Misurazione longitudinale di matrice extracellulare rigidità in 3D Tumore modelli utilizzando-particelle inseguimento Microrheology

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare i cambiamenti longitudinali nelle proprietà meccaniche della matrice extracellulare in modelli tumorali tridimensionali. Ciò si ottiene raccogliendo prima le cellule tumorali e facendo crescere lo steroide tumorale con un metodo appropriato fino a quando non hanno raggiunto la dimensione desiderata. Il secondo passo consiste nell'incorporare lo steroide tumorale nel collagene o in un'altra matrice extracellulare appropriata.

Successivamente, viene costruita la griglia dei punti di campionamento e viene ripreso un video in ogni punto. Il passaggio finale consiste nell'analizzare i dati video e calcolare e coregistrare le proprietà logiche reali in ogni punto spaziale. In definitiva, questo protocollo utilizza l'analisi delle traiettorie delle sonde traccianti per quantificare longitudinalmente i cambiamenti spaziali nella meccanica della matrice extracellulare in modo non distruttivo.

L'idea è che, combinando le misurazioni basate sull'imaging della radiologia della matrice extracellulare con i modelli tumorali 3D in vitro, questo approccio possa fornire informazioni quantitative sui cambiamenti dipendenti dal tempo nel microambiente meccanico che accompagnano i processi di invasione della crescita tumorale e sulla risposta al trattamento. Il metodo mostrato in questo video adotta un approccio di sovrapposizione aros per generare OID 3D non aderenti dalla linea cellulare di cancro al pancreas stabilita pan one. Per iniziare, mescolare 10 millilitri di acqua per colture cellulari con 0,1 grammi di aros per ottenere una soluzione di aros all'1%.

Riscaldare la soluzione di aros a oltre 70 gradi Celsius prima di Ali. Citando 40 microlitri di soluzione in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora, raccogliere le cellule tumorali tramite tripsina e preparare una sospensione cellulare singola prima di diluire la sospensione cellulare a 1000 cellule per millilitro. Aggiungere 100 microlitri di questa diluizione al pozzetto contenente il letto di aros stagionato.

Posizionare il campione su un agitatore per una notte in un incubatore impostato a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2 dopo l'incubazione. Estrarre il campione dall'agitatore e aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura cellulare, procedere all'incubazione dello steroide risultante fino a raggiungere il diametro desiderato. Ad esempio, dopo nove giorni, una padella, uno steroide avrà un diametro di circa 450 micron.

Per iniziare, preparare una postazione di lavoro all'interno di una cappa a flusso laminare con due flaconi da due millilitri. La prima fiala conterrà lo steroide tumorale e la seconda fiala sarà un controllo senza cellule. Preparare una miscela diluita di sonde traccianti fluorescenti di un diametro di un micron modificate con carbossilato aggiungendo due parti di sonde stock a 25 parti di acqua sterile.

Estrarre una bottiglia di 3,1 milligrammi per millilitro, di collagene bovino dal frigorifero e metterlo sul ghiaccio aliquotare 125 microlitri di collagene, seguito da 50 microlitri di soluzione di sonda tracciante diluita in una fiala a vortice per distribuire brevemente le sonde. Quindi aggiungere 235 microlitri di terreno di coltura cellulare appropriato contenente rosso fenolo per un volume totale di 410 microlitri e agitare brevemente prima di rimuovere 205 microlitri e metterli nella fiala due. Quindi, aggiungere circa due microlitri di idrossido di sodio molare alla fiala.

Uno per riportare brevemente la soluzione a un vortice di pH neutro per mescolare. Quindi rimettere immediatamente sulla griglia del ghiaccio in modo che la miscela non inizi a polimerizzare. Rimuovere delicatamente 40 microlitri di terreno dal pozzetto contenente lo steroide tumorale.

Conservare questi 40 microlitri durante il passaggio successivo. Controlla il pozzo per vedere se lo steroide è stato rimosso nel passaggio precedente. In caso contrario, rimetti i 40 microlitri nel pozzetto e ripeti il passaggio precedente.

Se lo era, aggiungere i 40 microlitri contenenti lo steroide alla fiala. Una fiala da mescolare delicatamente, una prima di trasferire la miscela in porzioni da 60 microlitri in tre pozzetti separati di una piastra da 96 pozzetti, ispezionare ogni pozzetto con un microscopio dopo aver aggiunto la miscela per determinare quale pozzetto contiene lo steroide. Quindi aggiungere circa due microlitri di idrossido di sodio molare e 40 microlitri di terreno di coltura cellulare alla fiala due e vorticare prima di Ali.

Citando 60 microlitri di questa miscela in un pozzetto vuoto nella piastra a 96 pozzetti ed etichettandolo come controllo senza cellule. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per polimerizzare per almeno un'ora per costruire una griglia di punti campione. Innanzitutto, trasferire la piastra del campione dall'incubatore al tavolino del microscopio.

Attendere 10 minuti affinché il campione si equilibri a temperatura ambiente se non è disponibile un tavolino riscaldato. Osservare il campione con lenti dell'obiettivo a bassa potenza per assicurarsi che sia intatto e pronto per l'imaging. Determinare la posizione del tumore all'interno del pozzetto e documentarla con un'immagine a luce trasmessa per la successiva co-registrazione spaziale.

Tipicamente, 20 punti di campionamento in ciascun pozzetto distribuiti in anelli concentrici attorno allo sferoide S produrranno risultati adeguatamente dettagliati. Spostare il tavolino in ogni posizione desiderata e utilizzare il software di interfacciamento del microscopio per registrare le coordinate XNY. Passare il microscopio a una lente dell'obiettivo ad alta potenza e selezionare il cubo del filtro appropriato per la lunghezza d'onda di citazione x delle sonde traccianti.

Utilizzando l'elenco dei punti creati, spostatevi al primo punto della griglia. Regola la messa a fuoco per trovare il fondo del pozzo prima di salire. Per trovare un campo visivo contenente diverse sonde traccianti a fuoco.

Osservare l'istogramma dell'intensità e regolare l'intensità e il tempo di esposizione per ottenere la massima gamma dinamica possibile, assicurandosi che l'immagine non si saturi. Ottenete una sequenza video con una frequenza fotogrammi compresa tra 20 e 30 millisecondi per fotogramma e salvatela con una convenzione di denominazione appropriata. Durante la registrazione, non toccare il microscopio o il tavolo.

Ripetere la registrazione per ogni punto di campionamento nella griglia. Quindi procedi a ripetere il processo per costruire una griglia per ogni pozzetto nell'esperimento e ripeti l'intero processo per ogni volta. Punto per tutta la durata del monitoraggio longitudinale.

Per iniziare l'analisi dei dati. Copia tutti i dati video in una cartella di analisi. Importa i dati delle immagini in MATLAB o in un altro software di analisi.

Calibrare il software analizzando diversi fotogrammi del video per determinare in modo appropriato i parametri di selezione e reiezione per identificare le posizioni centrali della sonda. Quindi utilizzare il software per determinare automaticamente la posizione di ciascuna sonda per tutti i fotogrammi video, quindi collegare queste posizioni in traiettorie. Utilizzare i dati della traiettoria per calcolare lo spostamento quadratico medio o MSD in funzione del tempo di ritardo, assicurandosi di applicare il fattore di calibrazione spaziale appropriato per l'obiettivo specifico o per qualsiasi pixel benning.

Calcolare G Star utilizzando la relazione di Stokes Einstein generalizzata, prendendo in considerazione i limiti di applicabilità della relazione di Stokes Einstein generalizzata per un particolare campione. Ripetere i passaggi dell'analisi per ogni campo visivo dell'esperimento. Coregistrare i dati di posizione con il viscoelastico mod I ad una particolare frequenza di interesse, a seconda del produttore del microscopio utilizzato.

Questo passaggio può essere facilitato da una routine personalizzata, che legge i metadati del microscopio o i dati di posizione possono essere tabulati manualmente. Le sequenze video vengono acquisite in più posizioni spaziali all'interno di un pozzetto rappresentativo contenente un nodulo tumorale 3D e collegate per fornire una mappa microradiologica spaziale del campione quando monitorate longitudinalmente le popolazioni di cellule alla periferia del pan. Uno steroide utilizzato in questo esempio degraderà spontaneamente le fibre di collagene circostanti e invaderà la matrice extracellulare entro pochi giorni.

In questo esempio, la co-registrazione della microologia fornisce una lettura quantitativa dell'evidente invasione nella matrice che si verifica a sinistra, ma non a destra dello steroide. Il monitoraggio longitudinale di queste regioni spaziali disparate mostra un calo della componente reale del complesso modulo di taglio viscoelastico di circa quattro ordini di grandezza in concomitanza con l'invasione. I dati completamente dipendenti dalla frequenza sono mostrati contrastando le proprietà teologiche del materiale nella regione uno e nella regione due al quarto giorno.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che è necessario prestare attenzione per evitare le insidie comuni durante l'analisi delle traiettorie della sonda che portano a conclusioni inappropriate. Incoraggiamo i lettori a fare riferimento alla letteratura PTM qui citata, che affronta considerazioni come la deriva del campione e l'interpretazione dell'eterogeneità. Questa procedura può essere combinata con ulteriori immagini a fluorescenza longitudinale o terminale per rispondere ad altre domande, come ad esempio il modo in cui il rimodellamento meccanico è correlato agli eventi chiave di segnalazione o alla risposta citotossica a un intervento.