Eccitotossica stimolazione del cervello Microslices come In vitro Modello di Corsa

L'obiettivo generale di questa procedura è applicare la stimolazione citotossica a micro fette cerebrali per creare un modello di ictus in vitro. Ciò si ottiene preparando prima micro fette da un cervello appena isolato. Il secondo passo consiste nell'equilibrare le micro fette con una leggera agitazione.

Una volta equilibrate, le micro fette sono pronte per ricevere una varietà di manipolazioni sperimentali. In definitiva, i risultati mostrano che le micro fette sono vitali per almeno due ore dopo la generazione. Il vantaggio principale della nostra tecnica rispetto ad altre tecniche esistenti, come le colture embrionali primarie e neuronali, è che la nostra tecnica utilizza fette di tessuto cerebrale maturo, che contengono più di un tipo di cellula e sono quindi più rappresentative del tessuto cerebrale intatto.

Il primo passo è ottenere tessuto cerebrale fresco. Immergi il cervello in una piccola quantità di tampone Krebs caldo. Per rimuovere eventuali residui di pelle, pelo o sangue, preparare il tritatutto macle wain con due fogli di carta da filtro inumiditi con tampone Krebs caldo.

Quando è pronto, posiziona il cervello sul palco dell'elicottero. Mantieni il cervello e la carta da filtro umidi con un tampone caldo mentre lavori per evitare che il cervello scivoli. Evitare che si accumuli troppo liquido sulla superficie.

Taglia il cervello in sezioni coronali di 250 micrometri. Quindi, ruotare il tavolino di 90 gradi e creare fette sagittali da 250 micrometri. Dopo questo passaggio, le sezioni cerebrali vengono definite micro fette.

Mettere le micro fette in due parti rotonde sul fondo con 10-15 millilitri di tampone caldo. Agitare delicatamente il tubo fino a quando le singole micro fette non sono sospese, quindi lasciarle depositare per gravità. Rimuovere con cautela il surnatante, che sarà torbido a causa dei detriti cellulari sospesi, e aggiungere 10 millilitri di tampone fresco e caldo alla provetta.

Ripetere la procedura di lavaggio quattro volte per rimuovere la maggior parte dei detriti una volta lavati accuratamente. Equilibrare le micro fette a 37 gradi Celsius agitando delicatamente o invertendo e cambiare il tampone Krebs ogni 15 minuti per un'ora in totale. Trascorso questo tempo, aggiungere due millilitri di tampone Krebs fresco a 37 gradi Celsius e trasferire da 15 a 20 micro fette in un tubo di polistirene da cinque millilitri a fondo piatto.

Utilizzando una punta per pipetta a foro extra largo con bordi lisci, distribuire le micro fette in modo uniforme sulla base della provetta in un unico strato in modo che ogni micro fetta non sia più lontana di pochi millimetri dall'atmosfera ossigenata. Una volta sistemate correttamente, incubare le micro fette in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per fornire una corretta ossigenazione alle micro fette. Passare continuamente il carbogeno sulla sospensione a microfette con la linea del gas posizionata appena sopra la superficie per evitare l'interruzione meccanica delle microfette a contatto diretto con il gas Per ottenere i migliori risultati.

È fondamentale che le microfette siano aerate correttamente. È importante che la linea del gas sia posizionata alla giusta distanza dalla superficie della sospensione del microsito. Diverse linee possono essere fuse insieme per consentire il verificarsi di più stimolazioni.

Allo stesso tempo, è possibile utilizzare una varietà di stimoli. In questo esempio, le micro fette subiscono la stimolazione AMPA. Trattare le micro fette con uno stimolo citotossico o con il solo tampone di Krebs.

Per un controllo sul gruppo stimolato. Rimuovere la soluzione di incubazione in vari momenti dopo la stimolazione e sostituirla con 300 microlitri di tampone di omogeneizzazione ghiacciato al momento desiderato. Dopo la stimolazione, omogeneizzare le micro fette sul ghiaccio utilizzando un omogeneizzatore in teflon di vetro, conservare l'omogeneità a meno 80 gradi Celsius fino al momento di ulteriori analisi.

I tassi di respirazione mostrano che le micro fette raccolte dal proencefalo del pollo sono vitali fino a due ore dopo la generazione. Anche gli alti livelli di A TP e bassi A DP riscontrati nelle micro fette sono caratteristici delle cellule vitali. In questo esempio, il contenuto di potassio tissutale è stato misurato e si è scoperto che era appena sopra il fondo dopo la dissezione, ma che è aumentato dopo l'incubazione con il tampone Krebs, l'aggiunta di WABE ed EGTA ha causato il declino del contenuto di potassio nei tessuti, dimostrando che le micro fette normalmente pompano attivamente potassio e che i livelli non sono dovuti al potassio intrappolato nel tessuto morto o negli spazi interstiziali.

Qui sono state generate micro fette dallo striato e dalla corteccia sensoriale di ratti maschi e depolarizzate utilizzando un tampone crebs ad alto contenuto di potassio. Il tasso di fosforilazione della colla N e due B variava tra la corteccia e lo striato, mentre il tasso di fosforilazione della colla a uno era simile tra le due aree. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa due ore se eseguita correttamente.