Sequenziale In vivo Imaging di osteogeniche cellule staminali / progenitrici durante la frattura di riparazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di tracciare e quantificare in sequenza la migrazione, la proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali osteogeniche endogene e delle cellule progenitrici nella riparazione delle fratture ossee. Ciò si ottiene etichettando prima il virus mixo, la resistenza al virus dell'influenza, una o MX una cellule positive in vivo mediante iniezione di acido policinico policinico e quindi eliminando le cellule ematopoietiche positive MX one residenti mediante irradiazione. Nella seconda fase, le cellule del midollo osseo di tipo selvatico vengono sistematicamente somministrate ai topi irradiati.

Successivamente, le micro fratture vengono generate nell'area Cal del topo mediante perforazione ad ago. Infine, viene eseguito l'imaging intraflautico sequenziale della riparazione della microfrattura. In definitiva, queste immagini intravitali possono essere utilizzate per valutare le dinamiche dell'afflusso e dell'espansione delle cellule staminali e progenitrici osteogeniche nei siti di frattura.

Quindi il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'imaging ripetitivo in vivo di cellule staminali e progenitrici osteogeniche durante il corso della guarigione delle fratture. L'implicazione di questa tecnica si estendeva alla terapia della guarigione delle fratture e dell'osteoporosi. Poiché questo metodo offre un nuovo strumento per il monitoraggio delle cellule progenitrici osteogeniche endogene nella rigenerazione e riparazione ossea.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la generazione della microfrattura con un danno tissutale minimo e l'imaging ripetuto in vivo della lesione della frattura senza indurre una grave formazione di cicatrici sono importanti per il metodo e tecnicamente impegnativi Per etichettare MX one positive le cellule in vivo iniziano iniettando 200 microlitri di acido poliacido policitoilico per 20 grammi di MX un Cree reporter peso del topo intraperitoneale una volta a giorni alterni per 10 giorni. Quindi, per eliminare le cellule ematopoietiche positive all'MX uno, irradiano i topi iniettati con una singola dose di 9,5 gras. Dopo 24 ore, trapiantare una volta 10 al sesto di cellule del midollo osseo di tipo selvatico per via endovenosa per topo.

Da quattro a sei settimane dopo, anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale con 50 microlitri di ketamina xilazina Dopo aver confermato la sedazione con il pizzico delle dita dei piedi, tagliare la coppia di cuoio capelluto del topo trapiantato di cellule del midollo osseo, quindi sterilizzare la pelle esposta con un tampone alcolico al 70%. Applicare il gel lacrimale per prevenire la disidratazione corneale, quindi praticare un'incisione trasversale lunga meno di un centimetro sul cuoio capelluto, partendo da un orecchio e terminando dall'altro. Quindi, gira l'animale di circa 60 gradi e continua l'incisione fino a raggiungere circa due o tre millimetri dal naso usando il forcipe.

Tirare il lembo di tessuto verso i lati dell'animale per separare la pelle, sia le ossa frontali che l'intersezione delle suture sagittale e coronale dovrebbero ora essere chiaramente esposte. Sciacquare la superficie aperta con PBS sterile e quindi rimuovere delicatamente i peli residui con tamponi di cotone. Quindi, per generare microfratture sul polver, tenere la testa del topo con una mano e un ago calibro 30 con l'altra.

Utilizzare la punta dell'ago calibro 30 per praticare delicatamente una micropuntura su un lato delle ossa frontali vicino all'intersezione delle suture sagittale e coronale. Per evitare di penetrare nel cervello, passare a un calibro più grande e ruotare il nuovo ago per allargare il foro di puntura a circa 0,5 millimetri di diametro. Dopo aver generato una seconda puntura sull'osso frontale controlaterale, far cadere continuamente PBS in ogni punto strofinando fino a quando l'emorragia non si ferma.

Quindi, per evitare l'essiccazione, applicare una goccia sufficiente di soluzione fisiologica sterile sul cranio per coprire completamente l'area per acquisire le immagini Vidal. Per prima cosa, accendi lo scanner laser basato su poligoni per consentire l'acquisizione simultanea di immagini multicanale a una velocità video di 30 fotogrammi al secondo. Quindi accendi il laser in zaffiro di titanio a femtosecondi per l'imaging multifotone.

Impostare la potenza e la lunghezza d'onda a 880 nanometri per l'imaging di seconda generazione armonica dell'osso calvario a 440 nanometri per l'eccitazione del pomodoro GFP e TD, accendere i laser a stato solido a 491 nanometri e 561 nanometri. E poi accendi i rivelatori del tubo moltiplicatore fotografico per ogni segnale: un filtro passa banda a 435 più o meno 20 nanometri per la generazione di seconda armonica, un filtro passa banda a 528 più o meno 19 nanometri per GFP e un 590 più o meno 20 nanometri passa-banda per il pomodoro TD. Ora, posiziona l'animale su un tavolino per microscopio motorizzato con asse XYZ sopra un termoforo elettrico impostato a 37 gradi Celsius.

Usa del nastro adesivo per tenere il mouse in posizione e poi applica una goccia di gel caldo a base di metilcellulosa al 2% sul cranio. Per evitare l'essiccazione, applicare un vetro di copertura sull'area di imaging. Quindi utilizzare un obiettivo a immersione in acqua 30 x con apertura numerica di 0,9 e il controller dell'asse XY, Z per rilevare il segnale SHG dalle ossa.

Per trovare la superficie del polver, identificare una posizione cruciale come l'intersezione tra le suture sagittali e le suture coronali e acquisire un'immagine. Segna le coordinate XY, Z del punto di riferimento e poi continua a cercare la posizione della lesione utilizzando l'SHG e i segnali fluorescenti come guide. Quando viene trovata ogni regione di interesse, acquisire un'immagine del miglior piano focale contenente l'SHG e i segnali fluorescenti dalle cellule di interesse.

Salva le coordinate XY, Z e la distanza dall'intersezione delle suture sagittale e coronale per definire la loro posizione precisa per il prossimo ciclo di imaging. Quindi raccogliere le strutture cellulari e ossee 3D della lesione da frattura. Registra le immagini a intervalli di impilamento Z da due a cinque micron con una profondità di circa 100 micron dalla superficie dell'osso endo.

Infine, dopo l'imaging di entrambi i siti di lesione, utilizzare più gocce di soluzione fisiologica sterile per rimuovere il gel di metilcellulosa al 2% dal cranio. Ora ricopri la superficie con antibiotici e copri il cranio con i lembi di pelle, richiudi il cuoio capelluto con un filo da sutura ipoallergenico e tieni l'animale in una camera di recupero calda fino a quando non riprende sufficiente coscienza. Dopo tre-cinque giorni, ripetere i passaggi di imaging intravitale per monitorare il cambiamento cellulare durante la guarigione della frattura.

In questo esperimento rappresentativo, sono state generate due microfratture sulle ossa frontali dell'osteocalcina genica MX one pomodoro, topi GFP dopo irradiazione e sostituzione sequenziale del midollo osseo L'imaging 3D intravitale delle micro fratture ha mostrato un trasferimento delle cellule staminali osteogeniche e progenitrici positive al pomodoro all'interno del sito della frattura al secondo giorno, così come la loro espansione al quinto giorno. Sebbene in questo momento non siano stati rilevati osteoblasti GFP positivi, il giorno 12, un sottogruppo di osteoprogenitori vicino alla superficie della frattura ha iniziato la differenziazione degli osteoblasti positivi al pomodoro GFP positivi come indicato dalla freccia, l'accumulo di nuovi osteoblasti e la nuova formazione ossea il giorno 21 indica che la migrazione e la proliferazione delle cellule progenitrici osteogeniche era un meccanismo importante per fornire nuovi osteoblasti per la guarigione della frattura. Per verificare se questo metodo fornisce un output coerente e quantitativo del numero di osteo progenitori durante la guarigione della frattura, le cellule staminali osteogeniche e progenitrici MX one YFP positive sono state monitorate per 14 giorni dopo la lesione.

Un piccolo numero di progenitori è stato costantemente rilevato nel sito della lesione entro tre giorni. Il numero di cellule è aumentato continuamente al settimo giorno, raggiungendo un picco di popolazione al giorno 10 che è stato sostenuto a 14 giorni. La cinetica della generazione degli osteo progenitori è stata quantificata misurando l'intensità del segnale YFP nel tempo e correlata con quella osservata dalla microscopia intravitale.

I progenitori sono stati osservati per la prima volta il terzo giorno, hanno raggiunto il picco entro il decimo giorno e sono rimasti a un'intensità altrettanto alta fino al 14° giorno. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che tecniche di sutura abili e sanguinamento minimo possono ridurre la formazione di cicatrici e abbassare l'autofluorescenza di fondo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare e monitorare la migrazione, la proliferazione e la differenziazione delle cellule progenitrici staminali osteogeniche endogene nel processo di riparazione della frattura.