Istituzione di un

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di allestire un modello in vitro altamente riproducibile della barriera ematoencefalica del ratto. Questo risultato si ottiene rimuovendo i nervi ottici, il cervelletto e le meningi al microscopio stereoscopico, separando successivamente i due emisferi cerebrali e dissezionandoli per ottenere un frammento di corteccia privo di contaminazioni. Il secondo passaggio consiste nell'isolare i microvasi dalla corteccia mediante trattamento enzimatico e centrifugazione basata sulla densità.

Successivamente, i microvasi vengono seminati e incubati con puromicina per purificare le cellule endoteliali da cellule contaminanti come i parassiti. Colture pure di cellule endoteliali cerebrali proliferano fino a quando le cellule raggiungono una confluenza del 90%. L'ultimo passaggio consiste nell'indurre la differenziazione delle cellule endoteliali cerebrali del ratto posizionando le cellule nella camera superiore dei filtri ad inserto e co-coltivandole con astrociti di ratto che sono stati precedentemente preparati e seminati.

In definitiva, il monocstrato di cellule endoteliali cerebrali differenziate può essere caratterizzato mediante l'espressione di specifiche proteine delle giunzioni strette e tramite l'indice di permeabilità di un composto di riferimento attraverso il monocstrato di cellule endoteliali dal compartimento superiore. I modelli in vitro della BEE, come quello qui presentato, sono utili per esplorare la distribuzione cellulare di molecole chiave e per chiarire i meccanismi cellulari e molecolari di base del funzionamento della BEE. In particolare, tali modelli permettono di studiare i recettori della BEE e il loro coinvolgimento nel traffico endocitico e nella transcitosi, secondo le nostre osservazioni.

I modelli in vitro della BEE sono utilizzati principalmente per studiare il targeting di recettori specifici mediante vettori peptidici che sviluppiamo. Per facilitare il rilascio di farmaci al sistema nervoso centrale attraverso la BEE, utilizziamo un processo chiamato transcitosi mediata da recettore, noto anche come approccio del cavallo di Troia. La descrizione visiva è fondamentale, poiché chi si approccia per la prima volta a questo metodo dovrà possedere abilità di dissezione e dovrà utilizzare un microscopio con sufficiente rapidità e precisione da garantire la sopravvivenza del tessuto durante il processo di produzione cellulare.

Un altro punto fondamentale è la chiusura precoce della zona fragile e della regione del tele salmon per evitare l'apertura della barriera durante gli esperimenti. Infine, questa procedura illustrerà nei dettagli i passaggi chiave che differenzieranno i protocolli rossi da quelli visualizzati, dimostrando che la procedura sarà eseguita da me e dal mio collega. Iniziare questa procedura rivestendo due fiasche T75 con collagene di tipo quattro e fibronectina a una concentrazione di un microgrammo per centimetro quadrato in acqua di coltura sterile, e lasciarli aderire nell'incubatrice a 37 gradi Celsius fino alla semina dei microvasi.

Dopo due giorni, rimuovere il cervello dal cranio di tre ratti Vista di cinque settimane di età e trasferire i cervelli in una piastra di Petri contenente buffer di dissezione freddo posta su ghiaccio. Dissezionare i cervelli eliminando il cervelletto e i nervi ottici. Quindi tagliare ciascun cervello a metà per separare i due emisferi cerebrali sotto il microscopio stereoscopico.

Eseguire un altro taglio per rimuovere il mesencefalo e trasferire tutti e quattro i cervelli in una nuova piastra di Petri pulita posta sul ghiaccio con tampone di dissezione. Successivamente, trasferire un proencefalo in una nuova piastra di Petri riempita con tampone di dissezione freddo. Trattenerlo con una pinza e staccare con cura le meningi dai margini del proencefalo.

Successivamente, capovolgere il proencefalo ed estrarre con cura le meningi senza strapparle. Assicurarsi che il proencefalo sia completamente privo di meningi e recidere la parte residua dei nervi ottici. L'obiettivo di questo passaggio è rimuovere la guaina di sostanza bianca per ottenere un involucro di corteccia.

Iniziare bloccando il cervello anteriore al bordo e quindi trascinare con attenzione la pinzetta lungo la superficie, avendo cura di non strappare la superficie della corteccia. Successivamente, verificare che il cervello sia privo delle meningi ruotandolo per controllare che non siano presenti meningi residue o grossi vasi superficiali. Dopodiché, a partire dall'estrazione dei tre cervelli dal cranio, il tempo totale per la dissezione non dovrebbe superare le due ore per preservare il tessuto e la sopravvivenza cellulare.

Trasferire le cortecce di tre cervelli in sei millilitri di buffer freddo per dissezione in un omogeneizzatore da sette millilitri, quindi dissociare le cortecce con 10 movimenti su e giù con la prima pestello a maggiore gioco, seguiti da 10 movimenti su e giù con il secondo pestello a minore gioco. Successivamente, trasferire sei millilitri della sospensione in un nuovo tubo Falcon da 50 millilitri e lavare l'omogeneizzatore con 24 millilitri di buffer freddo per dissezione, dividendo la sospensione in tre tubi Falcon per ottenere l'equivalente di una corteccia per tubo. Successivamente, centrifugare a 1000 G per cinque minuti a temperatura ambiente.

L'osservazione del pellet mostra un gradiente di colore rosa, che rappresenta la parte di microvasi delle cortecce. Scartare ora il soprannatante e omogeneizzare il pellet di una corteccia con un millilitro di soluzione enzimatica contenente una miscela di collagenasi dyse, DNA di tipo uno e gentamicina. Porre i tubi in agitazione per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Quindi mescolare un millilitro di digest con 10 millilitri di BSA-HBSS al 25% una X e, successivamente, vortexare delicatamente i tubi prima di separarli mediante centrifugazione basata sulla densità a 3.600 ×g per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione basata sulla densità, il pellet contiene i microvasi e il disco superiore contiene la mielina, il parenchima cerebrale e i microvasi residui. Trasferire con attenzione il disco superiore e il sopranatante in nuovi tubi falcon da 50 millilitri.

Si abbia cura di non aspirare il pellet di microvasi; vortexare delicatamente il tubo e ripetere la centrifugazione dipendente dalla densità durante la seconda centrifugazione. Mantenere il pellet risultante contenente i microvasi a quattro gradi Celsius. Dopo la seconda centrifugazione dipendente dalla densità, scartare con attenzione il disco superiore e la miscela snat e risospendere i pellet risultanti contenenti i microvasi provenienti da entrambe le centrifugazioni con un millilitro di HBSS freddo uno x.

Successivamente, lavare i microvasi con 20 millilitri di HBSS freddo 1x e centrifugare a 1000 g per cinque minuti. Quindi eliminare il sopranatante, avendo cura di non perdere i microvasi. Omogeneizzare il pellet di microvasi proveniente da una corteccia con un millilitro della stessa soluzione enzimatica, dopo un leggero vortex dei tubi.

Digerire ulteriormente i microvasi per un'ora a 37 gradi Celsius in un agitatore. Successivamente, raccogliere in un unico tubo i microvasi digeriti provenienti dalle tre cortecce. Dividere nuovamente la miscela in due tubi falcon da 50 millilitri per ottenere i microvasi estratti dall'equivalente di una corticcia e mezza per tubo.

Quindi centrifugare a 1000 G per cinque minuti. A temperatura ambiente, immediatamente prima di seminare i microvasi, prelevare due fiasche T75 rivestite dall'incubatore ed aspirare l'eccesso di rivestimento. Scartare il soprannatante e risospendere il pellet di microvasi in un millilitro di ECM, portando ogni provetta a 10 millilitri con ECM integrato con quattro microgrammi per millilitro.

Pur micitina per avviare il processo di purificazione e seminare i microvasi nella fiasca. Successivamente, posizionare le fiasche nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% CO₂ per consentire l'adesione dei microvasi alla matrice di collagene e fibronectina e proseguire con il processo di purificazione. Ventiquattro ore dopo la semina dei microvasi, lavare i detriti cellulari con ECM fresco e sostituire il mezzo di coltura con ECM integrato con quattro microgrammi per millilitro di pur micitina fino al giorno cinque, mantenendo le fiasche nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% CO₂. Ventiquattro ore dopo la semina, le cellule endoteliali iniziano a migrare e diffondersi sulla matrice di collagene e fibronectina. Al giorno cinque, per completare il processo di purificazione, lavare i detriti cellulari con ECM fresco e sostituire il mezzo di coltura con ECM integrato con due microgrammi per millilitro.

Puramycin per altri tre giorni per la proliferazione. All'ottavo giorno, lavare le cellule e aggiungere insulina, transferrina e selenito di sodio. Integrare il mezzo di coltura fino a quando le colture raggiungono una confluenza del 90% al decimo giorno.

All'ottavo giorno, preparare i filtri di tre piastre a 12 pozzetti rivestendoli con una miscela di collagene di tipo quattro e fibronectina, entrambi a 0,5 microgrammi per centimetro quadrato in acqua sterile per colture. Iniziare aggiungendo 1,5 millilitri di acqua sterile per colture nel compartimento inferiore.

Quindi aggiungere 0,5 millilitri di mix nel compartimento superiore. Lasciare aderire la matrice a 37 gradi Celsius fino alla semina delle cellule endoteliali nello stesso giorno, cinque giorni prima dell'instaurazione della co-coltura. Scongelare gli astrociti da provette criogeniche a 37 gradi Celsius e trasferire le cellule in un tubo falcon da 15 millilitri con 10 millilitri di GCM centrifugato.

Sospendere a 120 G per otto minuti a temperatura ambiente. Quindi risospendere il pellet di astrociti nel mezzo GCM e seminare a una densità di 30.000 cellule per centimetro quadrato. Inserire le piastre a 12 pozzetti nell'incubatrice a 37 gradi Celsius, 5% CO2 al giorno 10, poco prima della dissociazione delle RBEC con tripsina.

Lavare il filtro pre-codificato con mezzo DMM F 12, riempire preventivamente le camere con ECM e riposizionarle nell'incubatrice fino alla semina di RBEC nella stessa giornata. Lavare le RBEC due volte con DPBS privo di calcio e magnesio. Aggiungere quattro millilitri di soluzione calda di tripsina EDTA per ogni fiala T 75 a 37 gradi Celsius per esattamente 30 secondi e rimuovere 3,5 millilitri di soluzione di tripsina EDTA.

Assicurarsi che vi sia sempre uno strato di tripsina EDTA a coprire le cellule endoteliali. Successivamente, osservare al microscopio il distacco delle cellule. Quando lo strato cellulare inizia a staccarsi dalla matrice, battere delicatamente sul bordo della fiala T 75 finché tutte le cellule non risultano in sospensione.

Aggiungere tre millilitri di ECM in ogni fiala T75 e trasferire in un tubo falcon da 50 millilitri. Ripetere questo passaggio due volte, lavando il mezzo per recuperare tutte le cellule.

Dissociare molto delicatamente la sospensione cellulare aspirando e dispensando quattro volte con una pipetta da 10 millilitri dotata di punta gialla. Contare le cellule nella sospensione e piastrarle immediatamente, il giorno seguente, ad alta densità sui filtri pre-codificati e pre-riempiti. Cambiare due volte il mezzo del compartimento superiore per rimuovere i detriti cellulari, al fine di evitare il danneggiamento del monostrato cellulare durante il rinnovo del mezzo.

Inclinare leggermente la piastra e non avvicinare mai la pipetta di aspirazione troppo, lasciando sempre del mezzo sopra il monostrato cellulare, in modo da evitare l'essiccamento del monostrato durante la sostituzione del mezzo. Lavare solo sei inserti alla volta. 24 ore dopo la semina, il monostrato cellulare deve aver raggiunto la confluenza.

Quindi, nello stesso giorno, un giorno prima dell'instaurazione della coltura co-coltura, sostituire il terreno di coltura degli astrociti con 1,5 millilitri di terreno di differenziamento supplementato al giorno 12, considerato il primo giorno di differenziamento. Sostituire il terreno di coltura dai filtri contenenti le RBEC con terreno di differenziamento. Successivamente, trasferire i filtri con le RBEC nelle pozzette contenenti gli astrociti in queste condizioni.

I modelli in vitro differenziano ed esprimono proteine associate alle giunzioni entro tre giorni e il differenziamento ottimale dura altri tre giorni. Qui, il monocstrato cellulare è stato immunomarcato con mentone per rivelare un monocstrato confluito di cellule endoteliali cerebrali con morfologia non sovrapposta e tipiche cellule a forma di fuso con caratteristiche endoteliali, oltre all'espressione delle proteine delle giunzioni strette claudina-5, ZO-1 e occludina. L'integrità del monocstrato nel modello BBB a 12 pozzetti è stata valutata misurando il trasporto del giallo di lucifero.

I risultati sono espressi in termini di permeabilità o PE in 10 alla meno tre centimetri al minuto, e la barriera è considerata permeabile o aperta quando il PE del LY è superiore a 0,6 volte 10 alla meno tre centimetri al minuto. Negli ultimi decenni, numerose pubblicazioni e revisioni hanno fornito informazioni su modelli in vitro statici e dinamici della BEE provenienti da diverse specie. Tuttavia, tali modelli rimangono difficili da gestire e la riproducibilità della qualità della barriera continua a rappresentare un obiettivo fondamentale.

Dopo aver visionato questo video, gli scienziati dovrebbero avere una buona comprensione di come produrre e caratterizzare un modello in vitro della BPP.