Name: Misurazione longitudinale di matrice extracellulare rigidità in 3D Tumore modelli utilizzando-particelle inseguimento Microrheology (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Impara la microrheologia con inseguimento di particelle per analizzare la rigidità della matrice extracellulare in modelli tumorali 3D. Questo metodo non distruttivo consente di studiare le modifiche meccaniche durante la progressione del cancro.

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Ringraziamo la condivisione open-source di MATLAB codice particella di monitoraggio fornito da Maria Kilfoil ( <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ), insieme al codice precedente IDL e ampia documentazione fornita da John C. Crocker e Eric R. settimane. Questo lavoro è stato reso possibile da un finanziamento dal National Cancer Institute (NCI / NIH), K99CA155045 e R00CA155045 (PI: JPC).

1. Spheroids Culturing tumorali <ol><li> Miscelare 10 ml di acqua di grado coltura cellulare con 0,1 g di agarosio per ottenere una soluzione di agarosio all&#39;1%. </li><li> Soluzione di agarosio calore sopra 70 ° C (circa 14 secondi in un forno a microonde standard o mediante una piastra riscaldante) prima aliquotando 40 ml di soluzione di agarosio in un pozzo su una piastra a 96 pozzetti. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C per almeno 1 ora mentre la raccolta delle cellule usando tecniche standard. </li><li> Utilizzare un emocitometro per determinare la concentrazione di cellule in sospensione. </li><li> Diluire sospensione cellulare a 1000 cellule / ml e aggiungere 100 ml di tale diluizione al pozzetto contenente il letto di agarosio guarito. </li><li> Porre il campione in un agitatore durante la notte in un incubatore a 37 ° 5% di CO 2 C e. </li><li> Rimuovere il campione dal shaker e aggiungere 100 ml di coltura cellulare multimediale. </li><li> Incubare sferoidi fino al raggiungimento del diametro desiderato. Ad esempio, dopo 9 giorni, una spheroid saranno circa 450 micron di diametro. Durante questo tempo, mezzi di crescita fresco può essere aggiunto ai pozzetti ma l&#39;aspirazione deve essere evitata poiché questo provocherà rimozione dello sferoide. </li></ol> 2. Preparazione Spheroids tumorali 3D incorporati in ECM <ol><li> Preparare una stazione di lavoro con materiali necessari all&#39;interno di una cappa a flusso laminare. </li><li> Preparare una miscela diluita di 1 micron di diametro sonde traccianti fluorescenti carbossilato modificato con l&#39;aggiunta di sonde 2 parti di riserva (2% solidi) a 25 parti di acqua sterile. </li><li> Rimuovere una bottiglia di 3,1 mg / ml di collagene bovino dal frigorifero e posizionarlo sul ghiaccio. </li><li> Aliquota 125 ml di collagene in un vuoto flaconcino da 2 ml. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione della sonda tracciante diluito al flaconcino contenente il collagene e vortice brevemente per distribuire le sonde. </li><li> Aggiungere 235 ml di appropriati mezzi di coltura cellulare contenente rosso fenolo (che diventa giallo) per un volume totale di 410 ml e vortex brevemente prima di togliere 205 ml (metà del volume totale) e l&#39;immissione in un nuovo flaconcino da 2 ml. Vial 1 conterrà sferoide tumore e Vial 2 sarà un misto di controllo. </li><li> Aggiungi ~ 2 ml di 1 M NaOH al flaconcino 1 per portare nuovamente la soluzione a pH neutro (terreni di coltura contenente rosso fenolo dovrebbe tornare al rosso). Si noti che questo causerà la miscela per iniziare curare se non è tenuta in ghiaccio. Vortex brevemente per mescolare, per poi tornare a cremagliera ghiaccio immediatamente. NOTA: Il sferoide è appena visibile ad occhio nudo, dopo 9 giorni di cultura e la sua rimozione dal letto agarosio è un compito delicato. L&#39;uso di un microscopio dissezione può essere utile per alcuni utenti. Mantenendo l&#39;integrità dello sferoide durante il trasferimento è fondamentale. </li><li> Usando una pipetta a bocca larga, rimuovere delicatamente 40 ml di supporto dal pozzetto contenente il sferoide tumore. Conservare questo 40 microlitri mentre conduceva il passo successivo. </li><li> Controllare il bene per vedere se sferoideè stato rimosso nel passaggio precedente. Se fosse, aggiungere 40 microlitri contenenti sferoide a Fiala 1. Caso contrario, posizionare i 40 microlitri di nuovo nel bene e ripetere il passaggio precedente. </li><li> Mescolare delicatamente Vial 1 (non rischiare vortex, può danneggiare la sferoide) prima di trasferire il composto in 60 porzioni microlitri in tre pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti. Ispezionare ciascun pozzetto con un microscopio dopo l&#39;aggiunta di miscela per determinare quale contiene ben sferoide. </li><li> Aggiungere 2 microlitri ~ 1 M NaOH e 40 ml di coltura cellulare multimediale a fiala 2 e vortex prima aliquotting 60 ml di questa miscela in un pozzo vuoto nella piastra a 96 pozzetti e l&#39;etichettatura come controllo. </li><li> Porre la piastra in un incubatore a 37 ° C per la cura per almeno 1 ora. </li></ol> 3. Costruire Rete di Punti di campionamento e di prendere un video in ogni punto <ol><li> Trasferire la piastra campione dal incubatrice al palco microscopio. Lasciare 10 minuti per il campione EQUILibrate con la temperatura ambiente se una fase riscaldata non è disponibile. </li><li> Osservare il campione con bassi lenti dell&#39;obiettivo alimentati per assicurarsi che sia integro e pronto per l&#39;imaging. Determinare la posizione del tumore all&#39;interno del pozzo. </li><li> Decidere quanti punti di campionamento per prendere. Tipicamente, 20 punti di campionamento in ciascun pozzetto, distribuiti in anelli concentrici intorno alla sferoide produrranno risultati sufficientemente dettagliati. </li><li> Spostare il palco per ciascuna posizione desiderata e utilizzare il microscopio interfacciamento software per registrare le coordinate xey (o le coordinate registrare manualmente se interfacciare il software non è disponibile). </li><li> Passare il microscopio per una lente obiettivo alta potenza (tipicamente 100X), e selezionare il cubo filtro appropriato per la lunghezza d&#39;onda di eccitazione delle sonde traccianti. Utilizzare l&#39;elenco dei punti creati nel passaggio 3.4 per passare al primo punto nella griglia. </li><li> Regolare il fuoco per trovare il fondo del pozzo, poi passare a trovare un campo di vista (FOV) contenente vari trac a fuocoer sonde. </li><li> Osservare l&#39;istogramma intensità e regolare l&#39;intensità di esposizione e il tempo per dare possibile la più ampia gamma dinamica, garantendo nel contempo che l&#39;immagine non diventa satura. </li><li> Ottenere una sequenza video con un frame rate di 20-30 msec per fotogramma (circa 800 fotogrammi o 16-24 sec di lunghezza si raccomanda di fornire statistiche sufficienti per robusto calcolo MSD bilanciato con la necessità di ridurre al minimo il tempo di acquisizione in ogni punto della griglia spaziale) e salvare con una apposita convenzione. Durante la registrazione, non toccare il microscopio o un tavolo. </li><li> Ripetere i passaggi 3,6-3,9 per ogni punto campione nella griglia. </li><li> Ripetere i passaggi 3,3-3,10 per ogni bene per l&#39;esperimento. </li></ol> 4. Analisi Video dati per calcolare le proprietà reologiche in ogni punto del campione <ol><li> Copiare tutti i dati video a una cartella di analisi (possibilmente su un computer diverso). </li><li> Importazione di dati immagine in MATLAB o altri software di analisi. NOTE: Ampia documentazione riguardante la serie di MATLAB particelle routine di rilevamento adottato qui è disponibile a <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil</a> . Si raccomanda l&#39;uso di una funzione telefonica personalizzata per automatizzare l&#39;elaborazione di più file in posizioni diverse. </li><li> Calibrare il software analizzando diversi fotogrammi del video per determinare adeguatamente selezione e rifiuto parametri (dimensioni, passa-banda, ecc) per individuare posizioni centrali della sonda. Sfondo esteso per questi passaggi cruciali è descritto da Crocker e Grier. </li><li> Utilizzare il software per determinare automaticamente ogni posizione della sonda per tutti i fotogrammi e quindi collegare queste posizioni in traiettorie. </li><li> Utilizzare i dati di traiettoria per calcolare lo spostamento quadratico medio (MSD) in funzione del tempo di ritardo, avendo cura di applicare il fattore di calibrazione spaziale appropriata (micron per pixel) per la lente obiettivo specifico, ogni pixel binning, ecc (normalmente effettuatenel meta-dati). </li><li> Calcola G * (utilizzando il generalizzato relazione di Stokes-Einstein presi in considerazione i limiti di applicabilità di GSER per un particolare campione 24,28,43. In alternativa, gli utenti potrebbero voler interpretare le proprietà ECM direttamente da MSD, semplicemente confrontando legge di potenza di scala, plateau valori, indici di eterogeneità o di altri parametri. </li><li> Ripetere i passaggi da 4.2 tramite 4.6 per ogni FOV nell&#39;esperimento. </li><li> Co-registrati i dati di posizione dal punto 3.4 con modulii viscoelastico ad una particolare frequenza di interesse. A seconda del produttore del microscopio utilizzato, questo passo può essere facilitato da una routine personalizzata che legge i metadati microscopio o posizione dati possono essere tabulati manualmente. </li><li> Utilizzare le funzioni di interpolazione 3D per generare una reologia mappa spaziale della ECM. </li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

In questo protocollo si introduce una strategia robusta e ampiamente applicabile per longitudinalmente rilevamento delle modifiche locali in ECM rigidità nei modelli tumorali 3D. Prevediamo che questa metodologia possa essere adottato da biologi cancro e biofisici interessati nel comportamento meccanosensibili implicati nel rimodellamento della matrice durante la crescita del tumore e dei processi di invasione. Quantificazione precisa di matrice cinetica di degradazione possa essere particolarmente utile a coloro che st...

E &#39;chiaro da una crescente evidenza nella letteratura che le cellule tumorali, come con le cellule epiteliali di mammifero non maligne, sono molto sensibili alle proprietà meccaniche e biofisiche della matrice extracellulare circostante (ECM) e altri componenti del microambiente 1-9. Studi meccanicistici eleganti hanno fornito informazioni sul ruolo di rigidità extracellulare come partner segnalazione meccanosensibili complesso che regola il comportamento crescita maligna e la morfogenesi 2,3,10,11. Questo lavoro è stato facilitato in particolare dallo sviluppo del 3D in modelli tumorali in vitro che ripristinano biologicamente architettura dei tessuti rilevante e possono essere coltivate in materiali impalcatura con la meccanica accordabili e ripreso da microscopia ottica 12-19. Tuttavia, l&#39;altro lato di questa finestra mechanoregulatory tra tumore e microambiente, attraverso il quale le cellule tumorali a sua volta modificare la reologia del loro ambiente, rimane alquantopiù difficile da studiare. Ad esempio, durante i processi di invasione, cellule alla periferia di un tumore possono subire la transizione epitelio mesenchimale (EMT) e aumentare l&#39;espressione delle metalloproteasi della matrice (MMPs) che causano degradazione locale di ECM 20-22, che a sua volta influenza il comportamento di crescita di meccanosensibili altre cellule tumorali prossimali. Attraverso una serie di processi biochimici, cellule tumorali continuamente comporre la rigidità locale del loro ambiente su e giù secondo processi differenti in momenti diversi. La metodologia qui descritta è motivata dalla necessità di strumenti analitici che segnalano variazioni locali nella rigidità e la conformità della ECM durante la crescita, che possono essere integrati con i modelli tumorali in 3D e correlati longitudinalmente con i cambiamenti biochimici e fenotipiche senza terminare la cultura. Alla ricerca di una tecnica appropriata per l&#39;attuazione in questo contesto, microrheology particella-tracking (PTM) emerge come un candidato forte.Questo metodo, sperimentato originariamente da Mason e Weitz 23,24, utilizza il movimento delle sonde traccianti incorporati in un fluido complesso per segnalare il modulo complesso dipendente dalla frequenza viscoelastico taglio, G * (ω) su scale micron. Questo approccio generale è stato sviluppato con diverse variazioni adatti per diverse applicazioni in morbidi Materia Condensata, colloidi, biofisica e fisica dei polimeri 25-31. PTM presenta alcuni vantaggi rispetto ad altri metodi, poiché letture di viscoelasticità locale sono ottenute dalla non distruttiva immagini video di sonde traccianti biochimicamente inattivi che sono incorporati al momento della preparazione cultura e rimangono sul posto per periodi prolungati di crescita. Questo è in contrasto con misure standard oro con un taglio oscillante rinfusa reometro, che richiede necessariamente la cessazione della cultura e riporta la reologia macroscopico massa del campione piuttosto che misurazioni di punti all&#39;interno del complesso microenvir tumore 3Dbiente. Infatti numerosi studi hanno dimostrato l&#39;utilità di interpretazione delle misure di movimenti sonda tracciante ao vicino cellule tumorali o non tumorali per misurare deformazioni associati migrazione cellulare 32, stress meccanico indotto da uno sferoide espansione 33, reologia intracellulare 34,35, e per mappare sollecitazioni meccaniche nei tessuti ingegnerizzati 36, e della relazione tra dimensione dei pori e la velocità dell&#39;invasione 37. Altre tecniche adatte per microrheology, quali microscopia a forza atomica (AFM) possono essere realizzate, ma soprattutto per sondare punti alla superficie del campione, oppure possono rappresentare coltura problemi di sterilità che complicano misurazioni longitudinali 38. Qui, descriviamo un protocollo completo che comprende metodi per la crescita di sferoidi tumorali 3D adatti per il trasferimento in ECM con sonde fluorescenti embedded per il video di particelle di tracciamento e di analisi per la mappatura attendibile spazialecambiamenti nella microrheology nel tempo nella cultura. Nel presente di attuazione, modelli tumorali 3D sono coltivate in formato più pozzetti con vista verso l&#39;incorporazione di misure microrheology con altri metodi tradizionali (ad esempio, citotossicità), che questo formato è favorevole al. In questa illustrazione rappresentativo di questa metodologia che coltura in vitro sferoidi 3D in Uso PANC-1 le cellule, una linea cellulare di cancro del pancreas stabilito noto per formare sferoidi 39, ma tutte le misurazioni qui descritti sono largamente applicabile per studiare di tumori solidi utilizzando una varietà di linee cellulari adatto per la cultura 3D. Poiché si basa Imaging-questo metodo intrinsecamente è ideale per la co-registrazione dei dati microrheology ad alta risoluzione con grandi campi a luce trasmessa di vista che segnalano cambiamenti nella crescita delle cellule, la migrazione e fenotipo. L&#39;attuazione del PTM integrato con microscopia ottica trasmessa in questo modo assume un posizionamento riproducibile dei wh palco microscopioich è in genere disponibile sul motorizzati commerciale epifluorescenza widefield microscopi biologici. Il protocollo messo a punto sotto può essere realizzata con qualsiasi fluorescenza automatizzato microscopio biologico ragionevolmente attrezzata. Questo è un metodo ad alta intensità di dati intrinsecamente, che richiede l&#39;acquisizione di gigabyte di dati microscopia video digitale per l&#39;elaborazione offline. Nella seguente protocollo, protocollo 1 riguarda la preparazione iniziale di sferoidi tumorali che viene descritto qui utilizzando overlay su agarosio ma potrebbero essere sostituiti con una varietà di altri metodi come appendere goccia 40, o coltura rotante 41 tecniche. Protocollo 2 descrive il processo di inserimento sferoidi in un&#39;impalcatura di collagene però in alternativa, in vitro tumori 3D in potessero essere coltivate da incapsulamento o incorporamento di cellule risospese in ECM 12,15, piuttosto che singoli sferoidi non aderenti pre-formate. Protocolli successivi descrivono le procedure per OOME OTTENERE misurazioni microrheology risolta in tempo per l&#39;acquisizione e l&#39;elaborazione dei dati di microscopia video, rispettivamente. Il trattamento dei dati è descritta utilizzando MATLAB, facendo uso di routine open source per PTM costruita su algoritmi originariamente descritti da Crocker e Grier 42, che sono anche stati ampiamente sviluppati per piattaforme software differenti (vedi http://www.physics.emory.edu/ ~ settimane / idl /).

<table><tbody><tr><td>Collagene bovino di tipo 1</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td><td>CRL1469</td><td>o altro tipo di cellula appropriato</td></tr><tr><td>Microsfere fluorescenti</td> Life <td>Technologies, Carlsbad, CA</td><td>906906</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences, Bedford, MA</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Bioreagenti, Waltham, MA</td><td>C12H18O9</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Bioreagenti, Waltham, MA</td><td>NC0480985</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di imaging a 96 pozzetti</td><td>Corning Inc., Corning, NY</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone, Waltham, MA</td><td>SH30243.01</td><td>o terreni di coltura cellulare appropriati</td></tr><tr><td>Zeiss AxioObsever Microscopio</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germania</td><td></td><td>include una telecamera ad alta velocità e software di imaging</td></tr><tr><td>Software MATLAB</td><td>The Mathworks, Natick, MA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione longitudinale di matrice extracellulare rigidità in 3d tumore modelli utilizzando-particelle inseguimento microrheology

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Il microambiente meccanico ha dimostrato di agire come un regolatore cruciale del comportamento di crescita tumorale e di segnalazione, che è a sua rinnovato e modificato come parte di una serie di complesse interazioni bidirezionale mechanosensitive. Mentre lo sviluppo di biologicamente rilevanti modelli tumorali 3D hanno facilitato studi meccanicistici sull&#39;impatto della reologia matrice sulla crescita del tumore, il problema inverso dei cambiamenti di mappatura dell&#39;ambiente meccanica indotta da tumori rimane difficile. Qui, descriviamo l&#39;attuazione di particella inseguimento microrheology (PTM) in combinazione con i modelli 3D di cancro pancreatico come parte di un approccio efficaci e validi per monitorare longitudinalmente cambiamenti fisici nel microambiente tumorale, in situ. La metodologia qui descritta integra un sistema di preparazione di modelli in vitro 3D incorporato in un modello di matrice extracellulare (ECM) scaffold di collagene di tipo I con sonde fluorescente distribuiti uniformemente per Po-zione e tempo-dipendenti misurazioni microrheology in tutto il campione. tumori in vitro sono placcati e sondate in condizioni parallele utilizzando lastrine pozzetti. Basandosi su metodi stabiliti, i video dei movimenti della sonda traccianti vengono trasformati tramite il Relation Generalized Stokes Einstein (GSER) per segnalare il complesso dipendente dalla frequenza viscoelastica modulo di taglio, G * (ω). Poiché questo approccio è l&#39;imaging-based, caratterizzazione meccanica è anche mappato su grandi campi spazio-luce trasmessa per segnalare contemporaneamente i cambiamenti qualitativi in ​​termini di dimensioni e fenotipo tumorale 3D. Risultati rappresentativi mostrano contrastanti risposta meccanica in sottoregioni associati localizzata degradazione della matrice invasione indotta e calibrazione del sistema, dati di convalida sono presentati. Esiti indesiderati da errori sperimentali comuni e la risoluzione dei problemi di questi problemi sono anche presentati. Il formato da 96 pozzetti placcatura cultura 3D realizzato in questo protocollo è conducive alla correlazione delle misure microrheology con test di screening terapeutici o imaging molecolare per acquisire nuove intuizioni impatto dei trattamenti o stimoli biochimici sul microambiente meccanico.

Per verificare la validità di G * (ω) misurazioni in posizioni localizzate all&#39;interno di un complesso microambiente modello di tumore, sono stati condotti due esperimenti di validazione iniziali. In primo luogo, abbiamo cercato di validare le nostre misure contro il &quot;gold standard&quot; della massa oscillante taglio reometria. Abbiamo preparato campioni identici di matrice di collagene (senza cellule) ad una concentrazione di 1,0 mg / ml di collagene. Questi campioni sono stati sondati con un reometro...

Microrheology-particella di monitoraggio può essere utilizzato per non distruttivo quantificare e spazialmente mappare i cambiamenti nella matrice extracellulare proprietà meccaniche in modelli tumorali 3D.

Misurazione longitudinale di matrice extracellulare rigidità in 3D Tumore modelli utilizzando-particelle inseguimento Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le variazioni longitudinali delle proprietà meccaniche della matrice extracellulare in modelli tridimensionali di cancro. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo le cellule tumorali e coltivando lo stereotipo tumorale mediante un metodo appropriato finché non raggiunge la dimensione desiderata. Il secondo passaggio consiste nell'includere lo stereotipo tumorale nel collagene o in un'altra matrice extracellulare appropriata.Successivamente, viene costruita la griglia di punti campione e viene acquisito un video in ciascun punto. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare i dati video e nel calcolare e coregistrare le proprietà logiche reali in ogni punto spaziale. In definitiva, questo protocollo utilizza l'analisi delle traiettorie delle sonde traccianti per quantificare longitudinalmente le variazioni spaziali della meccanica della matrice extracellulare in modo non distruttivo.L'idea è che, combinando misurazioni basate su imaging del radiologia della matrice extracellulare con modelli tridimensionali di tumore in vitro che ripristinano le interazioni con la matrice extracellulare, questo approccio possa fornire informazioni quantitative sui cambiamenti dipendenti dal tempo nel microambiente meccanico associati ai processi di crescita e invasione tumorale e alla risposta al trattamento. Il metodo mostrato in questo video adotta un approccio di sovrapposizione di aros per generare OID tridimensionali non aderenti dalla linea cellulare di cancro al pancreas ormai consolidata pan one. Per iniziare, mescolare 10 millilitri di acqua per colture cellulari con 0,1 grammi di aros per ottenere una soluzione di aros al 1%.Riscaldare la soluzione di aros a oltre 70 gradi Celsius prima dell'aliquote. Distribuire 40 microlitri della soluzione in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora; raccogliere le cellule tumorali mediante tripsina e preparare una sospensione di cellule singole, quindi diluire la sospensione cellulare a 1000 cellule per millilitro. Aggiungere 100 microlitri di questa diluizione nel pozzetto contenente il letto di aros polimerizzato.Posizionare il campione su un agitatore durante la notte in un incubatore impostato a 37 gradi Celsius e 5%CO2 dopo l'incubazione. Rimuovere il campione dall'agitatore e aggiungere 100 microlitri di mezzo di coltura cellulare, quindi procedere all'incubazione del corticosteroide risultante fino al raggiungimento del diametro desiderato. Ad esempio, dopo nove giorni, un singolo corticosteroide avrà un diametro di circa 450 micron.Per iniziare, preparare una postazione di lavoro all'interno di una cappa a flusso laminare con due vial da due millilitri. Il vial uno conterrà lo steroide tumorale e il vial due sarà un controllo privo di cellule. Preparare una miscela diluita di sonde traccianti fluorescenti modificate con carbossilato e di diametro di un micron aggiungendo due parti di sonda in soluzione madre a 25 parti di acqua sterile.Rimuovere una bottiglia di collagene bovino a 3,1 milligrammi per millilitro dal frigorifero e posizionarla sul ghiaccio. Aliquotare 125 microlitri di collagene, seguiti da 50 microlitri di soluzione diluita del sonda tracciante, nel vial uno; vortexare brevemente per distribuire le sonde. Aggiungere quindi 235 microlitri di idoneo mezzo di coltura cellulare contenente rosso fenolo, per un volume totale di 410 microlitri, e vortexare brevemente prima di prelevare 205 microlitri e trasferirli nel vial due. Successivamente, aggiungere circa due microlitri di idrossido di sodio uno molare al vial.Aggiungere per riportare la soluzione a pH neutro, vorticare brevemente per mescolare. Quindi riporre immediatamente sul rack di ghiaccio in modo che la miscela non inizi a polimerizzare. Rimuovere delicatamente 40 microlitri di mezzo dal pozzetto contenente lo stereotipo del tumore.Conservare questi 40 microlitri durante l'esecuzione del passaggio successivo. Controllare la pozzetta per verificare se lo steroide è stato rimosso nel passaggio precedente. In caso contrario, reinserire i 40 microlitri nella pozzetta e ripetere il passaggio precedente.Se così fosse, aggiungere i 40 microlitri contenenti lo steroide al vial. Agitare delicatamente il vial uno prima di trasferire la miscela in porzioni di 60 microlitri in tre pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti; ispezionare ogni pozzetto al microscopio dopo aver aggiunto la miscela per determinare in quale pozzetto è presente lo steroide. Quindi aggiungere circa due microlitri di idrossido di sodio uno molare e 40 microlitri di mezzo di coltura cellulare al vial due ed eseguire un vortex prima di Ali.Aliquotare 60 microlitri di questa miscela in un pozzetto vuoto della piastra a 96 pozzetti e etichettarlo come controllo senza cellule. Posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per almeno un'ora per consentire la formazione di una griglia di punti campione. In primo luogo, trasferire la piastra dei campioni dall'incubatore al palchetto del microscopio.Attendere 10 minuti affinché il campione raggiunga l'equilibrio alla temperatura ambiente, se non è disponibile un palco riscaldato. Osservare il campione utilizzando obiettivi a basso ingrandimento per accertarsi che sia integro e pronto per l'acquisizione delle immagini. Determinare la posizione del tumore all'interno della pozzetta e documentarla mediante un'immagine in luce trasmessa per una successiva co-registrazione spaziale.Tipicamente, 20 punti campione in ciascun pozzetto, distribuiti in anelli concentrici attorno allo sferoide S, produrranno risultati sufficientemente dettagliati. Spostare il palchetto in ciascuna posizione desiderata e utilizzare il software di interfacciamento del microscopio per registrare le coordinate XNY. Passare al microscopio un obiettivo ad alta potenza e selezionare il cubetto filtro appropriato per la lunghezza d'onda di eccitazione delle sonde traccianti.Utilizzando l'elenco dei punti creati, spostarsi sul primo punto della griglia. Regolare la messa a fuoco per individuare il fondo della pozzetta prima di spostarsi verso l'alto, al fine di trovare un campo visivo contenente diversi traccianti a fuoco.Osservare l'istogramma dell'intensità e regolare l'intensità di esposizione e il tempo in modo da ottenere la massima gamma dinamica possibile, assicurandosi che l'immagine non diventi saturata. Acquisire una sequenza video a una velocità di acquisizione di 20-30 millisecondi per fotogramma e salvare utilizzando una convenzione di denominazione appropriata. Durante la registrazione, non toccare il microscopio né il tavolo.Ripetere la registrazione per ciascun punto campione della griglia. Procedere quindi a ripetere il processo per costruire una griglia per ciascun pozzetto dell'esperimento e ripetere l'intero processo per ogni punto temporale durante il monitoraggio longitudinale.Per iniziare l'analisi dei dati, copiare tutti i dati video in una cartella di analisi. Importare i dati delle immagini in MATLAB o in un altro software di analisi.Calibrare il software analizzando diverse immagini del video per determinare in modo appropriato i parametri di selezione e di esclusione per l'identificazione delle posizioni centrali della sonda. Quindi utilizzare il software per determinare automaticamente la posizione di ciascuna sonda in tutte le immagini del video e collegare successivamente queste posizioni in traiettorie. Utilizzare i dati delle traiettorie per calcolare lo spostamento quadratico medio o MSD in funzione del tempo di ritardo, assicurandosi di applicare il fattore di calibrazione spaziale appropriato per l'obiettivo specifico o per qualsiasi binning dei pixel.Calcola G Star utilizzando la relazione generalizzata di Stokes-Einstein, tenendo conto dei limiti di applicabilità della relazione generalizzata di Stokes-Einstein per un campione specifico. Ripeti i passaggi di analisi per ogni campo visivo dell'esperimento. Esegui la coregistrazione dei dati di posizione con il modulo viscoelastico I a una particolare frequenza di interesse, in base al produttore del microscopio utilizzato.Questo passaggio può essere facilitato da una procedura personalizzata, che legge i metadati del microscopio o i dati di posizione possono essere tabulati manualmente. Le sequenze video vengono acquisite in più posizioni spaziali all'interno di un pozzetto rappresentativo contenente un nodulo tumorale tridimensionale e collegate per fornire una mappa micro-radiologica spaziale del campione quando vengono monitorate longitudinalmente popolazioni cellulari alla periferia della piastra. Uno dei steroidi utilizzati in questo esempio degraderà spontaneamente le fibre di collagene circostanti e invaderà la matrice extracellulare entro pochi giorni.In questo esempio, la co-registrazione di micro ologia fornisce un'indicazione quantitativa dell'evidente invasione nella matrice che si verifica a sinistra, ma non a destra dello steroide. Il monitoraggio longitudinale di queste regioni spaziali distinte mostra una diminuzione della componente reale del modulo complesso di taglio viscoelastico di circa quattro ordini di grandezza, contemporanea all'invading. Vengono mostrati dati completi in funzione della frequenza che confrontano le proprietà reologiche del materiale nella regione uno e nella regione due al quarto giorno.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che è necessario prestare attenzione per evitare errori comuni durante l'analisi delle traiettorie delle sonde, che potrebbero portare a conclusioni inappropriate. Invitiamo i lettori a consultare la letteratura sui PTM citata in questo articolo, che affronta aspetti come la deriva del campione e l'interpretazione dell'eterogeneità. Questa procedura può essere combinata con ulteriori analisi fluorescenti longitudinali o terminali per rispondere ad altre domande, ad esempio in che modo il rimodellamento meccanico si correla con eventi chiave di segnalazione o con la risposta citotossica a un intervento.

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Bioingegneria

La rigidità della matrice extracellulare influenza fortemente i comportamenti multipli di cellule aderenti. Matrice di rigidezza varia spazialmente in tutto un tessuto, e subisce modifiche nelle condizioni patologiche diverse. Qui sviluppare metodi per la caratterizzazione variazioni spaziali della rigidità nei tessuti del mouse normale e fibrotica del polmone mediante microscopia a forza atomica micropenetrazione.

Micro-Caratterizzazione meccanica del tessuto polmonare usando la microscopia a forza atomica

Questo protocollo descrive una tecnica per monitorare i cambiamenti di rigidità della matrice extracellulare utilizzando la microreologia a tracciamento delle particelle (PTM). Questo viene fatto coltivando sferoidi tumorali pancreatici 3D in ECM con sonde fluorescenti incorporate per il tracciamento e l'analisi delle particelle video.

Monitoraggio del microambiente tumorale basato su PTM: un metodo per monitorare i cambiamenti nella rigidità della ECM utilizzando gli sferoidi tumorali

Questo video mostra la microscopia time-lapse quantitativa per valutare la disseminazione di Listeria monocytogenes dipendente dalla rigidità della matrice extracellulare attraverso le cellule endoteliali. Un idrogel più morbido facilita una più rapida diffusione batterica attraverso le cellule endoteliali rispetto alle controparti più rigide, evidenziando l'influenza della rigidità della matrice sulla disseminazione batterica.

Microscopia quantitativa time-lapse per la valutazione della disseminazione batterica dipendente dalla rigidità della matrice extracellulare

Questo articolo presenta un metodo per etichettare fluorescently collagene che può essere ulteriormente utilizzato sia per correzione e di imaging vivo di colture cellulari 3D. Forniamo anche un protocollo ottimizzato per visualizzare endogene proteine ​​del citoscheletro delle cellule coltivate in ambienti 3D.

Rivelare l&#39;organizzazione del citoscheletro delle cellule tumorali invasive in 3D

La matrice extracellulare subisce sostanziale rimodellamento durante la guarigione delle ferite, l'infiammazione e tumorigenesi. Vi presentiamo un approccio immunofluorescenza intravitale romanzo per visualizzare le dinamiche di fibrillare come pure componenti della matrice maglia-come con alta risoluzione spaziale e temporale con epifluorescenza o microscopia a due fotoni.

A lungo termine intravitale immunofluorescenza Imaging di tessuto componenti della matrice con Epifluorescenza e due fotoni Microscopia

Rigidità meccanica nel microambiente tumorale gioca un ruolo cruciale nel guidare il comportamento maligno aumentando l'attività Invadopodi e actomiosina contrattilità. Utilizzando gel di poliacrilammide (PaaS), Invadopodi e forza di trazione test possono essere utilizzati per studiare le proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali in risposta alla matrice rigidità.

Gel di poliacrilammide per Invadopodi e trazione Forza saggi sulle cellule tumorali

La microreologia di tracciamento delle particelle studia la viscoelasticità dei materiali. Qui, la tecnica viene utilizzata per determinare la viscoelasticità, la conformità allo scorrimento e i ruoli di reticolazione efficace di diversi componenti della matrice di un biofilm batterico. La matrice è costituita da sostanze polimeriche secrete dai batteri e i suoi componenti determinano la struttura del biofilm e le proprietà meccaniche.

In Situ mappatura delle proprietà meccaniche del biofilm da-Particle tracciamento Microrheology

Qui spieghiamo un protocollo per modellare il microambiente biofisico dove reticolazione e una maggiore rigidità della membrana basale (BM) indotta da prodotti finali della glicazione avanzata (AGE) ha rilevanza patologica.

Come studiare membrana basale Rigidità come biofisica trigger nel cancro alla prostata e altre patologie legate all&#39;età o malattie metaboliche

Abbiamo sviluppato un test multi-pozzetto formato poliacrilammide per sondare l'effetto di rigidità di matrice extracellulare sull'infezione batterica delle cellule aderenti. Questo test è compatibile con citometria a flusso, immunostaining e microscopia di forza di trazione, permettendo per la misurazione quantitativa delle interazioni biomeccaniche tra cellule, loro matrice extracellulare e batteri patogeni.

Un'analisi di poliacrilammide-basata di formato multi-pozzetto per studiare l'effetto della matrice extracellulare rigidità sull'infezione batterica delle cellule aderenti

Tomografia a coerenza ottica (OCT), una tecnologia di imaging tridimensionale, è stata utilizzata per monitorare e caratterizzare la cinetica di crescita di sferoidi multicellulari del tumore. Precisa quantificazione volumetrica di sferoidi tumore usando un voxel contando approccio e rilevamento di tessuto morto privo di etichetta in sferoidi basato sul contrasto intrinseco attenuazione ottica, sono stati dimostrati.

Longitudinale morfologiche e fisiologiche monitoraggio di sferoidi tridimensionale del tumore usando la tomografia a coerenza ottica

Qui, presentiamo un protocollo basato sulla meccanica per interrompere la giunzione gap connexin 43 e misurare l'impatto successivo che questo ha sulla biomeccanica endoteliale attraverso l'osservazione di trazioni e sollecitazioni intercellulari.

Biomeccanica edonteliale perturbatrice tramite Connexin 43 Disgregazione strutturale

Impara la microrheologia con inseguimento di particelle per analizzare la rigidità della matrice extracellulare in modelli tumorali 3D. Questo metodo non distruttivo consente di studiare le modifiche meccaniche durante la progressione del cancro.

Misurazione longitudinale di matrice extracellulare rigidità in 3D Tumore modelli utilizzando-particelle inseguimento Microrheology (Video) | JoVE Journal

Misurazione longitudinale di matrice extracellulare rigidità in 3D Tumore modelli utilizzando-particelle inseguimento Microrheology

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