Name: Saggio del proteasoma degradazione in un sistema di libero-Cell nelle piante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T17:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Scopri un saggio cell-free per analizzare la degradazione proteica nel pathway ubiquitina-proteasoma nelle piante. Questo metodo permette di studiare la stabilità delle proteine in condizioni controllate.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Il lavoro portato a questa pubblicazione ha ricevuto finanziamenti dal programma Marie Curie COFUND &quot;U-Mobility&quot;, cofinanziato dall&#39;Università di Malaga e il programma dell&#39;Unione europea 7 ° programma quadro (FP7/2007-2013) sotto GA No. 246550. Il lavoro nel nostro laboratorio è sostenuto da sovvenzioni dal NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD, e BSF a VC

1. Espressione della proteina <ol><li> Scelta del sistema di espressione Selezionare il sistema, cioè, vettori e vettore metodo di consegna, più adatto per l&#39;espressione della proteina di interesse nella organismo modello / cella specifica. Si noti che il nostro test richiede l&#39;espressione delle proteine ​​testate in quantità facilmente rintracciabile, che è meglio ottenere con la trasformazione temporanea di un gran numero di cellule. Nelle piante, per esempio, questo è migliore, utilizzare plasmidi binari come vettori di espressione e Agrobacterium come sistema di consegna. </li><li> Costruzione di vettori di espressione binari Clonare la sequenza codificante (s) della proteina (s) di interesse in un vettore di espressione da soli o in fusione traslazionale di un epitopo. Uso vettori adatti per il sistema di espressione scelto e procedure di biologia molecolare standard per la clonazione del gene. Per la consegna del gene mediata da Agrobacterium, impiegare vettori binari e far loro conoscere, utilizzando anche Standaprotocolli rd, in un ceppo Agrobacterium, come EHA105, per la successiva inoculazione di tessuti vegetali. </li><li> La scelta delle specie vegetali Selezionare le specie vegetali in cui verrà espressa la proteina (s) di interesse. Si noti che, mentre è possibile usare qualsiasi specie di piante sensibili alla trasformazione genetica mediata da Agrobacterium, la nostra specie vegetali di scelta è Nicotiana benthamiana, che è facilmente coltivata, altamente suscettibile Agrobacterium, e ha foglie grandi che sono facilmente inoculati. </li><li> La crescita delle piante Crescere un impianto da 4 a 6 settimane in una pentola con Pro-Mix BX in una pentola (20 centimetri x 20 centimetri x 20 cm) in condizioni eco-controllati (es. camera di crescita) di giorno lungo (cioè 16 h 130 -150 μE m-2 s-1 luce a 23 ° C e 8 h al buio a 20 ° C) e 40-65% di umidità relativa. 1.5.2 Concimazione tanto in tanto con i prodotti disponibili in commercio per le istruzioni del produttore. Una volta che la pianta viene coltivata, selezionarefoglie con le dimensioni di 50 mm x 70 mm o più grandi (queste misure di lunghezza non includono il picciolo) per Agrobacterium inoculazione. </li><li> Inoculazione con Agrobacterium Crescere ceppo Agrobacterium ospitare il costrutto binario esprimente la proteina (s) testato dal punto 1.3 notte a 28 ° C in mezzo YEP (1% peptone, estratto di lievito 1%, e 0,5% NaCl) supplementato con antibiotici appropriati (per esempio, 100 mg / L streptomicina e 10 mg / L rifampicina per vettori basati pPZP-RSC2 24-25). 1.6.2 Centrifugare le cellule, risospese a OD 600 = 0.5 in tampone infiltrazione [10 mM MgCl 2, 10 Mes mM (pH 5,6), 100 mM acetosyringone], e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Infiltrarsi nella cultura nel lato abaxial di una foglia, utilizzando una siringa senz&#39;ago 1-mL; notare che le foglie vengono inoculati in situ, mentre è attaccato alla pianta. 1.6.3 Dopo l&#39;infiltrazione, coltivare la pianta per 72 ore sotto il regime luce di 16 h 130-150 &amp;# 181, E m-2 s-1 luce a 23 ° C / 8 h al buio a 20 ° C prima della raccolta. </li><li> Applicazione di inibitori del proteasoma Per sostenere l&#39;idea che la proteina (s) testato è degradato attraverso una via del proteasoma, utilizzare specifici inibitori del proteasoma MG132 e lactacistina 28-29, che dovrebbe ridurre o addirittura bloccare il degrado. Quattro ore prima della raccolta (cfr. punto 2.1), infiltrarsi nelle zone foglia Agrobacterium-inoculati con 10 pM MG132 (EMD Millipore) o 10 micron lactacistina (Sigma-Aldrich) o mock-trattare la foglia con le rispettive solventi, cioè lo 0,1% DMSO o acqua distillata. </li></ol> 2. Preparazione di estratti cell-free <ol><li> Leaf raccolta Raccogliere le zone inoculati della foglia, di solito ca. 200-400 mg di peso fresco, e li macinare in polvere fine in azoto liquido. In alternativa, bead-battere i tessuti, utilizzando qualsiasi bead-beater (ad esempio, Biospec) o amalgamator dentale (ad esempio, TPC avanzata<html> Technologies) direttamente nel buffer di degradazione (cfr. punto 2.2). </li><li> Estrazione delle proteine Preparare l&#39;estratto proteico totale posizionando il tessuto macinato in 500 ml di tampone degradazione [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 100 mM, 10 mM MgCl 2, 5 mM DTT, adenosina 5 mM 5&#39;-trifosfato, e inibitore della proteasi 1x cocktail (Sigma-Aldrich)]. Si noti che il cocktail di inibitori delle proteasi colpisce principalmente serina, cisteina, aspartico, e metalloproteasi e non interferisce con la proteasi 26S. Chiarire l&#39;estratto da due centrifugazioni sequenziali a 12.000 xg per 5 min. </li><li> Reazione di degradazione delle proteine Trasferire volumi uguali di estratti, di solito 20 microlitri, per microcentrifuga tubi e incubare a temperatura ambiente per periodi di tempo crescente. Tipicamente, il tempo di campionamento pari a zero, e 5, 10, 15, 20, e 30 min punti temporali. Smettere di reazioni facendo bollire in SDS tampone di gel-sample, e analizzarli mediante western blotting. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. Rilevamento degradazione della proteina mediante immunoblotting <ol><li> Elettroforesi su gel 3.1.1 risolvere i campioni di proteine ​​mediante elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide e electrotransfer le proteine ​​deliberato di una membrana di nitrocellulosa secondo il protocollo standard 30. 3.1.2 Determinare concentrazione proteica utilizzando il metodo di Bradford (Bio-Rad), e caricare 50-80 mg di proteine ​​totali per corsia. Assicurarsi che tutti i campioni sono stati caricati allo stesso modo. Per i controlli di carico, confrontare le intensità di una specie di proteine ​​ubiquitarie, come putativo Rubisco grandi catene che migrano come una band importante con una mobilità elettroforetica relativa di circa 50 kDa, possono essere rilevati Coomassie gel-blu macchiato o Ponceau S-o fluorescente SYPRO Ruby-tinto membrane di nitrocellulosa. </li><li> Blocco Bloccare la membrana con 5% di latte scremato in TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) per 1 ora a temperatura ambiente. </li&gt; <li> Anticorpo primario Diluire anticorpo anti-epitopo primario in 1% di latte scremato in TBST alla concentrazione raccomandato dal produttore e incubare con la membrana bloccata per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C con agitazione. </li><li> Risciacquo Sciacquare la membrana viene sciacquato con 20 ml TBST per 15 minuti una volta e due volte per 5 minuti a temperatura ambiente con agitazione. </li><li> Anticorpo secondario Diluire anticorpo secondario (ad esempio IgG anti-coniglio) coniugato con perossidasi di rafano (HRP) in 1% di latte scremato in TBST come raccomandato dal fabbricante e incubare con la membrana per 1 ora a temperatura ambiente con agitazione. </li><li> Rivelazione Sciacquare nuovamente la membrana come descritto al punto 3.4. Dopo il risciacquo finale in TBST, visualizzare le proteine ​​di interesse, con un substrato chemiluminescente HRP, più comunemente utilizzando un kit ECL. </li></ol>

<ol><li>Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+control+in+ubiquitin-dependent+proteolysis%3A+don%E2%80%99t+Skp+the+F-box+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis.</a> Trends Genet. 14, 236-243 (1998).</li>
<li>Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+and+cullin%2Fring+H2-based+ubiquitin+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases.</a> Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).</li>
<li>Callis, J., Vierstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+in+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein degradation in signaling.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).</li>
<li>Hellmann, H., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+development%3A+regulation+by+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant development: regulation by protein degradation.</a> Science. 297, 793-797 (2002).</li>
<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).</li>
<li>Dharmasiri, S., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+regulated+protein+degradation+in+auxin+response%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of regulated protein degradation in auxin response.</a> Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).</li>
<li>Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ubiquitination+in+the+regulation+of+plant+defence+against+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).</li>
<li>Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+ubiquitin-26S-proteasome+pathway+in+gibberellin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling.</a> Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).</li>
<li>Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+26S+proteasome+system+in+the+signaling+pathways+of+TGF-beta+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily.</a> Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).</li>
<li>Pagano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+DNA+synthesis+and+mitosis+by+the+Skp2-+p27-Cdk1%2F2+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis.</a> Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).</li>
<li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+of+the+host+SCF+ubiquitin+ligase+machinery+by+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens.</a> Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).</li>
<li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+plant+transformation%3A+the+biology+behind+the+%26%2334%3Bgene-jockeying%26%2334%3B+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &#34;gene-jockeying&#34; tool.</a> Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li>
<li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).</li>
<li>Schrammeijer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+the+virulence+protein+VirF+of+Agrobacterium+tumefaciens+with+plant+homologs+of+the+yeast+Skp1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein.</a> Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).</li>
<li>Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+induces+expression+of+a+plant+host+F-box+protein+required+for+tumorigenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity.</a> Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).</li>
<li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+targeted+proteolysis+in+plant+genetic+transformation+by+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium.</a> Nature. 431, 87-92 (2004).</li>
<li>Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+synthetic+Agrobacterium+T-DNA-protein+complexes+via+the+host+SCFVBF+ubiquitin-ligase+complex+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).</li>
<li>Zhou, P., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+and+degradation+of+the+substrate+recognition+subunits+of+SCF+ubiquitin-protein+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases.</a> Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).</li>
<li>Galan, J. M., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-dependent+degradation+of+multiple+F-box+proteins+by+an+autocatalytic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).</li>
<li>Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tome-1%2C+a+trigger+of+mitotic+entry%2C+is+degraded+during+G1+via+the+APC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC.</a> Cell. 113, 101-113 (2003).</li>
<li>Guardavaccaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+meiotic+and+mitotic+progression+by+the+F+box+protein+b-Trcp1+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo.</a> Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).</li>
<li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+counteracts+host-induced+degradation+of+its+F-box+protein+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector.</a> Sci. Signal. 4, (2011).</li>
<li>Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophase+destruction+of+Emi1+by+the+SCFbTrCP%2FSlimb+ubiquitin+ligase+activates+the+anaphase+promoting+complex+to+allow+progression+beyond+prometaphase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase.</a> Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).</li>
<li>Tzfira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pSAT+vectors%3A+a+modular+series+of+plasmids+for+fluorescent+protein+tagging+and+expression+of+multiple+genes+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants.</a> Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).</li>
<li>Goderis, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+modular+plant+transformation+vectors+allowing+flexible+insertion+of+up+to+six+expression+units%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units.</a> Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).</li>
<li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-DNA+binary+vectors+and+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).</li>
<li>Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Delivery of multiple transgenes to plant cells.</a> Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).</li>
<li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+Arabidopsis+26+S+proteasome%3A+biochemical+and+molecular+analyses+revealed+the+presence+of+multiple+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms.</a> J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).</li>
<li>Fenteany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+proteasome+activities+and+subunit-specific+amino-terminal+threonine+modification+by+lactacystin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin.</a> Science. 268, 726-731 (1995).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. Ausobel, F. M., et al. , Wiley-Interscience. New York. (1987).</li>
<li>Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from:
 
 <a target="_blank" href="imagej.nih.gov/ij">imagej.nih.gov/ij</a> (1997).</li>
<li>Kim, J. H., Kim, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+RING+E3+ubiquitin+ligase+AtAIRP3%2FLOG2+participates+in+positive+regulation+of+high+salt+and+drought+stress+responses%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses).</a> Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo test si basa sulla espressione delle proteine ​​testati in tessuti vegetali, quindi, il potenziale processo di degradazione proteasoma avviene ovviamente già all&#39;interno dei tessuti viventi. Abbiamo protein assay destabilizzazione, tuttavia, solo negli estratti, con il tempo di campionamento di zero che serve come punto di riferimento iniziale. Quindi, definiamo come un saggio privo di cellule. Un aspetto importante per il successo di questo test è la corretta scelta del vettore d...

Il proteasoma percorso ubiquitin/26S sta emergendo come un meccanismo diffuso per il controllo di diverse reazioni biologiche, tra cui regolazione trascrizionale, la progressione del ciclo cellulare e trasduzione del segnale, recettori down-regulation o endocitosi, tra gli altri processi 1-4. In questo percorso, la proteina bersaglio viene etichettato da ubiquitina residui che vengono prima collegati tramite un legame thiolester to-ubiquitina attivando l&#39;enzima E1 e poi traslocato a un residuo di acido cisteina amino ubiquitina-coniugazione enzima E2, infine, E2 interagisce con ubiquitina ligasi E3 , con conseguente polyubiquitination del substrato proteico. In definitiva, le proteine ​​polyubiquitinated sono riconosciuti e degradati dal proteasoma 26S. In questo meccanismo, l&#39;enzima E3 specifica il substrato e funge da elemento regolatore chiave del sistema proteasoma ubiquitin/26S (UPS). Ligasi E3 possono agire in modo indipendente, come ligases dominio RING, o come parte di un SCF multisubunit (S) complesso proteico kp1/Cullin/F-box, come ad esempio F-box ligases dominio. SCF-mediate vie di degradazione del proteasoma sono coinvolti nella regolazione della trascrizione, ciclo cellulare, la trasduzione del segnale 5-10 e molte altre importanti funzioni cellulari. Oltre a questi ruoli critici nella regolazione dei processi cellulari, UPS prende il palco centrale in molte interazioni pianta-patogeno. Ad esempio, una crescente evidenza suggerisce che diversi agenti patogeni delle piante, tra cui Agrobacterium tumefaciens, si basano su l&#39;UPS host per per facilitare il processo di infezione 11. Agrobacterium provoca escrescenze neoplastiche sulle piante, che rappresentano i suoi ospiti naturali, e può anche trasformare una vasta gamma di altri eucarioti, da funghi 1,2 a cellule umane 12,13. Durante la sua infezione, Agrobacterium esporta un elemento DNA (T-DNA) e vari virulenza (vir) proteine ​​nella cellula ospite 12-13. Una di queste proteine ​​è VirF, la prima proteina F-box trovatiessere codificati da un genoma procariotico 14. Come parte del complesso SCF ubiquitina ligasi, VirF, e il suo omologo ospitante funzionale VBF 15, facilitare infezione Agrobacterium tramite la degradazione delle proteine ​​UPS-mediata, che facilita presumibilmente uncoating del invadere batterica T-DNA dalle proteine ​​batteriche e ospitanti accompagnamento, VirE2 e VIP1 rispettivamente 16,17. È interessante notare che molte proteine ​​F-box, tra cui VirF, sono intrinsecamente instabili a causa della loro proteolisi, che è mediata da attività autoubiquitination 18,19 o da altri ligasi E3 per i quali le proteine ​​F-box possono fungere da substrati 20-23. Quando si studia attività biochimiche delle proteine ​​F-box, altri ligasi ubiquitina, e / o le loro substrati, sarebbe molto utile un test semplice e affidabile per la degradazione del proteasoma. Qui si descrive un tale protocollo per analizzare la stabilità della proteina in una cellula-Libero Sistema. In questo saggio, la stabilità del substrato UPS viene analizzato in presenza o assenza di uno dei componenti essenziali del percorso di degradazione proteasoma, come una proteina F-box, in un sistema acellulare. In generale, esprimiamo la proteina (s) testato in tessuti vegetali, preparare estratti privi di cellule di questi tessuti e monitorare la quantità di proteina (s) di interesse mediante western blotting. Il meccanismo UPS-dipendente di degradazione proteica è dimostrata dalla inclusione di inibitori del proteasoma specifici e / o tramite coespressione di forma dominante negativa di un componente SCF, Cullin. Considerando che illustriamo questo dosaggio utilizzando proteasoma degradazione della proteina Arabidopsis VIP1 17 dalla proteina F-box VBF 15, può essere impiegato per studiare la stabilità di eventuali altri substrati del proteasoma.

<table><tbody><tr><td>Kit di dosaggio delle proteine</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0001</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteinasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Mini-Proteiforme</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di elettrotrasferimento SD con western blotting</td><td>semi-secco Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Affinità Coniglio purificato Anti-Ha</td><td>ICL Lab</td><td>RHGT-45A-Z</td><td></td></tr><tr><td>Capra IgG Perossidasi coniugato</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>BioTrace, NT membrana di trasferimento di nitrocellulosa</td><td>Pall Corporation</td><td>27377-000</td><td></td></tr><tr><td>Substrato HRP chemiluminescente occidentale Immobilon</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>EMD Millipore</td><td>474790-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Lattacistina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Kit di macchie occidentali rapide Thermo Scientific Pierce, Pierce</td><td></td><td>35055</td> <td>del substrato ECL</td></tr></tbody></table>

saggio del proteasoma degradazione in un sistema di libero-cell nelle piante

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Il pathway ubiquitina-proteasoma per la degradazione delle proteine ​​è emerso come uno dei meccanismi più importanti per la regolazione di un ampio spettro di funzioni cellulari in quasi tutti gli organismi eucarioti. In particolare, nelle piante, il sistema proteasoma ubiquitin/26S (UPS) regola la degradazione delle proteine ​​e contribuisce significativamente allo sviluppo di una vasta gamma di processi, compresa la risposta immunitaria, lo sviluppo e la morte cellulare programmata. Inoltre, sempre più evidenze suggeriscono che numerosi agenti patogeni delle piante, quali Agrobacterium, sfruttano l&#39;UPS di accoglienza per l&#39;infezione efficiente, sottolineando l&#39;importanza della continuità nelle interazioni pianta-patogeno. La specificità di substrato della UPS è raggiunto dalla ubiquitina ligasi E3 che agisce di concerto con la E1 e E2 ligasi di riconoscere e marcare molecole proteiche specifici destinati a degradazione da dandole catene di molecole di ubiquitina. Una classe delle ligasi E3 è la SCF (Skp1 / Cproteina Ullin / F-box) complessa, che riconosce specificamente i substrati UPS e obiettivi per l&#39;ubiquitinazione attraverso la sua componente proteica F-box. Per studiare il ruolo potenziale di UPS in un processo biologico di interesse, è importante mettere a punto un saggio semplice e affidabile per degradazione proteica UPS-mediata. Qui, descriviamo un tale saggio usando un sistema acellulare pianta. Questo test può essere adattato per lo studio dei ruoli di degradazione delle proteine ​​regolamentato in diversi processi cellulari, con un focus particolare sulle interazioni proteina-substrato F-box.

Figura 1, adattato da Zaltsman et al. 17, illustra esperimenti rappresentativi per il rilevamento di degradazione del proteasoma in un sistema acellulare. In particolare, dimostriamo destabilizzazione di un impianto destinato alla difesa proteina VIP1 dalla proteina F-box VBF attraverso la via SCF VBF in N. benthamiana. Arabidopsis VBF e VIP1 (HA-VIP1) proteine ​​HA-tagged stati transitoriamente coespressi, e HA-VIP1 proteina contenuto all&#39;in...

Degradazione delle proteine ​​mirata rappresenta un importante meccanismo di regolazione per la funzione delle cellule. Essa si verifica attraverso una via ubiquitina-proteasoma conservati, che attribuisce catene polyubiquitin alla proteina bersaglio che poi servire &quot;tag&quot; molecolari per il proteasoma 26S. Qui, descriviamo un saggio semplice e affidabile senza cellula per proteasoma degradazione delle proteine.

Saggio del proteasoma degradazione in un sistema di libero-Cell nelle piante

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare la stabilità proteica in un sistema privo di cellule. Questo viene ottenuto inoculando Oceana Biana con diverse ceppi di agrobatterio, contenenti il costrutto binario che codifica per la proteina di interesse.Le proteine totali vengono quindi estratte dalle foglie della pianta. Le foglie vengono trasferite in provette microcentrifuga e incubate a temperatura ambiente per periodi di tempo crescenti. Successivamente, i campioni proteici vengono separati mediante elettroforesi su gel di acrilamide SDS e trasferiti elettroforeticamente su una membrana di nitrocellulosa.Al fine di rilevare la proteina di interesse mediante un anticorpo specifico, si ottengono risultati che mostrano la stabilità proteica in presenza o in assenza di un inibitore specifico del proteasoma, basati sull'analisi mediante western blotting. Descriviamo qui una metodologia semplice per studiare la stabilità del substrato proteico cistico del protosoma INE in presenza o in assenza di uno dei componenti essenziali del percorso di degradazione proteasomiale in un sistema privo di cellule. Pertanto, questi metodi possono fornire informazioni su una degradazione proteasomiale più sicura.È inoltre applicabile ad altri sistemi, come negli studi sui ruoli della degradazione regolata delle proteine in diversi processi cellulari. In questa dimostrazione, viene utilizzato NCOA hamana. La pianta è di facile coltivazione, altamente suscettibile all'agrobatterio e possiede foglie grandi che possono essere facilmente inoculate.Coltivare una pianta per quattro-sei settimane in un vaso con terriccio Promix B in condizioni ambientali controllate di fotoperiodo lungo e umidità relativa del 40-65%. Fertilizzare la pianta occasionalmente con prodotti disponibili in commercio seguendo le istruzioni del produttore. Una volta sviluppata la pianta, selezionare foglie di dimensioni pari o superiori a 50 millimetri per 70 millimetri.Per l'inoculazione con agrobatterio, coltivare la ceppa di Agrobacterium contenente il costrutto binario che esprime la proteina in esame, in mezzo YEP arricchito con gli antibiotici appropriati, a 28 gradi Celsius per tutta la notte. Dopo la centrifugazione delle cellule, sospendere il pellet in tampone di infiltrazione fino a raggiungere una densità ottica a 600 nanometri di 0,5 e incubare per due ore a temperatura ambiente. Infiltrare la coltura nel lato AAL di una foglia utilizzando una siringa da un millilitro senza ago. Dopo l'infiltrazione, coltivare la pianta per 72 ore nelle stesse condizioni di luce. Prima del campionamento, quattro ore prima della raccolta, infiltrare le aree fogliari inoculate con agrobatterio con un inibitore a 10 micromolare o con un trattamento di controllo (mock).Trattare la foglia con i rispettivi solventi, raccogliere le aree inoculate della foglia, solitamente da 200 a 400 milligrammi di peso fresco, e macinarle in una polvere fine in azoto liquido. Successivamente, preparare l'estratto proteico totale ponendo il tessuto macinato in 500 microlitri di buffer di degradazione. Clarificare l'estratto mediante due centrifugazioni consecutive a 12.000 ×g per cinque minuti per eseguire la reazione di degradazione delle proteine.Trasferire volumi uguali di estratti, solitamente 20 microlitri, in provette da microcentrifuga e incubarli a temperatura ambiente per periodi di tempo crescenti. Tipicamente, si utilizzano i punti temporali zero, 5, 10, 15, 20 e 30 minuti. Arrestare le reazioni mediante bollitura in un buffer campione per gel SDS prima di analizzarle tramite western blotting.Separare i campioni proteici mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di SDS, determinando prima la concentrazione proteica utilizzando il metodo di Bradford e caricando da 50 a 80 microgrammi di proteina totale per corsia. Assicurarsi che tutti i campioni siano caricati in quantità uguale per i controlli di caricamento. Confrontare le intensità di specie proteiche ubiquitarie, come le catene pesanti putative della rubisco, che migrano come una banda principale con una mobilità elettroforetica relativa di circa 50 chilodalton.Dopo il trasferimento elettroforetico delle proteine risolte su una membrana di nitrocellulosa secondo protocolli standard, bloccare la membrana con il 5% di latte scremato in TBST per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, diluire l'anticorpo primario anti-epitopo nel 1% di latte scremato in TBST alla concentrazione raccomandata dal produttore. Incubare l'anticorpo con la membrana bloccata per un'ora a temperatura ambiente oppure per tutta la notte a quattro gradi Celsius con agitazione delicata.Quindi risciacquare la membrana in 20 millilitri di TBST per 15 minuti una volta, seguito da due volte per cinque minuti a temperatura ambiente con agitazione delicata. Successivamente, diluire l'anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano in 1% di latte scremato in TBST, come raccomandato dal produttore. Incubare l'anticorpo secondario con la membrana per un'ora a temperatura ambiente con agitazione delicata dopo un ulteriore risciacquo in TBST, quindi visualizzare le proteine di interesse mediante perossidasi di rafano. Esperimenti rappresentativi che mostrano la destabilizzazione di una proteina legata alla difesa vegetale.La degradazione della proteina Veep uno mediata dal complesso VBFF tramite la via SCF è stata dimostrata in N hamana. L'analisi tramite blotting western ha dimostrato che i livelli di Veep uno erano ridotti in modo significativo quando co-espressi con VBF, ma rimanevano relativamente stabili in assenza di co-espressione di VBF. Il meccanismo di degradazione proteasomiale responsabile dell'instabilizzazione di Veep uno indotta da VBF è stato dedotto dall'inibizione ottenuta con l'inibitore del proteasoma MG 132.La quantificazione di questi risultati ha dimostrato un'inibizione quasi completa della V one da parte del VBF, inibizione che è stata praticamente bloccata dal MG 132. I livelli leggermente più elevati di V one in presenza di MG 132 sono molto probabilmente spiegati dall'inibizione dell'attività dell'omologo endogeno di VBF. Dopo aver visionato questo video, dovreste avere una chiara comprensione di come studiare il degrado proteico attraverso la via iniziale del proteasoma.Lo stesso disegno sperimentale potrebbe essere utilizzato per qualsiasi altro organismo ed eseguito per rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio i ruoli del degrado regolato delle proteine in diversi processi cellulari.

assaying-proteasomal-degradation-in-a-cell-free-system-in-plants

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Un metodo per monitorare l'attività ubiquitina-proteasoma in cellule viventi è descritto. Un degron-destabilizzato GFP-(GFP-dgn) e di una stalla GFP-dgnFS proteina di fusione vengono generati e trasdotto nella cella utilizzando un vettore lentivirale espressione. Questa tecnica permette di generare una linea cellulare stabile GFP-dgn/GFP-dgnFS esprimendo in cui ubiquitina-proteasoma attività può essere facilmente valutata usando epifluorescenza o citometria a flusso.

Monitoraggio del sistema ubiquitina-proteasoma attività nelle cellule viventi Utilizzando una degron (dgn)-destabilizzato proteina verde fluorescente (GFP) a base di proteine ​​Reporter

In questo video, dimostriamo un saggio di aggregazione proteica basato su cellule utilizzando inibitori del proteasoma, che bloccano l'attività del proteasoma, impedendo alle proteine mutanti mal ripiegate, fuse in un'etichetta fluorescente, di subire la degradazione del proteasoma ubiquitina-dipendente, portando al loro accumulo all'interno del citoplasma cellulare. Gli aggregati proteici vengono quindi visualizzati e quantificati mediante microscopia a fluorescenza.

Saggio di formazione di aggregati proteici: un metodo per rilevare e quantificare l'aggregazione proteica in cellule coltivate dopo induzione da parte dell'inibitore del proteasoma

Questo video descrive un test di degradazione per proteine mal ripiegate utilizzando il trattamento con cicloesimide insieme al frazionamento del detergente. Questo metodo aiuta a studiare la dinamica delle proteine mal ripiegate e a scoprire i meccanismi approfonditi del turnover proteico.

Saggio di degradazione delle proteine incline al ripiegamento errato: una tecnica per monitorare la degradazione delle proteine mal ripiegate utilizzando il trattamento con cicloesimide e il frazionamento dei detergenti

Descriviamo qui un protocollo per la purificazione e caratterizzazione di complessi proteici vegetali. Dimostriamo che immunoprecipitando una singola proteina all'interno di un complesso, in modo da poter identificare le sue modificazioni post-traslazionali e dei suoi partner interagenti.

Identificazione delle modificazioni post-traduzionali di proteine ​​vegetali Complessi

Qui descriviamo un robusto test biologico per quantificare il tasso relativo di proteolisi da parte del sistema ubiquitina-proteasoma. La lettura del saggio è il tasso di crescita del lievito in coltura liquida, che dipende dai livelli cellulari di una proteina reporter che comprende un segnale di degradazione fuso con un marcatore metabolico essenziale.

Saggio di crescita a base Reporter, per l&#39;analisi sistematica di proteine ​​degradazione

Questo articolo descrive un saggio basato sulla crescita del lievito per la determinazione dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine. Dimostra anche un metodo per l'estrazione rapida delle proteine del lievito, adatto al western blotting per confermare biochimicamente i requisiti di degradazione. Queste tecniche possono essere adattate per monitorare la degradazione di una varietà di proteine.

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Questo rapporto descrive i protocolli per misurare i tassi di degradazione delle proteine mal ripiegate mediante western blot o saggi basati sulla fluorescenza. I metodi possono essere applicati all'analisi di altre proteine mal ripiegate e per lo screening ad alto rendimento.

Saggi per la degradazione delle proteine ​​nelle cellule mal ripiegate

Qui presentiamo un protocollo di cattura di interazione applicato ai protoplasti a foglia di Arabidopsis thaliana . Questo metodo si basa fondamentalmente sulla creazione di reticolazione UV in vivo e consente l'isolamento e l'identificazione delle proteine ​​legate alla mRNA da un ambiente fisiologico.

Cattura di Interactome mRNA da protoplasti vegetali

Interazioni proteina-proteina e proteina-metabolita sono cruciali per tutte le funzioni cellulari. Qui, descriviamo un protocollo che permette l'analisi parallela di queste interazioni con una proteina di scelta. Il nostro protocollo è stato ottimizzato per colture di cellule vegetali e combina purificazione di affinità con proteina basati sulla spettrometria di massa e rilevamento di metabolita.

2 in 1: purificazione di affinità per l'analisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio

Qui è presentato un approccio fosfoproteomico, vale a dire fosfoproteomico a base di punta di estrazione stop and go, che fornisce un'elevata produttività e una copertura profonda del fosfoproteoma arabidopsis. Questo approccio delinea la panoramica della segnalazione dello stress osmotico in Arabidopsis.

Strategia fosfoproteomica per la profilazione del segnale di stress osmotico in Arabidopsis

Questo protocollo descrive il flusso di lavoro per l'etichettatura metabolica di cellule senescenti e non in divisione con SILAC pulsato, analisi di spettrometria di massa non mirata e un calcolo semplificato delle emivite proteiche.

Misurazione dei tassi di turnover proteico in cellule coltivate senescenti e non in divisione con etichettatura metabolica e spettrometria di massa

Scopri un saggio cell-free per analizzare la degradazione proteica nel pathway ubiquitina-proteasoma nelle piante. Questo metodo permette di studiare la stabilità delle proteine in condizioni controllate.

Saggio del proteasoma degradazione in un sistema di libero-Cell nelle piante

Esplora altri video