della regione del tele salmon per evitare l'apertura della barriera durante gli esperimenti. Infine, questa procedura illustrerà nei dettagli i passaggi chiave che differenzieranno i protocolli rossi da quelli visualizzati, dimostrando che la procedura sarà eseguita da me e dal mio collega. Iniziare questa procedura rivestendo due fiasche T75 con collagene di tipo quattro e fibronectina a una concentrazione di un microgrammo per centimetro quadrato in acqua di coltura sterile, e lasciarli aderire nell'incubatrice a 37 gradi Celsius fino alla semina dei microvasi.Dopo due giorni, rimuovere il cervello dal cranio di tre ratti Vista di cinque settimane di età e trasferire i cervelli in una piastra di Petri contenente buffer di dissezione freddo posta su ghiaccio. Dissezionare i cervelli eliminando il cervelletto e i nervi ottici. Quindi tagliare ciascun cervello a metà per separare i due emisferi cerebrali sotto il microscopio stereoscopico.Eseguire un altro taglio per rimuovere il mesencefalo e trasferire tutti e quattro i cervelli in una nuova piastra di Petri pulita posta sul ghiaccio con tampone di dissezione. Successivamente, trasferire un proencefalo in una nuova piastra di Petri riempita con tampone di dissezione freddo. Trattenerlo con una pinza e staccare con cura le meningi dai margini del proencefalo.Successivamente, capovolgere il proencefalo ed estrarre con cura le meningi senza strapparle. Assicurarsi che il proencefalo sia completamente privo di meningi e recidere la parte residua dei nervi ottici. L'obiettivo di questo passaggio è rimuovere la guaina di sostanza bianca per ottenere un involucro di corteccia.Iniziare bloccando il cervello anteriore al bordo e quindi trascinare con attenzione la pinzetta lungo la superficie, avendo cura di non strappare la superficie della corteccia. Successivamente, verificare che il cervello sia privo delle meningi ruotandolo per controllare che non siano presenti meningi residue o grossi vasi superficiali. Dopodiché, a partire dall'estrazione dei tre cervelli dal cranio, il tempo totale per la dissezione non dovrebbe superare le due ore per preservare il tessuto e la sopravvivenza cellulare.Trasferire le cortecce di tre cervelli in sei millilitri di buffer freddo per dissezione in un omogeneizzatore da sette millilitri, quindi dissociare le cortecce con 10 movimenti su e giù con la prima pestello a maggiore gioco, seguiti da 10 movimenti su e giù con il secondo pestello a minore gioco. Successivamente, trasferire sei millilitri della sospensione in un nuovo tubo Falcon da 50 millilitri e lavare l'omogeneizzatore con 24 millilitri di buffer freddo per dissezione, dividendo la sospensione in tre tubi Falcon per ottenere l'equivalente di una corteccia per tubo. Successivamente, centrifugare a 1000 G per cinque minuti a temperatura ambiente.L'osservazione del pellet mostra un gradiente di colore rosa, che rappresenta la parte di microvasi delle cortecce. Scartare ora il soprannatante e omogeneizzare il pellet di una corteccia con un millilitro di soluzione enzimatica contenente una miscela di collagenasi dyse, DNA di tipo uno e gentamicina. Porre i tubi in agitazione per 30 minuti a 37 gradi Celsius.Quindi mescolare un millilitro di digest con 10 millilitri di BSA-HBSS al 25% una X e, successivamente, vortexare delicatamente i tubi prima di separarli mediante centrifugazione basata sulla densità a 3.600 ×g per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione basata sulla densità, il pellet contiene i microvasi e il disco superiore contiene la mielina, il parenchima cerebrale e i microvasi residui. Trasferire con attenzione il disco superiore e il sopranatante in nuovi tubi falcon da 50 millilitri.Si abbia cura di non aspirare il pellet di microvasi; vortexare delicatamente il tubo e ripetere la centrifugazione dipendente dalla densità durante la seconda centrifugazione. Mantenere il pellet risultante contenente i microvasi a quattro gradi Celsius. Dopo la seconda centrifugazione dipendente dalla densità, scartare con attenzione il disco superiore e la miscela snat e risospendere i pellet risultanti contenenti i microvasi provenienti da entrambe le centrifugazioni con un millilitro di HBSS freddo uno x. Successivamente, lavare i microvasi con 20 millilitri di HBSS freddo 1x e centrifugare a 1000 g per cinque minuti. Quindi eliminare il sopranatante, avendo cura di non perdere i microvasi. Omogeneizzare il pellet di microvasi proveniente da una corteccia con un millilitro della stessa soluzione enzimatica, dopo un leggero vortex dei tubi.Digerire ulteriormente i microvasi per un'ora a 37 gradi Celsius in un agitatore. Successivamente, raccogliere in un unico tubo i microvasi digeriti provenienti dalle tre cortecce. Dividere nuovamente la miscela in due tubi falcon da 50 millilitri per ottenere i microvasi estratti dall'equivalente di una corticcia e mezza per tubo.Quindi centrifugare a 1000 G per cinque minuti. A temperatura ambiente, immediatamente prima di seminare i microvasi, prelevare due fiasche T75 rivestite dall'incubatore ed aspirare l'eccesso di rivestimento. Scartare il soprannatante e risospendere il pellet di microvasi in un millilitro di ECM, portando ogni provetta a 10 millilitri con ECM integrato con quattro microgrammi per millilitro.Pur micitina per avviare il processo di purificazione e seminare i microvasi nella fiasca. Successivamente, posizionare le fiasche nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% CO₂ per consentire l'adesione dei microvasi alla matrice di collagene e fibronectina e proseguire con il processo di purificazione. Ventiquattro ore dopo la semina dei microvasi, lavare i detriti cellulari con ECM fresco e sostituire il mezzo di coltura con ECM integrato con quattro microgrammi per millilitro di pur micitina fino al giorno cinque, mantenendo le fiasche nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% CO₂. Ventiquattro ore dopo la semina, le cellule endoteliali iniziano a migrare e diffondersi sulla matrice di collagene e fibronectina. Al giorno cinque, per completare il processo di purificazione, lavare i detriti cellulari con ECM fresco e sostituire il mezzo di coltura con ECM integrato con due microgrammi per millilitro.Puramycin per altri tre giorni per la proliferazione. All'ottavo giorno, lavare le cellule e aggiungere insulina, transferrina e selenito di sodio. Integrare il mezzo di coltura fino a quando le colture raggiungono una confluenza del 90% al decimo giorno.All'ottavo giorno, preparare i filtri di tre piastre a 12 pozzetti rivestendoli con una miscela di collagene di tipo quattro e fibronectina, entrambi a 0,5 microgrammi per centimetro quadrato in acqua sterile per colture. Iniziare aggiungendo 1,5 millilitri di acqua sterile per colture nel compartimento inferiore.Quindi aggiungere 0,5 millilitri di mix nel compartimento superiore. Lasciare aderire la matrice a 37 gradi Celsius fino alla semina delle cellule endoteliali nello stesso giorno, cinque giorni prima dell'instaurazione della co-coltura. Scongelare gli astrociti da provette criogeniche a 37 gradi Celsius e trasferire le cellule in un tubo falcon da 15 millilitri con 10 millilitri di GCM centrifugato.Sospendere a 120 G per otto minuti a temperatura ambiente. Quindi risospendere il pellet di astrociti nel mezzo GCM e seminare a una densità di 30.000 cellule per centimetro quadrato. Inserire le piastre a 12 pozzetti nell'incubatrice a 37 gradi Celsius, 5% CO2 al giorno 10, poco prima della dissociazione delle RBEC con tripsina.Lavare il filtro pre-codificato con mezzo DMM F 12, riempire preventivamente le camere con ECM e riposizionarle nell'incubatrice fino alla semina di RBEC nella stessa giornata. Lavare le RBEC due volte con DPBS privo di calcio e magnesio. Aggiungere quattro millilitri di soluzione calda di tripsina EDTA per ogni fiala T 75 a 37 gradi Celsius per esattamente 30 secondi e rimuovere 3,5 millilitri di soluzione di tripsina EDTA.Assicurarsi che vi sia sempre uno strato di tripsina EDTA a coprire le cellule endoteliali. Successivamente, osservare al microscopio il distacco delle cellule. Quando lo strato cellulare inizia a staccarsi dalla matrice, battere delicatamente sul bordo della fiala T 75 finché tutte le cellule non risultano in sospensione.Aggiungere tre millilitri di ECM in ogni fiala T75 e trasferire in un tubo falcon da 50 millilitri. Ripetere questo passaggio due volte, lavando il mezzo per recuperare tutte le cellule.Dissociare molto delicatamente la sospensione cellulare aspirando e dispensando quattro volte con una pipetta da 10 millilitri dotata di punta gialla. Contare le cellule nella sospensione e piastrarle immediatamente, il giorno seguente, ad alta densità sui filtri pre-codificati e pre-riempiti. Cambiare due volte il mezzo del compartimento superiore per rimuovere i detriti cellulari, al fine di evitare il danneggiamento del monostrato cellulare durante il rinnovo del mezzo.Inclinare leggermente la piastra e non avvicinare mai la pipetta di aspirazione troppo, lasciando sempre del mezzo sopra il monostrato cellulare, in modo da evitare l'essiccamento del monostrato durante la sostituzione del mezzo. Lavare solo sei inserti alla volta. 24 ore dopo la semina, il monostrato cellulare deve aver raggiunto la confluenza.Quindi, nello stesso giorno, un giorno prima dell'instaurazione della coltura co-coltura, sostituire il terreno di coltura degli astrociti con 1,5 millilitri di terreno di differenziamento supplementato al giorno 12, considerato il primo giorno di differenziamento. Sostituire il terreno di coltura dai filtri contenenti le RBEC con terreno di differenziamento. Successivamente, trasferire i filtri con le RBEC nelle pozzette contenenti gli astrociti in queste condizioni.I modelli in vitro differenziano ed esprimono proteine associate alle giunzioni entro tre giorni e il differenziamento ottimale dura altri tre giorni. Qui, il monocstrato cellulare è stato immunomarcato con mentone per rivelare un monocstrato confluito di cellule endoteliali cerebrali con morfologia non sovrapposta e tipiche cellule a forma di fuso con caratteristiche endoteliali, oltre all'espressione delle proteine delle giunzioni strette claudina-5, ZO-1 e occludina. L'integrità del monocstrato nel modello BBB a 12 pozzetti è stata valutata misurando il trasporto del giallo di lucifero.I risultati sono espressi in termini di permeabilità o PE in 10 alla meno tre centimetri al minuto, e la barriera è considerata permeabile o aperta quando il PE del LY è superiore a 0,6 volte 10 alla meno tre centimetri al minuto. Negli ultimi decenni, numerose pubblicazioni e revisioni hanno fornito informazioni su modelli in vitro statici e dinamici della BEE provenienti da diverse specie. Tuttavia, tali modelli rimangono difficili da gestire e la riproducibilità della qualità della barriera continua a rappresentare un obiettivo fondamentale.Dopo aver visionato questo video, gli scienziati dovrebbero avere una buona comprensione di come produrre e caratterizzare un modello in vitro della BPP.

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Questo video descrive un test di permeabilità per valutare la permeabilità della barriera emato-encefalica in vitro utilizzando molecole di fluoresceina di sodio.

Saggio di permeabilità mimica della barriera emato-encefalica: un test in vitro per valutare la permeabilità della BBB che imita le molecole traccianti

Questo video mostra un metodo per studiare la permeazione attraverso un modello di barriera emato-encefalica (BBB) in vitro utilizzando astrociti e cellule endoteliali su un inserto di membrana, con FITC libero e ferritina caricata con FITC. FITC-ferritina si è legata ai recettori sulle cellule endoteliali e ha attraversato la barriera di membrana fino alla camera inferiore, mentre la FITC libera ha mostrato una permeazione limitata ed è rimasta nella camera superiore.

Studio della permeazione di FITC e FITC-ferritina attraverso un modello di barriera emato-encefalica in vitro

Viene descritto e convalidato un metodo per stabilire un modello in vitro di barriera emato-encefalica basato su una co-coltura di cellule endoteliali microvascolari di ratto e astrociti. Questo sistema si è rivelato un valido strumento per studiare l'effetto della nanoformulazione sulla permeazione trans-barriera di molecole fluorescenti.

In Vitro permeazione di ferritine FITC-caricati attraverso un Rat barriera emato-encefalica: un modello per studiare la consegna di Nanoformulated Molecole

Qui, descriviamo un modello murino in vitro della barriera emato-encefalica che fa uso della spettroscopia delle cellule di impedenza, con particolare attenzione alle conseguenze sull'integrità e la permeabilità delle cellule endoteliali in seguito all'interazione con le cellule T attivate.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello della barriera emato-encefalica Utilizzando spettroscopia di impedenza: un focus sui T Cell-endoteliale cellulare Interazione

Il mantenimento della copertura della barriera emato-sangue è fondamentale per l'omeostasi del sistema nervoso centrale. Questo protocollo descrive tecniche in vitro per delineare i processi fondamentali e patologici che modulano la copertura della barriera emato-sangue.

In vitro dosaggi per valutare la formazione e la rottura del vaso come la barriera emato-cerebrale

L'obiettivo del protocollo è di presentare una procedura ottimizzata per la creazione di un modello in vitro barriera ematomeningea (BBB) basato sulle cellule endoteliali cerebrali primari porcina (pBECs). Il modello mostra un'elevata riproducibilità, alta tenuta ed è adatto per studi di trasporto e traffico intracellulare nella scoperta della droga.

Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello

Qui presentiamo un'analisi di permeabilità vascolare del cervello del mouse usando iniezione intraperitoneale di traccianti fluorescenti seguita da aspersione che è applicabile ai modelli animali di disfunzione della barriera emato - encefalica. Un hemi-cervello è usato per valutare quantitativamente permeabilità e l'altro per la visualizzazione dell'elemento tracciante/immunostaining. La procedura richiede 5-6 h per 10 topi.

In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

Qui, è descritto un metodo per l'isolamento dei microvasi cerebrali di ratto e per la preparazione di campioni di membrana. Questo protocollo ha il chiaro vantaggio di produrre arricchito del microvessel campioni con proteina accettabile resa da singoli animali. Campioni possono quindi essere utilizzati per analisi di robusta proteina presso l'endotelio microvascolare cerebrale.

Un metodo semplice e riproducibile per preparare campioni di membrana da microvasi cerebrali appena isolati del ratto

Questo protocollo descrive un metodo per stabilire un modello umano di barriera emato-encefalica (BBB) in vitro . Le cellule endoteliali e i periciti sono seminati su ciascun lato di un filtro inserto (compartimento sanguigno) e gli astrociti sono seminati nel pozzetto inferiore (compartimento cerebrale). Il modello caratterizzato è stato utilizzato per esperimenti di trasporto di nanoparticelle.

Un sistema di cellule a tripla coltura che modella la barriera emato-encefalica umana

La barriera emato-encefalica (BBB) ha un ruolo cruciale nel sostenere un ambiente cerebrale stabile e sano. La disfunzione della BBB è associata a molte malattie neurologiche. Abbiamo sviluppato un modello 3D derivato da cellule staminali della BBB per studiare la patologia cerebrovascolare, l'integrità della BBB e il modo in cui la BBB viene alterata dalla genetica e dalla malattia.

Ricostruzione della barriera emato-encefalica in vitro per modellare e colpire terapeuticamente la malattia neurologica

Questo protocollo descrive un modello in vitro affidabile ed efficiente della barriera emato-encefalica. Il metodo utilizza cellule endoteliali vascolari cerebrali di topo bEnd.3 e misura la resistenza elettrica transmembrana.

Registrazione dell'integrità funzionale della barriera su cellule endoteliali vascolari bEnd.3 tramite rilevamento della resistenza elettrica transendoteliale

Impara a stabilire un modello in vitro della barriera emato-encefalica del ratto utilizzando co-culture di cellule endoteliali e astrociti. Questo metodo consente di studiare la permeabilità e i meccanismi di trasporto per la ricerca farmacologica.

Istituzione di un In Vitro Modello di Rat barriera emato-encefalica (BBB): A Focus on BBB impermeabilità e Trasporti recettore-mediata (Video) | JoVE Journal

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