Profiling di microRNA regolati dagli estrogeni in cellule di carcinoma mammario

L'obiettivo generale di questa procedura è definire i microRNA che i recettori degli estrogeni possono regolare. Ciò si ottiene preparando prima le cellule per la massima risposta agli estrogeni attraverso la coltura per una confluenza ottimale e l'esaurimento dell'attività estrogenica. Il secondo passo consiste nell'indurre l'attività trascrizionale dei recettori degli estrogeni mediante trattamento con estradiolo per il numero richiesto di punti temporali.

Sono inclusi controlli appropriati per i confronti. Successivamente, l'RNA, compresa la popolazione di micro RNA, viene estratto e convertito in CD NA noto per estrogeni. I geni bersaglio vengono quindi misurati utilizzando la QPCR per confermare che il protocollo di trattamento ha avuto successo.

Il passo finale consiste nel determinare il modello di espressione del micro RNA a livello di genoma utilizzando tecnologie di screening su larga scala. Infine, viene eseguita l'analisi di conferma mediante QPCR. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro al seno, come ad esempio se e come gli estrogeni influenzano l'espressione del micro RNA.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul cancro al seno, può anche essere applicato ad altri sistemi come altri tumori o tipi di cellule che esprimono il recettore degli estrogeni alfa o amaro. Le sette cellule MC utilizzate in questo studio vengono preparate cinque giorni prima del trattamento in una cappa sterile. Rimuovere il terreno dal matraccio T 75 utilizzando una pipetta sterile per pascolo collegata a un vuoto.

Lavare delicatamente le cellule attaccate due volte con PBS e staccare le cellule con la tripsina. Contare le celle utilizzando un contatore di celle secondo il protocollo del produttore. Etichettare sei piastre da 100 millilitri e aggiungere 10 millilitri di terreno a ciascuna piastra.

Piastra circa 2 milioni di cellule per piastra e distribuisci le cellule facendo roteare delicatamente la piastra. Incubare le cellule per 24-48 ore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 fino a quando le cellule sono confluenti all'80% circa. Da due a quattro giorni dopo, estrarre le cellule dall'incubatore a 37 gradi Celsius e osservarle al microscopio per assicurarsi che siano confluenti per circa l'80%.

La confluenza cellulare è un fattore importante perché influenza il contatto tra cellule e comportamenti come la segnalazione e la proliferazione da cellula a cellula. Lavare le cellule due volte con PBS e quindi aggiungere il terreno appropriato con il 5% di FBS che è stato filtrato per rimuovere i composti estrogenici. FBS o D-C-C-F-B-S trattati con carbone di Dexter incubano le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 il giorno successivo.

Lavare le cellule due volte con PBS e aggiungere il terreno D-C-C-F-B-S appropriato allo 0,5%, incubare le cellule per altre 48 ore il giorno del trattamento. Preparare i reagenti per il trattamento cellulare in una provetta conica da 50 millilitri. Innanzitutto, aggiungere 30 millilitri del terreno D-C-C-F-B-S allo 0,5% appropriato, seguito da tre microlitri di un 0,1 millimolare E due celle di lavaggio del ligando due volte con PBS.

Assicurati di rimuovere la maggior parte del PBS possibile. Mescolare delicatamente il contenuto di ciascuna provetta e aggiungere 10 millilitri alle cellule di ciascuna piastra. Dovrebbe esserci un ligando per piastra.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2 per un periodo di tempo scelto tra zero e 72 ore. Sostituire il terreno secondo necessità dopo il completamento del trattamento per il periodo di tempo desiderato. Togliete le piastre dall'incubatrice e portatele su una cappa aspirante.

Poiché questa procedura utilizza una soluzione tossica di tiocianato di guana dium tiocianato di fenolo, utilizzare dispositivi di protezione individuale adeguati, lavare le celle due volte con PBS. Quindi aggiungere uno o due millilitri di soluzione di tiocianato di giudio fenolo alle cellule di ciascuna piastra. Assicurarsi che il volume delle celle non superi il 10% del volume della soluzione di tiocianato di guadium tiocianato e che la piastra sia coperta con la soluzione.

Lascia riposare le cellule per un minuto. Quindi, utilizzare un raschietto di gomma per raschiare le cellule e trasferire le cellule in una microcentrifuga. Le celle provette possono essere conservate in questa soluzione a meno 80 gradi Celsius per settimane.

L'estrazione di RNA di alta qualità è molto importante per il successo di questa procedura. Pertanto, le fasi successive devono essere eseguite sotto RNA. Condizioni libere Per estrarre l'RNA totale da ogni trattamento vorticare una miscela di cellule per un minuto e girare rapidamente.

Aggiungere 200 microlitri di cloroformio per un millilitro di soluzione di tiocianato di guadium tiocianato fenolico. Agitare per 15 secondi e incubare per due o tre minuti a temperatura ambiente, centrifugare a 11.000 giri/min e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Trasferire la fase acquosa superiore in una nuova provetta per microcentrifuga.

Aggiungere 1,5 volumi di etanolo al 100% e miscelare mediante pipettaggio. Trasferire la soluzione in una colonna di centrifuga e purificare l'RNA mediante purificazione della colonna di centrifuga del micro RNA, seguita dalla degradazione 1D NA di DN a secondo il protocollo del produttore. Successivamente, l'RNA viene alluso in 60 microlitri di RNA aliquote di acqua libera, da uno a due microlitri di RNA per la quantificazione e l'analisi della qualità e immagazzina il resto dell'RNA a meno 80 gradi Celsius.

Dopo aver confermato che il trattamento delle cellule ha portato alla regolazione di bersagli noti e sensibili agli estrogeni, come l'mRNA, la profilazione del micro RNA viene eseguita utilizzando sia il microfluidico a flusso di micropotenza, i microarray e le sonde a doppia marcatura, gli array a bassa densità o D-L-P-L-D-A per eseguire la profilazione del micro RNA utilizzando D-L-P-L-D-A, rimuovere le piastre D-L-P-L-D-A dal frigorifero e lasciarle riposare a temperatura ambiente durante l'esecuzione della reazione di trascrizione inversa per generare CDNA dai campioni di RNA. Quando le piastre D-L-P-L-D-A hanno raggiunto la temperatura ambiente, caricare 100 microlitri di CDNA miscelati con le sonde a doppia etichetta. PCR master miscelare in ciascuna delle otto porte di riempimento di una piastra.

Centrifugare le piastre array. Aprire brevemente il sistema Q-R-T-P-C-R e verificare che il blocco sia per una piastra da 384 pozzetti. Imposta la corsa.

Utilizzando il software SDS, selezionare la quantificazione relativa. Selezionare il numero del pozzetto e il tipo di array e inserire le descrizioni dei campioni per definire i pozzetti. Eseguire l'array utilizzando le condizioni di ciclo termico predefinite.

Al termine dell'esecuzione, salvare i risultati, esportare i risultati in Microsoft Excel e salvarli per ulteriori analisi. Un metodo per confermare le regolazioni dei micro RNA è l'analisi del cianuro D-Q-P-C-R. Il primo passo è quello di progettare primer la sequenza del micro RNA maturo, che equivale al primer diretto può essere ottenuta da semplici based.org.

Converti tutti gli UES in ts Successivamente, prepara il CD NA, posiziona un microgrammo di RNA totale e una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Includi un controllo negativo con acqua invece dell'RNA totale. Seguire le istruzioni per il codardo in polietilene A e il primo filamento CD nna.

Sintesi di micro RNA da un micro RNA sintesi di cDNA a primo filamento e protocollo Q-R-T-P-C-R. Diluire il CD NA risultante da uno a 10 con acqua purificata e conservare a meno 20 gradi Celsius. Ottenere 1 piastra di reazione da 96 pozzetti.

Preparare il master mix A-Q-P-C-R. Per ogni master micro R-N-A-Q-P-C-R, aggiungere bene due picamoli di ciascuno dei primer diretti specifici e del primer universale. Cinque microlitri di due master mix X-Q-P-C-R e acqua purificata.

Aliquotare il composto in ciascuno. Bene, infine aggiungi 16 nanogrammi di polietilene a CD NA per ogni campione e includi controlli negativi. Il volume finale di reazione dovrebbe essere di 10 microlitri per pozzetto Assicurarsi che ci siano pozzetti triplicati per ogni campione per ogni micro RNA per le repliche tecniche e per i controlli negativi.

Inoltre, includere uno o più geni di riferimento, di solito U sei s nrp, RNA e/o un micro RNA che non viene modificato sul software del sistema Q-R-T-P-C-R. Assegna il reporter e l'obiettivo Immettere il volume di reazione. Selezionare il metodo del ciclo di soglia comparativo e definire i pozzetti del campione.

Eseguire le piastre utilizzando le impostazioni di default per la seduta. Assicurarsi che venga eseguita un'analisi della curva di fusione per tutte le condutture di stampi ciano al termine della seduta. Salva i risultati ed esporta tutti i dati, inclusi i valori CT in Microsoft Excel.

L'estrazione efficiente di RNA di alta qualità dai campioni è un fattore importante per il successo di questo studio. Dopo l'estrazione, le concentrazioni di RNA vengono misurate con uno spettrofotometro come mostrato in questo risultato rappresentativo. Ogni picco illustrato nel pannello superiore rappresenta un campione e un processo di estrazione riuscito che produce RNA puro.

Al contrario, un RNA scarsamente estratto illustrato nel pannello inferiore non mostra un chiaro picco di assorbimento a 260 nanometri. Per il controllo di qualità dell'RNA, è stata misurata l'integrità dell'RNA e i risultati sono stati confrontati con una scala dell'RNA. Il 18 s e il 28 S-R-R-N-A dovrebbero avere picchi in un campione di RNA di buona qualità, come mostrato qui.

Un campione di RNA degradato avrebbe picchi meno chiari e una quantità relativa ridotta di 18 s e 28 S-R-R-N-A come mostrato qui. L'analisi della popolazione di micro NA può essere eseguita separatamente. Il microarray di micro RNA risulta da un confronto tra veicolo ed E due campioni trattati sono rappresentati graficamente da questa mappa termica.

Il mero a, il mero B e il mero C sono sovraregolati nei due campioni trattati E come indicato in rosso, mentre il semplice D, la semplice e, il semplice F e il semplice G sono sottoregolati nei due campioni trattati E come indicato in verde. La selezione dei micro RNA dipende dal loro significato ed espressione. Un valore P inferiore a 0,05 è solitamente considerato significativo e dovrebbe essere selezionato per un'ulteriore convalida con QPCR.

Gli array a bassa densità a doppia sonda marcata utilizzano un metodo basato su A-Q-P-C-R per lo screening dei microRNA regolati. In un formato a 384 pozzetti, sono mostrati i grafici di amplificazione per i micro RNA dal D-L-P-L-D-A. L'amplificazione dei microRNA espressi è indicata dall'aumento dei valori di RN.

Le convalide possono essere eseguite utilizzando due metodi di rilevamento QPCR per prevenire distorsioni del metodo e per consentire una conferma e un'indagine approfondite delle normative micro NA. Il primo metodo utilizza la rilevazione del colorante al cianuro per analizzare la curva di fusione di un micro RNA come controllo per l'amplificazione. Specificità. L'amplificazione del frammento previsto risulterà in un picco uniforme chiaramente definito, come mostrato nel pannello di sinistra.

Si osservano picchi multipli se il primer è aspecifico o se si formano quantità specifiche di dimero del primer, come illustrato dal pannello di destra. In questo caso, i dati non possono essere utilizzati per l'analisi delle espressioni. Il secondo metodo, sonde a doppia marcatura, l'analisi QPCR è più specifica in quanto viene rilevata solo l'amplificazione del micro RNA bersaglio di ciascun bersaglio.

Il micro RNA può essere osservato come mostrato qui per entrambi i saggi QPCR. È necessario un confronto con un gene di riferimento per determinare l'espressione relativa dei geni tra due campioni. Un esempio di gene di riferimento adatto in queste linee cellulari di cancro al seno è l'inibitore della dissociazione GDP RO A-R-H-G-D-I-A-A.

Come osservato in questa figura, il livello di mRNA di A-R-H-G-D-I-A non viene modificato tra il veicolo e i campioni trattati con ligando. Un gene di riferimento ampiamente accettato per l'analisi dei micro RNA è U six snrp, RNA. Il piccolo RNA nucleare non codificante lungo circa 110 nucleotidi che funziona in prem nucleare.

Come osservato in questa figura U sei livelli di espressione sono più o meno gli stessi nei campioni mostrati, consentendo così di calcolare i livelli variabili di micro RNA. Questa figura finale mostra una rappresentazione grafica dei risultati del micro R-N-A-Q-P-C-R dal veicolo e dalle cellule E due trattate, confrontando i livelli di espressione relativi di uno specifico micro RNA di soli 135 A in un corso temporale. Questo micro RNA è stato rilevato come non regolato fino a 24 ore dopo il trattamento con E 2, ma una regolazione significativa è stata rilevata 72 ore dopo il trattamento A seguito di questa procedura.

Altri metodi, come l'immunoprecipitazione della cromatina del recettore SDR N, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se il microRNA è direttamente regolato dal recettore attraverso il legame con le regioni regolatorie della cromatina CIS. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare la regolazione mediata dagli estrogeni dei microRNA in modo robusto. È molto importante eseguire i vari controlli e replicare i passaggi come descritto in questo protocollo per accertarsi di rilevare vere normative e non variazioni biologiche o tecniche.