Bioenergetica e il burst ossidativo: Protocolli per l'isolamento e la valutazione dei leucociti umani e piastrine

Nel seguente protocollo, verrà dimostrata la misurazione dei profili bioenergetici e delle risposte ossidative burst di monociti, linfociti, neutrofili e piastrine del sangue umano. Ciò si ottiene raccogliendo prima il buffy coat e le frazioni plasmatiche ricche di piastrine dal sangue appena prelevato. Come seconda fase, la popolazione eterogenea di globuli bianchi viene separata in strati di cellule mononucleate e polimorfonucleate mediante gradiente di densità.

Successivamente, le popolazioni di neutrofili e linfociti di monociti puri vengono ulteriormente isolate mediante separazione massima e quindi piastrate per l'analisi del flusso extracellulare o XF. In definitiva, la misurazione sensibile e riproducibile della funzione mitocondriale in monociti, linfociti e piastrine, nonché l'esplosione ossidativa dei tassi di consumo di ossigeno di monociti e neutrofili possono essere misurati con la tecnologia XF. Il vantaggio della tecnica che vi mostreremo oggi è che si possono preparare da un piccolo campione di sangue tutte le principali cellule che si trovano nel sangue del paziente.

Si tratta di piastrine e leucociti in forma pura inattivata e ne misurano la funzione mitocondriale. Questo, pensiamo, può quindi riflettere in tempo reale varie malattie e stati all'interno del paziente. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti il metabolismo, come ad esempio qual è il ruolo dello stile di vita, della dieta e dello stress patologico sulla funzione mitocondriale.

Questo protocollo combina molteplici tecnologie per l'isolamento e la determinazione della bioenergetica cellulare in varie popolazioni di leucociti e nelle piastrine. Questa fase del protocollo è molto critica perché il gradiente di densità e la separazione magnetica richiedono un pipettaggio preciso. Inoltre, è necessario essere consapevoli di dove si trovano le popolazioni cellulari durante il frazionamento.

Dimostreremo l'isolamento di cellule del sangue periferico e l'analisi della bioenergetica cellulare sull'analizzatore di flusso extracellulare a 24 pozzetti o sull'XF 24. Tuttavia, questo metodo può essere eseguito anche sull'XF 96, almeno due ore prima di iniziare la procedura. Idratare le sonde a cartuccia del sensore XF con la soluzione di cran XF.

Quindi centrifugare il sangue intero appena prelevato per 15 minuti a 500 volte G e temperatura ambiente in una centrifuga con rotore a secchiello oscillante. Utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere lo strato superiore contenente il plasma ricco di piastrine fino a quando rimane un centimetro di plasma sopra lo strato di buffy coat eritrocitario e mettere da parte il plasma a temperatura ambiente per la successiva lavorazione. Quindi trasferire il Buffy coat in una provetta conica sterile da 50 millilitri e diluire i globuli bianchi a 24 millilitri.

Con l'RPMI basale successivo, aggiungi tre millilitri di bassa densità, il suo opaco 1,077 a ciascuno dei tre tubi conici da 15 millilitri. Quindi posizionare la punta di una pipetta stretta da cinque millilitri sul fondo di ciascuna provetta. A sua volta e lentamente rilasciano tre millilitri di alta densità, il suo opaco 1.119.

A questo punto, utilizzare una pipetta automatica a basso consumo per aggiungere con cura otto millilitri di sangue diluito a ciascun gradiente senza disturbare gli strati. Il colorante blu è stato aggiunto al gradiente a bassa densità per la visualizzazione di tutti i livelli del gradiente. Dopo aver separato le cellule mediante centrifugazione separatamente, raccogliere le cellule mononucleate e polimorfonucleate con pipette di vetro sterili senza disturbare le altre bande cellulari.

Raggruppare le popolazioni di cellule mononucleate e polimorfonucleate di ciascuna provetta in singole provette coniche sterili da 50 millilitri per ogni tipo di cellula e aggiungere quattro volumi di RPMI a entrambe le provette. Dopo aver centrifugato le cellule, trasferire i pellet in un tubo da 1,5 millilitri e risospendere in 80 microlitri di RPMI fresco integrato con BSA. Quindi aggiungere 20 microlitri di anticorpi anti CD 14 e anti CD 15 marcati con biglie magnetiche rispettivamente alle frazioni cellulari mononucleate e polimorfonucleate.

Incubare ogni sospensione cellulare per 15 minuti a quattro gradi Celsius, quindi lavare ogni provetta con un millilitro di terreno R-P-M-I-B-S-A, risospendere i pellet in 500 microlitri di R-P-M-I-B-S-A. Quindi applicare le sospensioni cellulari alle singole colonne LS lavate con R-P-M-I-B-S-A e lavare ciascuna colonna tre volte con tre millilitri di terreno R-P-M-I-B-S-A Raccogliere il flusso di sospensione cellulare e i lavaggi della colonna in provette sterili per isolare i monociti e i neutrofili, rimuovere le colonne dal campo magnetico dopo il lavaggio finale ed eluire le cellule selezionate positivamente in una provetta sterile con cinque millilitri di R-P-M-I-B-S-A. Per isolare i linfociti, pellettare il flusso attraverso la frazione di lavaggio della colonna cellulare, risospendere il pellet cellulare in 80 microlitri di R-P-M-I-B-S-A e incubare le cellule in 20 microlitri di anticorpi CD 61 e CD 2 35 A per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi ripetere la separazione massima come prima, e raccogliere il flusso attraverso contenente i linfociti per isolare le piastrine, centrifugare, il plasma ricco di piastrine riservato, quindi rimuovere il plasma e lavare il pellet cellulare una volta con cinque millilitri di PBS sterile integrato con un microgrammo per millilitro di prostaglandina I due risospendere il pellet piastrinico in un millilitro di prostaglandina PBS fresca I due tampone per placcare i monociti isolati, linfociti, neutrofili e piastrine. Per prima cosa contare le cellule e portarle a un volume appropriato nel terreno di saggio XF per consentire una densità di semina di 2,5 volte 10 fino alla quinta cellula per pozzetto in un volume di 200 microlitri. In una micropiastra per coltura cellulare XF a 24 pozzetti rivestita con cellule T per piastrine, si semina 2,5 volte 10 alle sette cellule per pozzetto in un volume di 200 microlitri.

Dopo aver fatto girare le cellule sulla piastra, portare i volumi finali del pozzetto fino a 660 microlitri con terreno XF e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 30 minuti prima del test XF durante il carico di incubazione, 75 microlitri dei reagenti del saggio nell'ordine indicato nelle porte di iniezione della cartuccia del sensore XF. Se si vogliono ottenere misurazioni del burst ossidativo, il PMA può essere iniettato dopo l'antimicina, quindi dopo il caricamento della porta di iniezione posizionare la cartuccia sull'analizzatore di flusso extracellulare per iniziare il saggio. I profili bioenergetici dei leucociti e delle piastrine possono essere determinati utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare XF del cavalluccio marino, che misura il consumo di ossigeno in tempo reale nelle cellule in modo non invasivo.

Ogni tipo di cellula è placcato sulla micropiastra XF 24 con cinque repliche, come appena dimostrato nella tabella. I valori rappresentativi di burst basale e ossidativo misurati durante il saggio e le concentrazioni proteiche medie per pozzetto sono dimostrati dal tipo di cellula I valori del tasso di consumo di ossigeno sono normalizzati al contenuto proteico totale nei pozzetti corrispondenti ed espressi come p moli al minuto per microgrammo di proteina. Il tasso basale di consumo di ossigeno viene quindi stabilito dalle prime tre misurazioni.

L'oligomicina, un inibitore della mitocondriale A TP sintasi, viene iniettata nel terreno XF per stimare il tasso di consumo di ossigeno accoppiato a una sintesi di TP ed è rappresentata come un TP collegato: il tasso di consumo di ossigeno residuo meno il tasso di consumo di ossigeno non mitocondriale può essere attribuito alla perdita di protoni. L'aggiunta dell'FCCP di disaccoppiamento consente di determinare il tasso massimo di consumo di ossigeno, seguita dall'iniezione di antimicina a e di un inibitore della respirazione mitocondriale per misurare le fonti non mitocondriali di consumo di ossigeno. La capacità di riserva è una misura della quantità di lavoro aggiuntivo che i mitocondri possono svolgere in presenza di una maggiore richiesta di energia e può essere calcolata come la differenza tra la frequenza massima di respirazione e la basale al fine di determinare la capacità di burst ossidativo di monociti e neutrofili.

L'agonista P-M-A-A-P-K-C viene iniettato e l'aumento del tasso di consumo di ossigeno è legato alla produzione di ossidante da parte della N-A-D-P-H ossidasi Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in appena tre ore dopo il prelievo del sangue, escluso il test stesso se viene eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere le condizioni sterili eseguendo ogni passaggio in una cabina di sicurezza biologica e utilizzando tamponi e terreni sterili a temperatura ambiente. Seguendo questa procedura, possiamo eseguire altri protocolli, come l'analisi via fax per determinare la purezza delle cellule, lo stato di attivazione dei leucociti e anche per determinare la bioenergetica cellulare nelle sottopopolazioni di leucociti.

Dopo aver visto questo video, ora dovresti avere un'idea abbastanza chiara su come preparare piastrine, linfociti, monociti e neutrofili e inserirli nel cavalluccio marino e misurare il burst ossidativo e la funzione mitocondriale da questi dati. Quindi puoi analizzare le tue popolazioni di pazienti e determinare come stanno cambiando i loro prodotti bioenergetici in tempo reale. Non dimenticare che lavorare con campioni di pazienti umani può essere estremamente pericoloso.

Pertanto, è necessario indossare dispositivi di protezione individuale e utilizzare una cabina di sicurezza biologica durante questa procedura.