Sequenziale

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di monitorare e quantificare in modo sequenziale la migrazione, la proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali e progenitrici osteogeniche endogene nel processo di riparazione della frattura ossea. Ciò viene ottenuto innanzitutto etichettando in vivo le cellule positive per il mixovirus, resistenza al virus dell'influenza, o MX1, mediante iniezione di acido poli-citidilico poli-inosinico, e successivamente eliminando le cellule ematopoietiche residenti positive per MX1 attraverso irradiazione. Nel secondo passaggio, vengono somministrate sistematicamente cellule di midollo osseo di tipo selvaggio ai topi irradiati.

In seguito, vengono generate microfratture nell'area Cal del topo mediante perforazione con ago. Infine, viene effettuata un'immagine sequenziale intravitale del ripristino della microfratture. In ultima analisi, queste immagini intravitali possono essere utilizzate per valutare la dinamica dell'afflusso e dell'espansione delle cellule staminali e progenitrici osteogeniche nei siti di frattura.

Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella possibilità di effettuare un'immagine ripetuta in vivo delle cellule staminali e progenitrici osteogeniche durante il processo di guarigione delle fratture. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della guarigione delle fratture e dell'osteoporosi, poiché questo metodo offre uno strumento innovativo per il monitoraggio delle cellule staminali progenitrici osteogeniche endogene nella rigenerazione e riparazione ossea.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la generazione di microfratture con danno tissutale minimo e l'imaging ripetuto in vivo della lesione da frattura senza indurre una marcata formazione di tessuto cicatriziale sono aspetti cruciali del metodo e rappresentano una sfida tecnica. Per etichettare le cellule MX one positive in vivo, iniettare 200 microlitri di acido poli-citidilico poli-acido per 20 grammi di peso del topo reporter MX one Cree per via intraperitoneale una volta ogni due giorni per 10 giorni. Successivamente, per eliminare le cellule ematopoietiche residenti MX one positive, irradiare i topi iniettati con una singola dose di 9,5 gras. Dopo 24 ore, trapiantare 1 × 10⁶ cellule di midollo osseo di tipo selvaggio per via endovenosa per topo.

Quattro a sei settimane dopo, anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale con 50 microlitri di xilazina chetamina. Dopo aver confermato la sedazione mediante pizzicamento del dito del piede, rimuovere il cuoio capelluto del topo trapiantato con cellule del midollo osseo e quindi sterilizzare la cute esposta con un batuffolo imbevuto di alcol al 70%. Applicare un gel lacrimale per prevenire la disidratazione della cornea, quindi praticare un'incisione trasversale lunga meno di un centimetro lungo il cuoio capelluto, partendo da un orecchio e terminando all'altro. Successivamente, ruotare l'animale di circa 60 gradi e proseguire l'incisione fino a raggiungere un punto distante due o tre millimetri dal naso, utilizzando pinze.

Tirare la falda di tessuto verso i lati dell'animale per separare la pelle, in modo che entrambe le ossa frontali e l'intersezione delle suture sagittale e coronale siano ora chiaramente esposte. Irrigare la superficie aperta con PBS sterile, quindi rimuovere delicatamente i peli residui con bastoncini di cotone. Per creare microfratture sul cranio, tenere la testa del mouse con una mano e un ago da 30 gauge con l'altra.

Utilizzare la punta dell'ago da 30 gauge per praticare delicatamente una micro perforazione su un lato delle ossa frontali, vicino all'intersezione delle suture sagittale e coronale. Per evitare di penetrare nel cervello, passare a un ago di calibro maggiore e ruotare il nuovo ago per allargare la perforazione fino a un diametro di circa 0,5 millimetri. Dopo aver creato una seconda perforazione sull'osso frontale controlaterale, aggiungere continuamente PBS in ciascun punto, tamponando fino a quando l'emorragia non si arresta.

Quindi, per evitare il disseccamento, applicare una goccia sufficiente di soluzione salina fisiologica sterile sull'osso cranico in modo da coprire completamente l'area in cui acquisire le immagini Vidal. Accendere innanzitutto lo scanner laser a poligono per consentire l'acquisizione simultanea di immagini multicanale a una velocità video di 30 fotogrammi al secondo. Successivamente, accendere il laser al titanio-sapphire a femtosecondi per l'immagine a più fotoni.

Impostare la potenza e la lunghezza d'onda a 880 nanometri per l'immagine di generazione di armonica secondaria dell'osso del cranio e a 440 nanometri per l'eccitazione di GFP e TD-tomato; accendere i laser a stato solido a 491 nanometri e 561 nanometri. Successivamente, attivare i rilevatori a fotomoltiplicatore per ciascun segnale: un filtro a banda passante di 435 ± 20 nanometri per la generazione di armonica secondaria, un filtro a banda passante di 528 ± 19 nanometri per GFP e un filtro a banda passante di 590 ± 20 nanometri per TD-tomato. Ora, posizionare l'animale su un tavolo motorizzato del microscopio con assi XYZ, sopra un tappetino riscaldante elettrico impostato a 37 gradi Celsius.

Utilizzare del nastro adesivo per mantenere il topo in posizione, quindi applicare una goccia di gel al 2% di metilcellulosa riscaldata sul cranio. Per evitare l'essiccamento, posizionare un vetrino da copertura sull'area di imaging. Successivamente, utilizzare un obiettivo ad immersione in acqua 30x con apertura numerica 0,9 e il controller degli assi XY e Z per rilevare il segnale SHG proveniente dalle ossa.

Per individuare la superficie del calvario, identificare una posizione di riferimento fondamentale, come l'intersezione tra le suture sagittali e le suture coronali, ed acquisire un'immagine. Segnare le coordinate XY, Z del punto di riferimento, quindi continuare a cercare la posizione della lesione utilizzando i segnali SHG e fluorescenti come guide. Quando viene individuata ciascuna regione di interesse, acquisire un'immagine del migliore piano focale contenente i segnali SHG e fluorescenti provenienti dalle cellule di interesse.

Salvare le coordinate XY, Z e la distanza rispetto all'intersezione delle suture sagittale e coronale per definire con precisione la loro posizione per il successivo ciclo di acquisizione di immagini. Successivamente, acquisire le strutture cellulari e ossee tridimensionali della lesione da frattura. Registrare le immagini con intervalli Z di circa due-cinque micron, per una profondità di circa 100 micron dalla superficie endossea.

Infine, dopo aver effettuato l'imaging di entrambi i siti di lesione, utilizzare diverse gocce di soluzione salina sterile per rimuovere il gel di Methylcellulosa al 2% dal cranio. Rivestire ora la superficie con antibiotici e coprire il cranio con le lembi cutanee, richiudere il cuoio capelluto con filo di sutura ipoallergenico e mantenere l'animale in una camera di recupero calda fino a quando non riprende una coscienza sufficiente. Dopo tre-cinque giorni, ripetere i passaggi di imaging intravitale per monitorare le variazioni cellulari durante la guarigione della frattura.

In questo esperimento rappresentativo, sono state indotte due microfratture sui parietali di topi osteocalcina-tomato genici MX1, GFP, dopo irradiazione e successivo trapianto di midollo osseo. L'imaging intravitale 3D sequenziale delle microfratture ha mostrato un riposizionamento delle cellule staminali e progenitrici osteogeniche positive al tomato nel sito della frattura al secondo giorno, nonché la loro espansione al quinto giorno. Sebbene a questo punto non siano stati rilevati osteoblasti positivi al GFP, al dodicesimo giorno un sottoinsieme di progenitori osteogenici vicino alla superficie della frattura ha avviato la differenziazione in osteoblasti positivi al tomato e al GFP, come indicato dalla freccia. L'accumulo di nuovi osteoblasti e la formazione di nuovo osso al ventunesimo giorno indicano che la migrazione e la proliferazione delle cellule progenitrici osteogeniche è stato un meccanismo fondamentale per fornire nuovi osteoblasti necessari alla riparazione della frattura. Per verificare se questo metodo fornisce un'uscita quantitativa e riproducibile del numero di progenitori osteogenici durante la guarigione della frattura, le cellule staminali e progenitrici osteogeniche positive per MX1 e YFP sono state monitorate per 14 giorni dopo la lesione.

Un numero ridotto di progenitori è stato costantemente rilevato sul sito della lesione entro tre giorni. Il numero di cellule è aumentato progressivamente al settimo giorno, raggiungendo una popolazione massima al decimo giorno che si è mantenuta fino al quattordicesimo giorno. La cinetica della generazione dei progenitori osteo è stata quantificata misurando l'intensità del segnale YFP nel tempo e correlata a quella osservata mediante microscopia intra vitale.

I progenitori sono stati osservati per la prima volta al terzo giorno, hanno raggiunto il picco al decimo giorno e sono rimasti a un'intensità simile fino al quattordicesimo giorno. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che tecniche di sutura esperte e un sanguinamento minimo possono ridurre la formazione di cicatrici e abbassare l'autofluorescenza di fondo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come effettuare l'immagine e seguire la migrazione, la proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali progenitrici osteogeniche endogene nel processo di riparazione della frattura.