Bioenergetica e il burst ossidativo: Protocolli per l'isolamento e la valutazione dei leucociti umani e piastrine

Nel seguente protocollo, verrà illustrata la misurazione dei profili bioenergetici e delle risposte da burst ossidativo di monociti, linfociti, neutrofili e piastrine del sangue umano. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo le frazioni di strato buffy e di plasma ricco di piastrine da sangue appena prelevato. Come secondo passaggio, la popolazione eterogenea di globuli bianchi viene separata in strati di cellule mononucleate e polimorfonucleate mediante gradiente di densità.

Successivamente, le popolazioni pure di monociti, neutrofili e linfociti vengono ulteriormente isolate mediante separazione massima e quindi seminate per l'analisi del flusso extracellulare o dell'analisi XF. In definitiva, è possibile misurare in modo sensibile e riproducibile la funzione mitocondriale in monociti, linfociti e piastrine, nonché il burst ossidativo e i tassi di consumo di ossigeno di monociti e neutrofili, mediante la tecnologia XF. Il vantaggio della tecnica che vi mostreremo oggi consiste nella possibilità di preparare, a partire da un piccolo campione di sangue, tutte le principali cellule presenti nel sangue del paziente.

Questi sono piastrine e leucociti in una forma pura e inattivata, nei quali si misura la funzione mitocondriale. Riteniamo che questo possa riflettere in tempo reale diverse patologie e condizioni del paziente. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande fondamentali riguardo il metabolismo, come ad esempio quale ruolo svolgono lo stile di vita, l'alimentazione e lo stress patologico sulla funzione mitocondriale.

Questo protocollo combina diverse tecnologie per l'isolamento e la determinazione della bioenergetica cellulare in varie popolazioni di leucociti e nelle piastrine. Questo passaggio del protocollo è molto critico poiché il gradiente di densità e la separazione magnetica richiedono una pipettatura precisa. Inoltre, è necessario sapere esattamente dove si trovano le popolazioni cellulari durante la frazionamento.

Illustreremo l'isolamento delle cellule del sangue periferico e l'analisi della bioenergetica cellulare mediante l'analizzatore del flusso extracellulare a 24 pozzetti o XF 24. Tuttavia, questo metodo può essere eseguito anche sull'XF 96. Almeno due ore prima di iniziare la procedura, idratare le sonde della cartuccia sensore XF con soluzione XF calibrata.

Quindi centrifugare il sangue intero appena prelevato per 15 minuti a 500 ×g e a temperatura ambiente in una centrifuga con rotore a cestelli oscillanti. Utilizzare una pipetta trasferibile per rimuovere lo strato superiore contenente il plasma ricco di piastrine, lasciando un centimetro di plasma al di sopra dello strato del buffy coat eritrocitario, e mettere da parte il plasma a temperatura ambiente per un successivo trattamento. Successivamente, trasferire il buffy coat in un tubo conico sterile da 50 millilitri e diluire le cellule bianche fino a 24 millilitri.

Successivamente, con RPMI basale, aggiungere tre millilitri di densità bassa, soluzione opaca 1.077 in ciascuna di tre provette coniche da 15 millilitri. Quindi inserire la punta di una pipetta stretta da cinque millilitri nel fondo di ciascuna provetta. A turno, rilasciare lentamente tre millilitri di densità elevata, soluzione opaca 1.119.

Ora, utilizzare una pipetta automatica impostata su potenza bassa per aggiungere con attenzione otto millilitri di sangue diluito a ciascun gradiente senza disturbare gli strati. All'interfaccia a bassa densità è stato aggiunto un colorante blu per visualizzare tutti gli strati del gradiente. Dopo aver separato le cellule mediante centrifugazione separata, raccogliere le cellule mononucleate e polimorfonucleate con pipette di vetro sterili senza disturbare le altre bande cellulari.

Riunire le popolazioni di cellule mononucleate e polimorfonucleate di ogni provetta in singole provette coniche sterili da 50 millilitri per ogni tipo cellulare, e aggiungere quattro volumi di RPMI ad entrambe le provette. Dopo aver centrifugato le cellule, trasferire i pellet in una provetta da 1,5 millilitro, ri-pellettizzare e risospendere in 80 microlitri di RPMI fresco integrato con BSA. Successivamente, aggiungere 20 microlitri di microsferette magnetiche marcate con anticorpi anti-CD14 e anti-CD15 rispettivamente alle frazioni di cellule mononucleate e polimorfonucleate.

Incubare ogni sospensione cellulare per 15 minuti a quattro gradi Celsius, quindi lavare ogni provetta con un millilitro di mezzo R-P-M-I-B-S-A e risospendere i pellet in 500 microlitri di R-P-M-I-B-S-A. Applicare quindi le sospensioni cellulari su colonne LS singole prelavate con R-P-M-I-B-S-A e lavare ogni colonna tre volte con tre millilitri di mezzo R-P-M-I-B-S-A. Raccogliere i passaggi iniziali delle sospensioni cellulari e i lavaggi della colonna in provette sterili per isolare i monociti e i neutrofili; rimuovere le colonne dal campo magnetico dopo l'ultimo lavaggio ed eluire le cellule positivamente selezionate in una provetta sterile con cinque millilitri di R-P-M-I-B-S-A. Per isolare i linfociti, centrifugare la frazione di lavaggio del passaggio iniziale della colonna cellulare, risospendere il pellet cellulare in 80 microlitri di R-P-M-I-B-S-A e incubare le cellule con 20 microlitri di anticorpi CD 61 e CD 2 35 A per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi ripetere la massima separazione come in precedenza e raccogliere il flusso passante contenente i linfociti per isolare le piastrine; centrifugare il plasma ricco di piastrine precedentemente riservato, quindi rimuovere il plasma e lavare il pellet cellulare una volta con cinque millilitri di PBS sterile integrato con un microgrammo per millilitro di prostaglandina I₂. Ri-sospendere il pellet di piastrine in un millilitro di tampone PBS fresco con prostaglandina I₂ per piastrinare i monociti, linfociti, neutrofili e piastrine isolati. Contare innanzitutto le cellule e portarle a un volume appropriato nel mezzo per saggio XF, in modo da ottenere una densità di semina di 2,5 × 10⁵ cellule per pozzetto in un volume di 200 microlitri. In una micro-piastra per coltura cellulare XF a 24 pozzetti rivestita con Cell-T per piastrine, seminare 2,5 × 10⁷ cellule per pozzetto in un volume di 200 microlitri.

Dopo aver centrifugato le cellule sulla piastra, portare i volumi finali dei pozzetti a 660 microlitri con il mezzo XF e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 30 minuti prima del saggio XF. Durante questa incubazione, caricare 75 microlitri dei reagenti del saggio, nell'ordine indicato, nei fori di iniezione della cartuccia sensoriale XF. Se si desidera ottenere misurazioni dell'esplosione ossidativa, la PMA può essere iniettata dopo l'antimicina, in un foro di iniezione successivo. Posizionare quindi la cartuccia sull'analizzatore del flusso extracellulare per iniziare il saggio. I profili bioenergetici di leucociti e piastrine possono essere determinati utilizzando l'analizzatore del flusso extracellulare Seahorse XF, che misura in tempo reale il consumo di ossigeno nelle cellule in modo non invasivo.

Ogni tipo di cellula viene seminato sulla piastra XF 24 con cinque replicati, come appena illustrato nella tabella. Vengono mostrati valori rappresentativi di consumo basale e di burst ossidativo misurati durante il saggio e le concentrazioni medie di proteine per pozzetto, suddivisi per tipo cellulare. I valori del tasso di consumo di ossigeno vengono normalizzati rispetto al contenuto totale di proteine nei pozzetti corrispondenti ed espressi come pmoli al minuto per microgrammo di proteina. Il tasso basale di consumo di ossigeno viene quindi determinato dalle prime tre misurazioni.

La oligomicina, un inibitore della sintetasi ATP mitocondriale, viene iniettata nel mezzo XF per stimare il tasso di consumo di ossigeno accoppiato alla sintesi di ATP, rappresentato come consumo di ossigeno legato all'ATP; il consumo residuo di ossigeno, sottratto quello di origine non mitocondriale, può essere attribuito alla perdita protonica. L'aggiunta dell'uncoupler FCCP permette la determinazione del tasso massimo di consumo di ossigeno, seguita dall'iniezione di antimicina A, un inibitore della respirazione mitocondriale, per misurare le fonti non mitocondriali di consumo di ossigeno. La capacità di riserva indica la quantità di lavoro aggiuntivo che i mitocondri possono svolgere in condizioni di aumento della domanda energetica ed è calcolabile come differenza tra il tasso massimo di respirazione e quello basale, al fine di determinare la capacità di burst ossidativo di monociti e neutrofili.

L'agonista P-M-A-A-P-K-C viene iniettato e l'aumento del tasso di consumo di ossigeno è associato alla produzione di ossidanti da parte della N-A-D-P-H ossidasi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in appena tre ore a partire dal prelievo del sangue, escluso il tempo necessario per il saggio stesso se eseguito correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale mantenere condizioni sterili operando in una cappa a sicurezza biologica e utilizzando tamponi e mezzi sterili a temperatura ambiente. Al termine di questa procedura, possiamo eseguire altri protocolli, come l'analisi mediante fax per determinare la purezza delle cellule, lo stato di attivazione dei leucociti e anche per valutare la bioenergetica cellulare nelle sottopopolazioni di leucociti.

Dopo aver visto questo video, ora dovresti avere un'idea abbastanza chiara su come preparare piastrine, linfociti, monociti e neutrofili, inserirli nel Seahorse e misurare il burst ossidativo e la funzione mitocondriale a partire da questi dati. Successivamente, potrai analizzare le tue popolazioni di pazienti e determinare come la loro bioenergetica stia cambiando in tempo reale. Non dimenticare che lavorare con campioni umani provenienti da pazienti può essere estremamente pericoloso.

Pertanto, è necessario indossare dispositivi di protezione individuale e utilizzare una cappa a sicurezza biologica durante questa procedura.