Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire l'imaging e l'analisi della mitosi progenitrice neurale in fette di cervello di topo vivo. Ciò si ottiene sezionando prima i cervelli dagli embrioni. Il secondo passo è preparare le fette di cervello con un vibrato.

Successivamente, viene eseguita l'imaging dal vivo di fette di cervello. Il passaggio finale consiste nell'estrarre informazioni dai filmati per analizzare i parametri di mitosi di interesse. In definitiva, la microscopia time-lapse viene utilizzata per mostrare come le popolazioni progenitrici del cervello si dividono in tempo reale.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi fissa, è che si possono ottenere informazioni significative sulle dinamiche temporali della divisione dei neuroprogenitori in fette di cervello vivo. Può anche essere utilizzato per capire come le perturbazioni genetiche possono influenzare la divisione neuroprogenitrice. Sebbene utilizziamo questo metodo per comprendere lo sviluppo corticale, l'analisi che abbiamo descritto può essere applicata allo studio della mitosi delle cellule staminali in altre regioni del cervello o anche al di fuori del cervello.

A dimostrare questa procedura sarà Louis Y, un borsista post-dottorato del mio laboratorio. Inizia questa procedura raccogliendo gli embrioni di topo e seziona i cervelli embrionali, compresi i cervelli posteriori e i quattro cervelli con i due emisferi cerebrali. In un secchio di ghiaccio, creare un foro nel ghiaccio per gli stampi da incorporare.

Quindi, versare il 3% di terreno in uno stampo di plastica e posizionare lo stampo nel foro del ghiaccio. Mescolare l'aros medium con la punta di un termometro digitale fino a quando la temperatura raggiunge i 35 gradi Celsius. Quindi trasferire prontamente il cervello nel mezzo di inclusione per rimuovere l'eccesso di HBSS all'interfaccia tra il cervello e l'aros.

Ruotare con cautela e delicatezza il cervello ripetutamente nella soluzione di inclusione. Con la pinza, un cuscino di aros gelificato si formerà sul fondo dello stampo a contatto con il ghiaccio. Una volta che il cuscino può essere sentito con la punta della pinza mentre si mescola il cervello, posizionare il cervello con il lato dorsale rivolto verso l'alto, il cervello non dovrebbe affondare fino in fondo allo stampo.

Lasciate indurire gli aros nel ghiaccio per almeno cinque minuti prima di tagliare gli angoli dello stampo con una lametta. Incidi con cura un blocco aros attorno al cervello e cerca di ridurre al minimo il numero di tagli per evitare di perturbare il cervello incorporato. Con il VT 1000 s Viome genera fette da 200 a 250 micron.

Ora diluire cyto 11 a una concentrazione finale di 0,5 per un micromolare nel terreno di coltura a fette integrato con fattori di crescita e una piastra a 12 pozzetti incubare fette da un cervello in 2,5 millilitri della soluzione colorante in ciascun pozzetto per un'ora a 37 gradi Celsius. Quindi lavare le fette in 2,5 millilitri di terreno di coltura per fette senza soluzione colorante per 20 minuti. Per montare le sezioni cerebrali, posizionare una goccia di soluzione di collagene sul fondo di un piatto per micropozzetti con fondo in vetro da 35 millimetri.

Stenderlo con la punta di una pipetta in modo che corrisponda alle dimensioni della fetta. Quindi trasferisci una fetta in una goccia di collagene. Lasciare incubare le fette a temperatura ambiente per 10 minuti prima di trasferirle in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Dopo 20 minuti per un totale di 1,2 millilitri di terreno di coltura a fette nel micro fondo di vetro, impiattare 600 microlitri di terreno alla volta e distribuirlo con la punta di una pipetta. Lasciare riposare le fette nell'incubatore per almeno un'ora e 30 minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica prima di trasferirle nella camera di incubazione del microscopio confocale a disco rotante con le stesse condizioni. Per quanto riguarda l'imaging dal vivo, utilizzare un obiettivo a olio di silicio 60x con una distanza di lavoro di 300 micron e un'apertura numerica di 1,3.

Per l'imaging cellulare, le cellule in una pila Z da 30 micron con il centro della pila Z, situato a circa 40 micron sotto la superficie della fetta. Se necessario, regolare la potenza del laser e i tempi di esposizione per limitare il fotobleaching e utilizzare il tempo di esposizione che varia da 30 a 200 millisecondi a seconda dell'intensità del segnale cyto 11. Ecco i dati rappresentativi che si possono ottenere da questa analisi per identificare le figure mitotiche nell'immagine J.Dopo aver aperto il set di dati per una posizione come hyper stack, selezionare un piano Z in cui il tessuto e le cellule sembrano sani.

Scorri indietro nel tempo per identificare il punto temporale in cui la cellula entra in mitosi. La cella può muoversi attraverso i piani Z, ma la risoluzione temporale e i parametri di Zack descritti in precedenza sono stati ottimizzati per consentire questo processo. In un foglio di calcolo, registra le quattro coordinate D della cella nell'hyper stack mentre entra in mitosi.

Conoscere queste coordinate eviterà di contare la stessa cella più volte. Scorri in avanti nel tempo e registra il tempo in cui la cella avanza da una fase all'altra. Documentare la durata di ogni fase mitotica per una data cellula per condurre la ricostruzione 3D delle cellule e la quantificazione della rotazione durante la metafase.

Dopo aver identificato più cellule mitotiche, utilizzare le coordinate di una cella e scorrere in avanti nel tempo fino all'inizio. Metafase ruotare l'intero hyper stack in modo che il bordo ventricolare sia piallato. Utilizzare lo strumento angolo per determinare l'angolo da applicare per questa rotazione.

Identificare il piano Z in cui la cella di interesse è più visibile in quel piano. Usa lo strumento di selezione del rettangolo per disegnare una selezione che includa l'intera cella. Quindi identifica i piani Z che includono la cella di interesse e usa il comando duplica immagine per creare una sottopila.

Nella finestra di dialogo, lascia selezionata l'hyper stack duplicato le sezioni. Il parametro Z corrisponde ai piani Z, inclusa l'intera cella, mentre il parametro T dei fotogrammi corrisponde al punto temporale corrente. Successivamente, genera una ricostruzione 3D della cellula.

Al punto temporale corrente. La spaziatura delle sezioni corrisponde all'intervallo tra ciascuna delle immagini del piano Z in micron. Utilizzando la barra di scorrimento, ruotare la ricostruzione 3D risultante in modo che il bordo della piastra di metafase sia visibile.

Il numero del fotogramma corrisponde all'angolo beta. Registra questo numero. Quindi misurare l'angolo tra l'orizzontale e l'allineamento bys.

Sezionare la piastra di metafase perpendicolarmente. Questo è il record alfa dell'angolo. Questi angoli per tutti i punti temporali della metafase della cella di interesse.

L'angolo di rotazione tra i punti temporali t e t meno uno è uguale al valore assoluto della differenza tra un angolo in t e questo angolo in T meno uno lungo l'asse ventrale dorsale. La mitosi è più facilmente visibile nelle regioni dorsali delle fette cerebrali perché il processo basale dei GC R è più breve e quindi ha meno probabilità di essere reciso da un vioma. Lungo l'asse delle coccole ROS, le fette nelle regioni delle coccole della corteccia dorsale danno i risultati più coerenti.

Questi sono esempi di una regione buona e di una regione cattiva per l'imaging. In una buona regione. I nuclei sono di forma ellittica e molte cellule mitotiche sono state osservate al bordo del ventricolo prima dell'imaging time-lapse in una regione cattiva, pochissime cellule mitotiche sono state osservate al bordo del ventricolo e i nuclei sono rotondi.

Ecco un esempio di una buona fetta osservata con un microscopio a basso ingrandimento prima dell'imaging dal vivo, e qui ci sono alcuni esempi di cellule marcate con cyto 11 in diverse fasi della mitosi. Qui è mostrato un montaggio di una regione al confine del ventricolo dove due progenitori neurali attraversano le diverse fasi della mitosi contrassegnate con colori diversi Seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'elettroporazione neutra dei costrutti di DNA, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, tra cui qual è il destino delle cellule in divisione e come si comporta il citoscheletro?

È anche meglio utilizzare metodi secondari oltre al CY 11 per seguire la mitosi, come i topi transgenici H due VGFP. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come manipolare le fette di cervello, quali parametri di corrispondenza sono i migliori e come analizzare i dati.