Name: Saggio del proteasoma degradazione in un sistema di libero-Cell nelle piante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T17:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Scopri un saggio cell-free per analizzare la degradazione proteica nel pathway ubiquitina-proteasoma nelle piante. Questo metodo permette di studiare la stabilità delle proteine in condizioni controllate.

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Il lavoro portato a questa pubblicazione ha ricevuto finanziamenti dal programma Marie Curie COFUND &quot;U-Mobility&quot;, cofinanziato dall&#39;Università di Malaga e il programma dell&#39;Unione europea 7 ° programma quadro (FP7/2007-2013) sotto GA No. 246550. Il lavoro nel nostro laboratorio è sostenuto da sovvenzioni dal NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD, e BSF a VC

1. Espressione della proteina <ol><li> Scelta del sistema di espressione Selezionare il sistema, cioè, vettori e vettore metodo di consegna, più adatto per l&#39;espressione della proteina di interesse nella organismo modello / cella specifica. Si noti che il nostro test richiede l&#39;espressione delle proteine ​​testate in quantità facilmente rintracciabile, che è meglio ottenere con la trasformazione temporanea di un gran numero di cellule. Nelle piante, per esempio, questo è migliore, utilizzare plasmidi binari come vettori di espressione e Agrobacterium come sistema di consegna. </li><li> Costruzione di vettori di espressione binari Clonare la sequenza codificante (s) della proteina (s) di interesse in un vettore di espressione da soli o in fusione traslazionale di un epitopo. Uso vettori adatti per il sistema di espressione scelto e procedure di biologia molecolare standard per la clonazione del gene. Per la consegna del gene mediata da Agrobacterium, impiegare vettori binari e far loro conoscere, utilizzando anche Standaprotocolli rd, in un ceppo Agrobacterium, come EHA105, per la successiva inoculazione di tessuti vegetali. </li><li> La scelta delle specie vegetali Selezionare le specie vegetali in cui verrà espressa la proteina (s) di interesse. Si noti che, mentre è possibile usare qualsiasi specie di piante sensibili alla trasformazione genetica mediata da Agrobacterium, la nostra specie vegetali di scelta è Nicotiana benthamiana, che è facilmente coltivata, altamente suscettibile Agrobacterium, e ha foglie grandi che sono facilmente inoculati. </li><li> La crescita delle piante Crescere un impianto da 4 a 6 settimane in una pentola con Pro-Mix BX in una pentola (20 centimetri x 20 centimetri x 20 cm) in condizioni eco-controllati (es. camera di crescita) di giorno lungo (cioè 16 h 130 -150 μE m-2 s-1 luce a 23 ° C e 8 h al buio a 20 ° C) e 40-65% di umidità relativa. 1.5.2 Concimazione tanto in tanto con i prodotti disponibili in commercio per le istruzioni del produttore. Una volta che la pianta viene coltivata, selezionarefoglie con le dimensioni di 50 mm x 70 mm o più grandi (queste misure di lunghezza non includono il picciolo) per Agrobacterium inoculazione. </li><li> Inoculazione con Agrobacterium Crescere ceppo Agrobacterium ospitare il costrutto binario esprimente la proteina (s) testato dal punto 1.3 notte a 28 ° C in mezzo YEP (1% peptone, estratto di lievito 1%, e 0,5% NaCl) supplementato con antibiotici appropriati (per esempio, 100 mg / L streptomicina e 10 mg / L rifampicina per vettori basati pPZP-RSC2 24-25). 1.6.2 Centrifugare le cellule, risospese a OD 600 = 0.5 in tampone infiltrazione [10 mM MgCl 2, 10 Mes mM (pH 5,6), 100 mM acetosyringone], e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Infiltrarsi nella cultura nel lato abaxial di una foglia, utilizzando una siringa senz&#39;ago 1-mL; notare che le foglie vengono inoculati in situ, mentre è attaccato alla pianta. 1.6.3 Dopo l&#39;infiltrazione, coltivare la pianta per 72 ore sotto il regime luce di 16 h 130-150 &amp;# 181, E m-2 s-1 luce a 23 ° C / 8 h al buio a 20 ° C prima della raccolta. </li><li> Applicazione di inibitori del proteasoma Per sostenere l&#39;idea che la proteina (s) testato è degradato attraverso una via del proteasoma, utilizzare specifici inibitori del proteasoma MG132 e lactacistina 28-29, che dovrebbe ridurre o addirittura bloccare il degrado. Quattro ore prima della raccolta (cfr. punto 2.1), infiltrarsi nelle zone foglia Agrobacterium-inoculati con 10 pM MG132 (EMD Millipore) o 10 micron lactacistina (Sigma-Aldrich) o mock-trattare la foglia con le rispettive solventi, cioè lo 0,1% DMSO o acqua distillata. </li></ol> 2. Preparazione di estratti cell-free <ol><li> Leaf raccolta Raccogliere le zone inoculati della foglia, di solito ca. 200-400 mg di peso fresco, e li macinare in polvere fine in azoto liquido. In alternativa, bead-battere i tessuti, utilizzando qualsiasi bead-beater (ad esempio, Biospec) o amalgamator dentale (ad esempio, TPC avanzata<html> Technologies) direttamente nel buffer di degradazione (cfr. punto 2.2). </li><li> Estrazione delle proteine Preparare l&#39;estratto proteico totale posizionando il tessuto macinato in 500 ml di tampone degradazione [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 100 mM, 10 mM MgCl 2, 5 mM DTT, adenosina 5 mM 5&#39;-trifosfato, e inibitore della proteasi 1x cocktail (Sigma-Aldrich)]. Si noti che il cocktail di inibitori delle proteasi colpisce principalmente serina, cisteina, aspartico, e metalloproteasi e non interferisce con la proteasi 26S. Chiarire l&#39;estratto da due centrifugazioni sequenziali a 12.000 xg per 5 min. </li><li> Reazione di degradazione delle proteine Trasferire volumi uguali di estratti, di solito 20 microlitri, per microcentrifuga tubi e incubare a temperatura ambiente per periodi di tempo crescente. Tipicamente, il tempo di campionamento pari a zero, e 5, 10, 15, 20, e 30 min punti temporali. Smettere di reazioni facendo bollire in SDS tampone di gel-sample, e analizzarli mediante western blotting. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. Rilevamento degradazione della proteina mediante immunoblotting <ol><li> Elettroforesi su gel 3.1.1 risolvere i campioni di proteine ​​mediante elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide e electrotransfer le proteine ​​deliberato di una membrana di nitrocellulosa secondo il protocollo standard 30. 3.1.2 Determinare concentrazione proteica utilizzando il metodo di Bradford (Bio-Rad), e caricare 50-80 mg di proteine ​​totali per corsia. Assicurarsi che tutti i campioni sono stati caricati allo stesso modo. Per i controlli di carico, confrontare le intensità di una specie di proteine ​​ubiquitarie, come putativo Rubisco grandi catene che migrano come una band importante con una mobilità elettroforetica relativa di circa 50 kDa, possono essere rilevati Coomassie gel-blu macchiato o Ponceau S-o fluorescente SYPRO Ruby-tinto membrane di nitrocellulosa. </li><li> Blocco Bloccare la membrana con 5% di latte scremato in TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) per 1 ora a temperatura ambiente. </li&gt; <li> Anticorpo primario Diluire anticorpo anti-epitopo primario in 1% di latte scremato in TBST alla concentrazione raccomandato dal produttore e incubare con la membrana bloccata per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C con agitazione. </li><li> Risciacquo Sciacquare la membrana viene sciacquato con 20 ml TBST per 15 minuti una volta e due volte per 5 minuti a temperatura ambiente con agitazione. </li><li> Anticorpo secondario Diluire anticorpo secondario (ad esempio IgG anti-coniglio) coniugato con perossidasi di rafano (HRP) in 1% di latte scremato in TBST come raccomandato dal fabbricante e incubare con la membrana per 1 ora a temperatura ambiente con agitazione. </li><li> Rivelazione Sciacquare nuovamente la membrana come descritto al punto 3.4. Dopo il risciacquo finale in TBST, visualizzare le proteine ​​di interesse, con un substrato chemiluminescente HRP, più comunemente utilizzando un kit ECL. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo test si basa sulla espressione delle proteine ​​testati in tessuti vegetali, quindi, il potenziale processo di degradazione proteasoma avviene ovviamente già all&#39;interno dei tessuti viventi. Abbiamo protein assay destabilizzazione, tuttavia, solo negli estratti, con il tempo di campionamento di zero che serve come punto di riferimento iniziale. Quindi, definiamo come un saggio privo di cellule. Un aspetto importante per il successo di questo test è la corretta scelta del vettore d...

Il proteasoma percorso ubiquitin/26S sta emergendo come un meccanismo diffuso per il controllo di diverse reazioni biologiche, tra cui regolazione trascrizionale, la progressione del ciclo cellulare e trasduzione del segnale, recettori down-regulation o endocitosi, tra gli altri processi 1-4. In questo percorso, la proteina bersaglio viene etichettato da ubiquitina residui che vengono prima collegati tramite un legame thiolester to-ubiquitina attivando l&#39;enzima E1 e poi traslocato a un residuo di acido cisteina amino ubiquitina-coniugazione enzima E2, infine, E2 interagisce con ubiquitina ligasi E3 , con conseguente polyubiquitination del substrato proteico. In definitiva, le proteine ​​polyubiquitinated sono riconosciuti e degradati dal proteasoma 26S. In questo meccanismo, l&#39;enzima E3 specifica il substrato e funge da elemento regolatore chiave del sistema proteasoma ubiquitin/26S (UPS). Ligasi E3 possono agire in modo indipendente, come ligases dominio RING, o come parte di un SCF multisubunit (S) complesso proteico kp1/Cullin/F-box, come ad esempio F-box ligases dominio. SCF-mediate vie di degradazione del proteasoma sono coinvolti nella regolazione della trascrizione, ciclo cellulare, la trasduzione del segnale 5-10 e molte altre importanti funzioni cellulari. Oltre a questi ruoli critici nella regolazione dei processi cellulari, UPS prende il palco centrale in molte interazioni pianta-patogeno. Ad esempio, una crescente evidenza suggerisce che diversi agenti patogeni delle piante, tra cui Agrobacterium tumefaciens, si basano su l&#39;UPS host per per facilitare il processo di infezione 11. Agrobacterium provoca escrescenze neoplastiche sulle piante, che rappresentano i suoi ospiti naturali, e può anche trasformare una vasta gamma di altri eucarioti, da funghi 1,2 a cellule umane 12,13. Durante la sua infezione, Agrobacterium esporta un elemento DNA (T-DNA) e vari virulenza (vir) proteine ​​nella cellula ospite 12-13. Una di queste proteine ​​è VirF, la prima proteina F-box trovatiessere codificati da un genoma procariotico 14. Come parte del complesso SCF ubiquitina ligasi, VirF, e il suo omologo ospitante funzionale VBF 15, facilitare infezione Agrobacterium tramite la degradazione delle proteine ​​UPS-mediata, che facilita presumibilmente uncoating del invadere batterica T-DNA dalle proteine ​​batteriche e ospitanti accompagnamento, VirE2 e VIP1 rispettivamente 16,17. È interessante notare che molte proteine ​​F-box, tra cui VirF, sono intrinsecamente instabili a causa della loro proteolisi, che è mediata da attività autoubiquitination 18,19 o da altri ligasi E3 per i quali le proteine ​​F-box possono fungere da substrati 20-23. Quando si studia attività biochimiche delle proteine ​​F-box, altri ligasi ubiquitina, e / o le loro substrati, sarebbe molto utile un test semplice e affidabile per la degradazione del proteasoma. Qui si descrive un tale protocollo per analizzare la stabilità della proteina in una cellula-Libero Sistema. In questo saggio, la stabilità del substrato UPS viene analizzato in presenza o assenza di uno dei componenti essenziali del percorso di degradazione proteasoma, come una proteina F-box, in un sistema acellulare. In generale, esprimiamo la proteina (s) testato in tessuti vegetali, preparare estratti privi di cellule di questi tessuti e monitorare la quantità di proteina (s) di interesse mediante western blotting. Il meccanismo UPS-dipendente di degradazione proteica è dimostrata dalla inclusione di inibitori del proteasoma specifici e / o tramite coespressione di forma dominante negativa di un componente SCF, Cullin. Considerando che illustriamo questo dosaggio utilizzando proteasoma degradazione della proteina Arabidopsis VIP1 17 dalla proteina F-box VBF 15, può essere impiegato per studiare la stabilità di eventuali altri substrati del proteasoma.

<table><tbody><tr><td>Kit di dosaggio delle proteine</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0001</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteinasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Mini-Proteiforme</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di elettrotrasferimento SD con western blotting</td><td>semi-secco Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Affinità Coniglio purificato Anti-Ha</td><td>ICL Lab</td><td>RHGT-45A-Z</td><td></td></tr><tr><td>Capra IgG Perossidasi coniugato</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>BioTrace, NT membrana di trasferimento di nitrocellulosa</td><td>Pall Corporation</td><td>27377-000</td><td></td></tr><tr><td>Substrato HRP chemiluminescente occidentale Immobilon</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>EMD Millipore</td><td>474790-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Lattacistina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Kit di macchie occidentali rapide Thermo Scientific Pierce, Pierce</td><td></td><td>35055</td> <td>del substrato ECL</td></tr></tbody></table>

saggio del proteasoma degradazione in un sistema di libero-cell nelle piante

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Il pathway ubiquitina-proteasoma per la degradazione delle proteine ​​è emerso come uno dei meccanismi più importanti per la regolazione di un ampio spettro di funzioni cellulari in quasi tutti gli organismi eucarioti. In particolare, nelle piante, il sistema proteasoma ubiquitin/26S (UPS) regola la degradazione delle proteine ​​e contribuisce significativamente allo sviluppo di una vasta gamma di processi, compresa la risposta immunitaria, lo sviluppo e la morte cellulare programmata. Inoltre, sempre più evidenze suggeriscono che numerosi agenti patogeni delle piante, quali Agrobacterium, sfruttano l&#39;UPS di accoglienza per l&#39;infezione efficiente, sottolineando l&#39;importanza della continuità nelle interazioni pianta-patogeno. La specificità di substrato della UPS è raggiunto dalla ubiquitina ligasi E3 che agisce di concerto con la E1 e E2 ligasi di riconoscere e marcare molecole proteiche specifici destinati a degradazione da dandole catene di molecole di ubiquitina. Una classe delle ligasi E3 è la SCF (Skp1 / Cproteina Ullin / F-box) complessa, che riconosce specificamente i substrati UPS e obiettivi per l&#39;ubiquitinazione attraverso la sua componente proteica F-box. Per studiare il ruolo potenziale di UPS in un processo biologico di interesse, è importante mettere a punto un saggio semplice e affidabile per degradazione proteica UPS-mediata. Qui, descriviamo un tale saggio usando un sistema acellulare pianta. Questo test può essere adattato per lo studio dei ruoli di degradazione delle proteine ​​regolamentato in diversi processi cellulari, con un focus particolare sulle interazioni proteina-substrato F-box.

Figura 1, adattato da Zaltsman et al. 17, illustra esperimenti rappresentativi per il rilevamento di degradazione del proteasoma in un sistema acellulare. In particolare, dimostriamo destabilizzazione di un impianto destinato alla difesa proteina VIP1 dalla proteina F-box VBF attraverso la via SCF VBF in N. benthamiana. Arabidopsis VBF e VIP1 (HA-VIP1) proteine ​​HA-tagged stati transitoriamente coespressi, e HA-VIP1 proteina contenuto all&#39;in...

Degradazione delle proteine ​​mirata rappresenta un importante meccanismo di regolazione per la funzione delle cellule. Essa si verifica attraverso una via ubiquitina-proteasoma conservati, che attribuisce catene polyubiquitin alla proteina bersaglio che poi servire &quot;tag&quot; molecolari per il proteasoma 26S. Qui, descriviamo un saggio semplice e affidabile senza cellula per proteasoma degradazione delle proteine.

Saggio del proteasoma degradazione in un sistema di libero-Cell nelle piante

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare la stabilità proteica in un sistema privo di cellule. Questo viene ottenuto inoculando Oceana Biana con diverse ceppi di agrobatterio, contenenti il costrutto binario che codifica per la proteina di interesse.Le proteine totali vengono quindi estratte dalle foglie della pianta. Le foglie vengono trasferite in provette microcentrifuga e incubate a temperatura ambiente per periodi di tempo crescenti. Successivamente, i campioni proteici vengono separati mediante elettroforesi su gel di acrilamide SDS e trasferiti elettroforeticamente su una membrana di nitrocellulosa.Al fine di rilevare la proteina di interesse mediante un anticorpo specifico, si ottengono risultati che mostrano la stabilità proteica in presenza o in assenza di un inibitore specifico del proteasoma, basati sull'analisi mediante western blotting. Descriviamo qui una metodologia semplice per studiare la stabilità del substrato proteico cistico del protosoma INE in presenza o in assenza di uno dei componenti essenziali del percorso di degradazione proteasomiale in un sistema privo di cellule. Pertanto, questi metodi possono fornire informazioni su una degradazio

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Un metodo per monitorare l'attività ubiquitina-proteasoma in cellule viventi è descritto. Un degron-destabilizzato GFP-(GFP-dgn) e di una stalla GFP-dgnFS proteina di fusione vengono generati e trasdotto nella cella utilizzando un vettore lentivirale espressione. Questa tecnica permette di generare una linea cellulare stabile GFP-dgn/GFP-dgnFS esprimendo in cui ubiquitina-proteasoma attività può essere facilmente valutata usando epifluorescenza o citometria a flusso.

Monitoraggio del sistema ubiquitina-proteasoma attività nelle cellule viventi Utilizzando una degron (dgn)-destabilizzato proteina verde fluorescente (GFP) a base di proteine ​​Reporter

In questo video, dimostriamo un saggio di aggregazione proteica basato su cellule utilizzando inibitori del proteasoma, che bloccano l'attività del proteasoma, impedendo alle proteine mutanti mal ripiegate, fuse in un'etichetta fluorescente, di subire la degradazione del proteasoma ubiquitina-dipendente, portando al loro accumulo all'interno del citoplasma cellulare. Gli aggregati proteici vengono quindi visualizzati e quantificati mediante microscopia a fluorescenza.

Saggio di formazione di aggregati proteici: un metodo per rilevare e quantificare l'aggregazione proteica in cellule coltivate dopo induzione da parte dell'inibitore del proteasoma

Questo video descrive un test di degradazione per proteine mal ripiegate utilizzando il trattamento con cicloesimide insieme al frazionamento del detergente. Questo metodo aiuta a studiare la dinamica delle proteine mal ripiegate e a scoprire i meccanismi approfonditi del turnover proteico.

Saggio di degradazione delle proteine incline al ripiegamento errato: una tecnica per monitorare la degradazione delle proteine mal ripiegate utilizzando il trattamento con cicloesimide e il frazionamento dei detergenti

Descriviamo qui un protocollo per la purificazione e caratterizzazione di complessi proteici vegetali. Dimostriamo che immunoprecipitando una singola proteina all'interno di un complesso, in modo da poter identificare le sue modificazioni post-traslazionali e dei suoi partner interagenti.

Identificazione delle modificazioni post-traduzionali di proteine ​​vegetali Complessi

Qui descriviamo un robusto test biologico per quantificare il tasso relativo di proteolisi da parte del sistema ubiquitina-proteasoma. La lettura del saggio è il tasso di crescita del lievito in coltura liquida, che dipende dai livelli cellulari di una proteina reporter che comprende un segnale di degradazione fuso con un marcatore metabolico essenziale.

Saggio di crescita a base Reporter, per l&#39;analisi sistematica di proteine ​​degradazione

Questo articolo descrive un saggio basato sulla crescita del lievito per la determinazione dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine. Dimostra anche un metodo per l'estrazione rapida delle proteine del lievito, adatto al western blotting per confermare biochimicamente i requisiti di degradazione. Queste tecniche possono essere adattate per monitorare la degradazione di una varietà di proteine.

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Questo rapporto descrive i protocolli per misurare i tassi di degradazione delle proteine mal ripiegate mediante western blot o saggi basati sulla fluorescenza. I metodi possono essere applicati all'analisi di altre proteine mal ripiegate e per lo screening ad alto rendimento.

Saggi per la degradazione delle proteine ​​nelle cellule mal ripiegate

Qui presentiamo un protocollo di cattura di interazione applicato ai protoplasti a foglia di Arabidopsis thaliana . Questo metodo si basa fondamentalmente sulla creazione di reticolazione UV in vivo e consente l'isolamento e l'identificazione delle proteine ​​legate alla mRNA da un ambiente fisiologico.

Cattura di Interactome mRNA da protoplasti vegetali

Questo protocollo descrive un metodo per determinare la proteina emivite in singole cellule aderenti, utilizzando impulsi etichettatura e time-lapse imaging di fluorescenza di proteine di fusione SNAP-tag.

Cella singola quantificazione dei tassi di degradazione delle proteine mediante microscopia a fluorescenza time-lapse in coltura delle cellule aderenti

Interazioni proteina-proteina e proteina-metabolita sono cruciali per tutte le funzioni cellulari. Qui, descriviamo un protocollo che permette l'analisi parallela di queste interazioni con una proteina di scelta. Il nostro protocollo è stato ottimizzato per colture di cellule vegetali e combina purificazione di affinità con proteina basati sulla spettrometria di massa e rilevamento di metabolita.

2 in 1: purificazione di affinità per l'analisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio

Qui è presentato un approccio fosfoproteomico, vale a dire fosfoproteomico a base di punta di estrazione stop and go, che fornisce un'elevata produttività e una copertura profonda del fosfoproteoma arabidopsis. Questo approccio delinea la panoramica della segnalazione dello stress osmotico in Arabidopsis.

Strategia fosfoproteomica per la profilazione del segnale di stress osmotico in Arabidopsis

Scopri un saggio cell-free per analizzare la degradazione proteica nel pathway ubiquitina-proteasoma nelle piante. Questo metodo permette di studiare la stabilità delle proteine in condizioni controllate.

Saggio del proteasoma degradazione in un sistema di libero-Cell nelle piante

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