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Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

Tecniche di microiniezione di Zebrafish

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JoVE Science Education Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

Zebrafish Microinjection Techniques

4.13: Introducing Experimental Agents into the Mouse

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08:12 min

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April 30, 2023

Overview

Uno dei principali vantaggi di lavorare con i pesci zebra (Danio rerio) è che la loro genetica può essere facilmente manipolata mediante microiniezione di embrioni in fase iniziale. Usando questa tecnica, le soluzioni contenenti materiale genetico o costrutti di abbattimento vengono consegnate nei blastomeri: le cellule embrionali sedute in cima al tuorlo dell’uovo appena fecondato. La consegna nel citoplasma si ottiene attraverso l’iniezione diretta nel blastomero o tramite movimenti citoplasmatici naturali che si verificano dopo che una soluzione è stata iniettata nel tuorlo. Le manipolazioni genetiche di successo sono solitamente seguite dalla quantificazione dei fenotipi embrionali al fine di chiarire i meccanismi genetici dello sviluppo.

Questo video fornirà un’introduzione all’esecuzione di microiniezioni in embrioni di zebrafish. La discussione inizia con una revisione degli strumenti essenziali per la tecnica, tra cui l’apparato di iniezione e il microiniettore, che controlla il movimento del fluido con impulsi di pressione dell’aria. Successivamente, vengono dimostrati importanti passaggi preparatori, come il versamento di piastre di agar per stabilizzare gli embrioni durante l’iniezione e la calibrazione dell’apparato di microiniezione. La procedura di iniezione viene quindi presentata insieme a suggerimenti su quando e dove devono essere eseguite le iniezioni. Infine, vengono discusse le applicazioni della tecnica di microiniezione, tra cui la sovraespressione genica tramite iniezione di mRNA, il silenziamento genico mediante somministrazione di oligonucleotidi morfolino antisenso e la generazione di zebrafish transgenico utilizzando DNA plasmidico appositamente ingegnerizzato.

Procedure

La microiniezione di embrioni di zebrafish consente ai ricercatori di fornire soluzioni direttamente nell’animale in via di sviluppo, al fine di studiare la funzione genica e le dinamiche di sviluppo. Gli embrioni dallo stadio da 1 a 4 cellule sono spesso usati per l’iniezione. Poiché non ci sono membrane che separano le cellule e il tuorlo in questa fase iniziale, le soluzioni iniettate in una cellula o nel tuorlo si diffonderanno uniformemente in tutto l’organismo. Utilizzando la microiniezione, i geni di produzione di proteine possono essere espressi o disattivati, a seconda del tipo di materiale iniettato. Questo video dimostrerà la preparazione della pipetta, la raccolta degli embrioni, la procedura di microiniezione e discuterà alcuni dei modi in cui questa tecnica viene utilizzata nei laboratori di oggi.

Per prima cosa, copriamo i componenti principali del sistema di microiniezione: lo stereoscopio, il microiniettore, il supporto della pipetta e il micromanipolatore.

Il microiniettore fornisce un volume preciso attraverso impulsi di pressione dell’aria, che possono essere regolati dall’utente. Il porta pipetta fissa la pipetta per l’uso durante la procedura e la collega alla compagnia aerea dell’iniettore. In genere, il supporto della pipetta viene inserito in un micromanipolatore. Questo strumento consente al ricercatore di effettuare piccole e accurate regolazioni alla posizione della pipetta durante la procedura di iniezione. Un pedale è collegato all’iniettore e consente al ricercatore di mantenere l’uso delle mani attivando contemporaneamente l’impulso di pressione per l’erogazione del materiale iniettabile. Infine, lo stereoscopio consente al ricercatore di vedere gli embrioni e concentrarsi sulla posizione della pipetta durante la procedura di microiniezione.

Prima che la microiniezione possa iniziare, devono essere preparati aghi di vetro. Gli aghi per microiniezione devono essere di dimensioni costanti per consentire la consegna precisa dei materiali per iniezione. Un estrattore di pipette aiuta a garantire che le pipette fini e affilate vengano preparate ogni volta. L’estrattore riscalda un tubo capillare di vetro mentre esercita una forza che tira sul tubo, risultando in due aghi pipetta.

Al microscopio, usando una pinza, la punta viene tagliata in un modo che consente di consegnare un volume costante di liquido, ma mantiene la nitidezza dell’ago per perforare l’embrione di zebrafish.

Il rosso fenolo, un colorante utilizzato per aiutare a visualizzare la procedura di iniezione, può essere miscelato con la soluzione di iniezione al fine di monitorare il successo dell’iniezione nell’embrione.

Gli aghi possono essere caricati con soluzione iniettabile dal lato della punta tramite azione capillare, oppure possono essere riempiti con una siringa microloader. Una volta caricato l’ago per l’iniezione, può essere inserito nel supporto della pipetta sul micromanipolatore.

Dopo che gli aghi per iniezione sono pronti, le impostazioni di pressione e tempo del microiniettore vengono regolate al fine di calibrare ciascun ago, il che garantirà che venga consegnato un volume costante a ciascun embrione. Sotto lo stereoscopio, una piccola quantità di soluzione viene iniettata in una goccia di olio minerale su un vetrino. Viene misurata la dimensione della goccia e può essere calcolato il volume che l’ago disperde. Successivamente, la pressione del microiniettore può essere ulteriormente regolata e il processo ripetuto fino a ottenere regolarmente una goccia della dimensione desiderata.

Una volta che gli aghi sono preparati e calibrati, gli embrioni vengono ottenuti e disposti per l’iniezione.

Gli embrioni devono essere posizionati con cura e tenuti fermi durante l’iniezione da una camera di microiniezione. Per creare una camera di microiniezione, gli stampi vengono posti in una capsula di Petri e l’agarose fuso viene versato nel piatto e lasciato indurire. Una volta solidificato, lo stampo viene rimosso e il mezzo embrionale viene versato sopra. Gli embrioni possono essere allineati in abbeveratoi creati dallo stampo utilizzando una pipetta di trasferimento. Un’alternativa alla disposizione degli embrioni in agarose è quella di allinearli lungo il bordo di un vetrino per microscopio, in modo che siano posizionati in una colonna per la microiniezione

Una volta che sono in posizione, gli embrioni sono pronti per essere iniettati.

Gli embrioni possono essere iniettati nel tuorlo o nel citoplasma cellulare. L’iniezione nel tuorlo è più semplice e richiede una tecnica di iniezione meno sofisticata, mentre l’iniezione nel citoplasma è più difficile, ma produce risultati più robusti. Per iniettare nel tuorlo, utilizzare il micromanipolatore per spostare l’ago in modo che perfori il corion e quindi il tuorlo. Il pedale viene quindi toccato per far sì che il contenuto dell’ago venga espulso nel tuorlo. Il flusso e la diffusione citoplasmatica consentono alla soluzione iniettabile di fluire nella cellula.

L’iniezione nel citoplasma richiede un attento posizionamento dell’embrione, in modo che il citoplasma possa essere efficacemente mirato.

Dopo l’iniezione, gli embrioni vengono trasferiti in un nuovo piatto e incubati a 28,5 °C. Sono spesso controllati per rimuovere gli embrioni morti.

Per determinare il successo dell’iniezione, gli embrioni possono essere analizzati in base al loro aspetto generale, alla presenza di un marcatore fluorescente e alla ricerca di cambiamenti nel loro genoma utilizzando la genotipizzazione.

Ora che hai capito come iniettare embrioni di zebrafish, diamo un’occhiata a come gli scienziati possono usare questa tecnica per capire la funzione dei geni.

In primo luogo, gli scienziati possono iniettare mRNA sintetizzato per sovraesprimere determinati geni e determinare la loro funzione osservando il fenotipo. Questa stessa tecnica può anche essere utilizzata per esprimere proteine che evidenziano eventi molecolari, come i riarrangiamenti citoscheletrici che si verificano durante lo sviluppo.

In secondo luogo, i geni possono essere disattivati dall’iniezione di morfolinos. I morfolinos sono analoghi stabili dell’acido nucleico sintetico che possono essere progettati per legarsi a specifiche sequenze di mRNA mediante accoppiamento standard di base di acidi nucleici e traslazione di blocchi. A sua volta, questo porta alla perdita della proteina prodotta da quell’mRNA. Questo effetto consente ai ricercatori di comprendere il ruolo di un particolare gene nello sviluppo vedendo come lo sviluppo viene alterato in sua assenza.

L’iniezione può essere utilizzata per incorporare DNA estraneo nel pesce zebra. Iniettando sequenze contenenti siti di riconoscimento per gli enzimi che modificano il DNA, gli scienziati possono generare in modo efficiente pesci “transgenici” con genomi modificati, il che significa che geni estranei saranno trasmessi alle generazioni future. A seconda del design della sequenza, l’espressione genica può essere limitata a tessuti specifici o a specifici punti temporali di sviluppo.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE alla microiniezione di embrioni precoci di zebrafish. Questo video ha introdotto la configurazione della microiniezione, ha dimostrato come preparare gli aghi per microiniezione, ha mostrato come preparare gli embrioni per la microiniezione, eseguire la tecnica di microiniezione e alcune applicazioni della microiniezione. Come sempre, grazie per aver guardato!

Transcript

Microinjection of zebrafish embryos allows researchers to deliver solutions directly into the developing animal, in order to study gene function and developmental dynamics. Embryos from the 1 to 4-cell stage are frequently used for injection. Because there are no membranes separating the cells and the yolk at this early stage, solutions injected in either one cell or the yolk will evenly spread throughout the organism. By using microinjection, protein production genes can be expressed, or turned off, depending on the type of material injected. This video will demonstrate pipette preparation, embryo collection, the microinjection procedure, and discuss some of the ways this technique is used in labs today.

First, let’s cover the major components of the microinjection system: The stereoscope, microinjector, pipette holder, and micromanipulator.

The microinjector delivers precise volume through pressure pulses of air, which can be adjusted by the user. The pipette holder secures the pipette for use during the procedure and connects it to the airline of the injector. Typically, the pipette holder is placed in a micromanipulator. This instrument allows the researcher to make small and accurate adjustments to the pipette location during the injection procedure. A foot pedal is connected to the injector and allows the researcher to maintain use of their hands while simultaneously activating the pressure pulse for injection material delivery. Finally, the stereoscope allows the researcher to see the embryos and focus on the location of the pipette during the microinjection procedure.

Before microinjection can begin, glass needles must be prepared. Microinjection needles must be of a consistent size to allow for precise delivery of injection materials. A pipette puller helps ensure fine and sharp pipettes are prepared every time. The puller heats a glass capillary tube while exerting force that pulls on the tube, resulting in two pipette needles.

Under the microscope, using forceps, the tip is cut off in a manner that allows for a consistent volume of liquid to be delivered, yet maintains the sharpness of the needle for piercing the zebrafish embryo.

Phenol red, a dye used to help visualize the injection procedure, can be mixed with the injection solution in order to track successful injection into the embryo.

Needles can be loaded with injection solution from the tip side via capillary action, or they can be backfilled with a microloader syringe. Once the needle is loaded for injection, it can be inserted into the pipette holder on the micromanipulator.

After the injection needles are ready, the microinjector pressure and time settings are adjusted in order to calibrate each needle, which will ensure a consistent volume is delivered to each embryo. Under the stereoscope, a small amount of solution is injected into a drop of mineral oil on a slide. The size of the droplet is measured and the volume that the needle disperses can be calculated. Subsequently, the pressure of the microinjector can be further adjusted and the process repeated until a droplet of the desired size is regularly obtained.

Once needles are prepared and calibrated, embryos are obtained and arranged for injection.

Embryos must be positioned carefully and held stationary during injection by a microinjection chamber. To create a microinjection chamber, molds are placed in a petri dish and molten agarose is poured into the dish and allowed to harden. Once it has solidified, the mold is removed and the embryo medium is poured on top. The embryos can be lined up in troughs that were created by the mold using a transfer pipette. One alternative to arranging the embryos in agarose is to line them up along the edge of a microscope slide, so they are positioned in a column for microinjection

Once they are in position, the embryos are ready to be injected.

Embryos can be injected either into the yolk or cell cytoplasm. Injection into the yolk is simpler and requires less sophisticated injection technique, while injection into the cytoplasm is more difficult, but yields more robust results. To inject into the yolk, use the micromanipulator to move the needle so that it pierces the chorion and then the yolk. The foot pedal is then tapped to cause the contents of the needle to be expelled into yolk. Cytoplasmic flow and diffusion allows the injection solution to flow into the cell.

Injection into the cytoplasm requires careful positioning of the embryo, so that the cytoplasm can be effectively targeted.

Following injection, embryos are transferred to a new dish and incubated at 28.5 °C. They are frequently checked to remove dead embryos.

To determine the success of the injection, embryos can be analyzed based on their overall appearance, the presence of a fluorescent marker, and by looking for changes in their genome using genotyping.

Now that you understand how to inject zebrafish embryos, let’s look how scientists can use this technique to understand the function of genes.

First, scientists can inject synthesized mRNA to overexpress certain genes and determine their function by observing phenotype. This same technique can also be used to express proteins that highlight molecular events, such as the cytoskeletal rearrangements that occur during development.

Second, genes can be turned off by the injection of morpholinos. Morpholinos are stable synthetic nucleic acid analogs that can be designed to bind to specific mRNA sequences by standard nucleic acid base pairing, and block translation. In turn, this leads to loss of the protein produced by that mRNA. This effect allows researchers to understand the role of a particular gene in development by seeing how development is altered in its absence.

Injection can be used to incorporate foreign DNA into the zebrafish. By injecting sequences containing recognition sites for DNA modifying enzymes, scientists can efficiently generate “transgenic” fish with modified genomes, meaning that foreign genes will be passed on to future generations. Depending on the sequence design, gene expression can be confined to specific tissues or specific developmental timepoints.

You’ve just watched JoVE’s introduction to microinjection of early zebrafish embryos. This video has introduced the microinjection setup, demonstrated how to prepare microinjection needles, shown how to prepare embryos for microinjection, perform the microinjection technique, and some applications of microinjection. As always, thanks for watching!

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