Name: Valutare prestazioni funzionali nel Mdx Mouse Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-27T21:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Impara a valutare la funzionalità muscolare nel modello murino Mdx per disturbi neuromuscolari. Questi test non invasivi aiutano i ricercatori a studiare l'effetto di composti terapeutici sulle prestazioni muscolari.

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Vorremmo ringraziare Margriet Hulsker per la sua assistenza per la ripresa e aiutare a ottenere immagini di topi e dei revisori per i loro commenti molto costruttivi. Questo lavoro è stato sostenuto da ZonMw, TREAT-NMD (numero di contratto LSHM series-CT-2006-036825) e il Parent Project Duchenne.

Gli esperimenti qui descritti sono stati approvati dal comitato etico degli animali (DEC) del Leiden University Medical Center (LUMC). I topi sono stati allevati dalla struttura animale della LUMC e tenuti in gabbie a ventilazione individuale con 12 cicli Dark Light hr. Avevano ad libitum accesso ad acqua e cibo standard. Quando si esegue uno dei test funzionali di seguito descritte, le condizioni sperimentali devono essere rigorosamente controllato per ridurre le variazioni. Preferibilmente, età e sesso topi corrispondenti devono essere utilizzati, come le prestazioni differisce tra età e generi. I topi che appartengono alla stessa cucciolata dovrebbero essere randomizzati sui gruppi sperimentali. Gli animali devono essere testati dallo stesso operatore, che è cieco ai gruppi sperimentali. Le prove devono essere eseguite alla stessa ora del giorno e della settimana, stessa stanza per pareggiare gli odori, rumori, ecc 14 grandi variazioni tra i singoli topi e punti di tempo può essere osservato per tuttiprove funzionali, quindi / dovrebbero essere usati gruppo sperimentale 6-8 topi. Risultati delle prove funzionali può anche variare ampiamente tra i diversi ceppi di tipo selvaggio inbred. Pertanto, topi wild type sperimentali e di controllo devono sempre sono corrispondenti sfondi (in caso di topi mdx utilizzare il C57BL/10ScSnJ ceppo selvatico). Tutti i dati qui descritti sono stati ottenuti con il C57BL/10ScSnJ ceppo selvatico, che ci riferiamo tipo selvatico da qui in avanti. I test qui descritti possono essere utilizzati longitudinalmente da almeno 1-19 mesi di età nei topi mdx tipo e selvatici. Le prove non devono essere ripetuti più di una volta alla settimana per evitare che i topi da perdere interesse e la disponibilità a eseguire l&#39;operazione. 1. Forelimb Grip Forza di prova Utilizzare il test forelimb forza di presa per misurare la forza delle arti anteriori. Il test si basa sulla tendenza di un mouse per afferrare istintivamente una griglia volta sospeso per la coda 15, e adapted da <a href="http://www.treat-nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/dmd_m.2.2_001.pdf" target="_blank">DMD_M2.2.001.pdf</a> . <ol><li> Apparecchiatura costituita: Attaccare una griglia ad un trasduttore di forza, che misura la forza massima esercitata dal mouse sulla griglia durante la trazione. Verificare che l&#39;impostazione sia in modalità tensione di picco (T-PK) per tirare. Le unità di forza possono essere regolate sia in once-di-forza, grammi-di-forza, chili-di-force, kg-di-forza, o Newton. Nota: Noi preferiamo lavorare con grammi come unità di valori. Più contatori sono disponibili in commercio, ma solo trasduttori assiali danno risultati affidabili come tipo di leva trasduttori di forza sono influenzati negativamente dalle leggi fisiche dell&#39;effetto leva. O una griglia nonflexible o triangolo possono essere utilizzati con bar che sono 1-2 mm di diametro. </li><li> Prima della prova, valutare il peso corporeo del topo, per consentire la normalizzazione per peso corporeo. </li><li> Utilizzare grammi come unità di valori. Resettare il contatore all&#39;inizio di ogni recording. </li><li> Rimuovere il mouse dalla gabbia afferrando la coda e si muove orizzontalmente verso la griglia. </li><li> Verificare che il mouse afferra la griglia saldamente con entrambe le zampe anteriori. </li><li> Estrarre il mouse dall&#39;immagine griglia in modo che la sua portata è rotto, la massima forza applicata alla griglia viene visualizzata sul display del trasduttore, che può essere manualmente o automaticamente registrato. </li><li> Prendere tiri in considerazione solo in cui il mouse mostra resistenza allo sperimentatore. Respingere misure in cui una sola zampa, o quelle posteriori sono stati usati e in cui il mouse trasformato durante la trazione. </li><li> Sia il mouse tirare la griglia tre volte di seguito e poi tornare nella gabbia per un periodo di riposo di almeno un minuto Nota:. Tra serie di tira un periodo di riposo è necessario per il mouse per recuperare ed evitare la formazione di abitudini. </li><li> Poi lasciare il mouse eseguire quattro serie di tiri, ciascuno seguito da un breve periodo di riposo. In questo modo il mouse ha tirato un totale di 15x (3 tiri x 5 = 15 volte tira). </li><li> Determinare la forza massima aderenza e per normalizzare il peso corporeo prendendo la media dei tre valori più alti dei 15 valori raccolti. </li><li> Facoltativo: Determinare fatica calcolando il decremento tra la media dei primi due e gli ultimi due serie di tira 1 +2 +3 = A, 4 +5 +6 = B, 10 +11 +12 = C e 13 +14 + 15 = D. La formula: (C + D) / (A + B) dà un valore di 1 per i topi che non sono affaticato. Questo può essere espresso in percentuale in modo che un mouse senza fatica ha un valore di 0% e un mouse che arti anteriori sono completamente affaticato ha un valore di 100%. </li></ol> 2. Test Hanging Con i test pensili, equilibrio, coordinazione e condizione muscolare può essere valutata. Questi test si basano sulla conoscenza che i topi sono desiderosi di restare appeso a un filo o una griglia fino ad esaurimento 16. Ci sono due test pensili distintive che all&#39;inizio della prova siasolo i due arti anteriori o quattro arti sono utilizzati, usando rispettivamente un filo o griglia. La prova appeso con il filo e la griglia sono il metodo di tempo sospeso più lungo adattato da <a href="http://www.treat-nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.2.1.004.pdf" target="_blank">DMD_M.2.1.004.pdf</a> e <a href="http://www.treat-nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.2.1.005.pdf" target="_blank">DMD_M.2.1.005.pdf</a> rispettivamente. Un limite appeso fisso viene utilizzato di 600 sec. La maggior parte dei topi wild type può appendere per 600 secondi, mentre i topi distrofici non può. Per ridurre il trascorrere del tempo l&#39;esecuzione di questa prova, un tempo massimo di impiccagione è stato messo in atto. I topi che cadono fuori il filo o la griglia prima di allora sono date fino a due tentativi. Questo viene fatto per riassicurare che i topi sono davvero in grado di appendere e non cadono a causa di goffaggine. <ol><li> Prova pensile con due arti <ol><li> Apparecchiatura impostare: Strettamente garantire un panno di metallo di spessore traino 2 mm a uno scaffale con del nastro adesivo e mantenere il gancio circa il 370; cm sopra uno strato di assestamento. Nota: in alternativa, potrebbero essere utilizzati a 55 cm di larghezza mm di filo metallico di spessore 2 che è strettamente protetta tra due tribune verticali. La distanza di 37 cm è sufficiente a incoraggiare i topi a rimanere appeso, ma anche sufficientemente bassa per evitare che i topi da lesioni in caso di caduta verso il basso. Il filo non deve vibrare o spostare durante la prova in quanto ciò potrebbe interferire con le prestazioni del mouse. </li><li> Maneggiare il mouse con la coda e portarlo vicino al filo. </li><li> Sia il mouse afferrare il filo con solo le due zampe anteriori, e abbassare le zampe posteriori in modo tale che il mouse si blocca solo con le due zampe anteriori sul filo (Figura 2B). </li><li> Direttamente avviare il timer quando il mouse viene rilasciato. Dopo il rilascio, i topi forti cercano di catturare il filo con tutti i quattro arti e la coda, che è consentito (Figura 2C). </li><li> Quando un mouse mostra un comportamento improprio (come in equilibrio su o deliberatamente salta fuori il filo come shriscatto a figure 2D e 2E), affrontare direttamente questo sostituendo il mouse sul filo senza fermare il timer. </li><li> Quando un topo cade il filo, fermare il timer e registrare il tempo appeso. </li><li> Quando i topi sono in grado di appendere per 600 sec, li togliere il filo e restituirli alla gabbia. I topi che cadono prima di questo limite sono dati un massimo di altri due tentativi. </li><li> Registrare il tempo massimo di sospensione (cioè la più lunga delle prove) e di utilizzare per ulteriori analisi. </li></ol></li><li> Prova attaccatura con quattro arti <ol><li> Apparecchiatura istituito: Utilizzare una mano fatta quadrato o il coperchio di una grande gabbia per un ratto o coniglio per questo test. Posizionare la griglia 25 cm sopra biancheria morbida per evitare i topi da sé danneggiare upon cadere, ma anche per scoraggiare topi saltare intenzionalmente fuori della griglia. Fissare saldamente la griglia in modo che lo sperimentatore non deve tenere manualmente la rete durante l&#39;esperimento come questi movimenti potrebbero interfere con le prestazioni del mouse. </li><li> Posizionare il mouse sulla griglia in modo che afferra con le sue quattro zampe. </li><li> Invertire la griglia in modo che il mouse è appesa e direttamente avviare il timer. </li><li> La sessione di test termina per i topi che sono in grado di appendere per una durata di 600 sec. Dare topi che cadono fuori dalla griglia prima di un massimo di altri due tentativi. </li><li> Utilizzare il tempo massimo di sospensione (ie. La più lunga delle prove) per ulteriori analisi. </li></ol></li></ol> 3. Gara podistica rotarod Con la forza muscolare prova rotarod, coordinazione, equilibrio, e la condizione può essere determinato 17. <ol><li> Apparecchiatura set up: Per questo test, i topi devono correre su un tubo rotante. Assicurarsi che la velocità di regime è fissato a 5 giri al minuto (rpm), e che la velocità aumenta 5-45 rpm nei primi 15 sec all&#39;avvio. Dopo questo deve mantenere la sua velocità. </li><li> Posizionare il mouse sul tubo del rotarodquando ruota a bassa velocità costante di 5 rpm. Cinque topi possono essere testati contemporaneamente. </li><li> Inizia la corsa una volta che tutti i topi sono posizionati. Entro i primi 15 sec la velocità del tubo accelera 5-45 rpm dopo che mantiene tale velocità. </li><li> Monitorare la corsa. Il tempo di esecuzione è continuamente registrata dal software. Tempo di esecuzione si arresta automaticamente quando il mouse si stacca il tubo come questo attiva la barra del tempo posizionato sotto il tubo. Riposizionare topi che girano attorno fronte nella direzione opposta del tubo durante l&#39;esecuzione senza fermare il tubo di ruotare. </li><li> Terminare la sessione di test per i topi che sono in grado di correre per una durata di 500 sec. Dare topi un massimo di altri due tentativi, permettendo loro di migliorare il loro tempo di esecuzione, quando cadono in precedenza. </li><li> Utilizzare il tempo massimo di funzionamento (ossia la più lunga delle prove) per ulteriori analisi. </li></ol> 4. Esercizio Treadmill Iltapis roulant può essere utilizzato in tre modi come strumento nella ricerca clinica pre. In primo luogo, costretto tapis roulant in esecuzione può essere utilizzato per aggravare la patologia della malattia, come descritto in questo protocollo (vedi anche: <a href="http://www.treat-nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.2.1.001.pdf" target="_blank">DMD_M2.1.001.pdf</a> ). In secondo luogo, la capacità di funzionamento massima di topi e gli effetti dei trattamenti su questo può essere valutata (Vedere per il metodo per consentire topi funzionano fino all&#39;esaurimento <a href="http://www.treat-nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.2.1.003.pdf">DMD_M.2.1.003.pdf</a> ). Infine, tapis roulant in esecuzione può essere utilizzato prima per un altro test funzionale di esaurire il mouse in modo che si comporta meno bene nella seconda prova 13. Ciò avviene esercitando topi due o tre volte alla settimana come descritto di seguito, direttamente seguito da una delle prove funzionali descritte protocollo 1-3. <ol><li> Apparecchiatura istituito: Ci sono diversi tapis roulant disponibili in commercio su cui molti topi possono run simultaneamente e per i quali l&#39;elevazione, la durata e la velocità può essere regolata. Alcuni tapis roulant sono dotati di una griglia per fornire shock a bassa intensità per incoraggiare i topi a correre. Tuttavia, i topi mdx sono sensibili allo stress e può essere facilmente motivati ​​in modo più amichevole da una leggera spinta con la mano nella direzione di marcia. Pertanto, è fortemente incoraggiato NON utilizzare la griglia shock. Generalmente, la stimolazione con la mano è necessaria solo durante la prima sessione in esecuzione. </li><li> Posizionare il mouse sul tapis roulant orizzontale. </li><li> Avviare il tapis roulant ad una velocità di marcia di 12 m / min. Velocità inferiori (8 m / min) devono essere utilizzati in topi (&gt; 15 mesi), il cui velocità più elevate facilmente portare ad esaurimento. </li><li> Durante la prima sessione, incoraggiare topi per eseguire spingendo delicatamente quando sono vicino alla fine del nastro. </li><li> Quando i topi hanno eseguito per una durata di 30 minuti, metterli di nuovo nella loro gabbia. </li><li> Ripetere questa operazione due volte a settimana, ad esempio per 12 settimane. </li&gt; <li> Consenti periodi di riposo quando necessario. Per esempio, alcuni topi mdx devono smettere di correre e dovrebbe essere consentito di riposare per un paio di minuti. Se questo accade, spegnere la cinghia, dare a tutti i topi un periodo di riposo di due minuti, girare la cintura per due minuti a 4 m / min. Dopo questo, aumentare la velocità di 12 m / min e permettere ai topi per finire il protocollo. È importante che tutti i topi completare l&#39;intero protocollo esecuzione. Nota: In caso di topi mdx hanno bisogno di periodi di riposo, si consideri un warm up prima che il protocollo di esercizio 30 min. Questa sessione scaldare costituito da: un periodo di acclimatazione 2 min ad una velocità di 4 m / min, seguito immediatamente da un 8 min riscaldamento a 8 m / min. Nelle nostre mani 4-16 settimane topi mdx femminili sono in grado di completare il protocollo di esercizio 30 min senza riposo. Altri hanno riferito che in età abbinato maschile topi mdx il 45% dei topi hanno bisogno di periodi di riposo per terminare l&#39;esercizio. Il protocollo di warm up a ridurres la quantità di fermate 12. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I test funzionali presentati qui sono riproducibili, facili da eseguire e applicabile al wild type e topi distrofici indipendentemente dalla loro età. I test forniscono strumenti utili per la validità clinicamente valutare la funzione muscolare, la forza, la condizione e il coordinamento. Quando si testano gli effetti di un composto sulla storia naturale della malattia, i test non invasivi descritte qui (forza di presa forelimb, entrambe le prove pensili e il test rotarod) può essere ben combinati in un regime di prova ...

Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è il disturbo neuromuscolare più comune che colpisce 1/5.000 neonati maschi. Questa malattia atrofia muscolare grave e progressiva è causata da mutazioni nel gene DMD che interrompono la fase di lettura aperta e impediscono la sintesi della proteina distrofina funzionale. Le fibre muscolari prive di distrofina sono vulnerabili ad esercitare danno indotto. Una volta esaurito capacità rigenerativa del muscolo, e causa di infiammazione cronica del muscolo danneggiato, fibre vengono sostituite da tessuto connettivo e grasso, successivamente, portando ad una perdita di funzione. Generalmente, i pazienti DMD perdono deambulazione degli arti inferiori all&#39;inizio del secondo decennio. Più tardi, anche i muscoli delle braccia e del cingolo scapolare sono colpiti e pazienti spesso sviluppano scoliosi toraco-lombare a causa di indebolimento asimmetrica dei muscoli che sostengono la colonna vertebrale. Ventilazione assistita è generalmente richiesto nella tarda adolescenza o vent&#39;anni. Respiratorie e insufficienza cardiaca piomboa morte nella terza o quarta decade 1. Sebbene il gene-malattia è stato scoperto oltre 25 anni fa 2, non esiste una cura disponibile per la DMD. Tuttavia, una migliore assistenza sanitaria e l&#39;uso di corticosteroidi hanno aumentato l&#39;aspettativa di vita nel mondo occidentale 3. Con l&#39;uso di modelli animali come il topo mdx, importanti passi avanti nella scoperta di potenziali strategie terapeutiche sono state fatte. Il topo mdx è il modello di topo DMD più comunemente usato. Esso ha una mutazione puntiforme nell&#39;esone 23 della DMD gene murino e di conseguenza manca distrofina 4. Negli ultimi due anni, molte strategie proposte sono progredite in studi clinici 5-9. In questi studi, il miglioramento della funzione muscolare è l&#39;endpoint primario, sottolineando l&#39;importanza di testare i benefici dei composti sulla funzione muscolare nei topi durante la fase clinica preliminare di test. Come DMDpazienti, anche le fibre muscolari negative distrofina di topi mdx sono vulnerabili ad esercitare danni indotti e la loro funzione muscolare è compromessa rispetto a C57BL/10ScSnJ wild type topi. Questo deterioramento può essere valutata con una serie di test funzionali. Alcuni di questi test sono invasivi e non interferiscono con la patologia muscolare (ad es forelimb forza di presa, prove appesi e rotarod esecuzione). Pertanto possono essere utilizzati per monitorare la storia naturale della malattia o determinare gli effetti dei composti sulla progressione della malattia. Per ottenere una immagine in profondità l&#39;influenza dei composti sulla funzione muscolare nel topo mdx, un regime test funzionale che non interferisce con la progressione della malattia consiste in tutti questi test può essere utilizzato 10. In alternativa, costretto treadmill in esecuzione può essere usato per esacerbare intenzionalmente la progressione della malattia e testare le capacità protettive di composti 11. Il tapis roulant può anche essereutilizzato come misura di esito in cui tempo di funzionamento fino ad esaurimento viene misurata 12, o come strumento per fatica topi mdx modo che essi svolgono meno bene in un test funzionale successiva garantire grandi differenze di prestazioni tra i gruppi di trattamento 13. Quando si sceglie test funzionali, il loro effetto sulla progressione della malattia deve essere tenuto presente soprattutto quando il test topi distrofici come il topo mdx 14. Siamo qui descriviamo in dettaglio come eseguire i test funzionali più comunemente utilizzati in modo affidabile e riproducibile sulla base disponibili procedure operative standard della rete TREAT-NMD. <a href="http://www.treat-nmd.eu/resources/research-resources/dmd-sops/" target="_blank">Clicca qui per visitare TREAT-NMD</a> .

<table><tbody><tr><td>Misuratore di forza della presa del mouse</td><td>Chatillon DFE (rivenduto da Columbus Instruments)</td><td># 80529</td><td></td></tr><tr><td>Filo per appendere 2 arti</td><td>dispositivo Appendiabiti per stoffa o dispositivo</td><td></td><td></td>su misura</tr><tr><td>Filo per appendere 4 arti Coperchio</td><td>della gabbia per topi o dispositivo</td><td></td><td></td>su misura</tr><tr><td>Rotarod</td><td>Ugo Basil</td><td># 47600</td><td></td></tr><tr><td>Tapis roulant per topi Exer 3/6</td><td>Columbus Instruments</td><td># 1055SRM</td><td></td></tr></tbody></table>

valutare prestazioni funzionali nel<em&gt; mdx</em&gt; mouse model

Assessing Functional Performance in the Mdx Mouse Model

Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è un muscolo grave e progressivo deperimento disturbo per il quale nessuna cura disponibile. Tuttavia, diversi potenziali composti farmaceutici e approcci di terapia genica hanno progredito nei test clinici. Con il miglioramento della funzione muscolare è il punto finale più importante in questi studi, molta enfasi è stata posta sulla creazione di affidabile, riproducibile, e facile da eseguire test funzionali di controllare la validità clinicamente valutare la funzione muscolare, la forza, la condizione e il coordinamento nel mdx modello murino di DMD. Entrambi i test invasivi e non invasivi sono disponibili. I test che non esacerbare la malattia possono essere utilizzati per determinare la storia naturale della malattia e gli effetti degli interventi terapeutici (ad es. Prova la forza di presa degli arti anteriori, due differenti prove sospese utilizzando sia un filo o una griglia e rotarod esecuzione). In alternativa, costretto treadmill in esecuzione può essere utilizzato per migliorare la progressione della malattia e / o valutareeffetti protettivi di interventi terapeutici sulla patologia della malattia. Siamo qui descritto come eseguire questi test funzionali più comunemente utilizzati in modo affidabile e riproducibile. L&#39;utilizzo di questi protocolli basati su procedure operative standard permette il confronto dei dati tra diversi laboratori.

La forza di presa zampa anteriore di tipo selvatico e topi mdx aumenta di età compresa tra 4-12 settimane e riduce di nuovo nei topi anziani. Le svalutazioni in vigore possono già essere osservati in giovani topi mdx. Dati rappresentativi di nove settimane vecchie topi femmina sono mostrati nelle Figure 1A e 1 B. Anche se la stanchezza non differisce tra i ceppi ancora a questa età, i topi mdx sono più deboli di topi wild type. Non abbiamo ancora i dati sulle ...

L&#39;outcome primario negli studi clinici per le malattie neuromuscolari è generalmente migliorata la funzione muscolare. Pertanto, valutando l&#39;effetto di potenziali composti terapeutici sulla performance muscolare pre clinicamente in modelli murini è di grande importanza. Siamo qui descriviamo diversi test funzionali per affrontare questo.

Valutare prestazioni funzionali nel<em&gt; Mdx</em&gt; Mouse Model

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe and progressive muscle wasting disorder for which no cure is available. Nevertheless, several potential ...

L'obiettivo generale di queste procedure è determinare la funzionalità muscolare mediante diversi test funzionali non dannosi. La forza dei quattro arti può essere valutata tramite il test della forza di presa, mentre la coordinazione dell'equilibrio e lo stato muscolare possono essere valutati con i test di sospensione a due arti e a quattro arti. Il rotorod viene inoltre utilizzato per valutare equilibrio, coordinazione e condizione muscolare.La corsa forzata su tapis roulant può essere utilizzata sia per aggravare la progressione della malattia sia prima di un test funzionale per sfinire i topi. Questi test funzionali possono essere impiegati per valutare in modo affidabile il ruolo della genetica e l'effetto di potenziali composti terapeutici sulla performance muscolare. Il primo test da mostrare è il test della forza di presa con le quattro zampe.Assicurarsi che l'impostazione del trasduttore di forza sia in modalità di tensione massima per il traino e utilizzare i grammi come unità di misura, reimpostando il misuratore all'inizio di ogni registrazione. Far tirare ogni topo tre volte di seguito. Afferrare il topo per la coda e spostarlo orizzontalmente verso la griglia.Verific

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Un'analisi semplice e a basso costo per la misurazione della deambulazione in modelli murini di distrofia muscolare

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Modellazione della sclerosi multipla nei due sessi: encefalomielite autoimmune sperimentale indotta da MOG35-55

Impara a valutare la funzionalità muscolare nel modello murino Mdx per disturbi neuromuscolari. Questi test non invasivi aiutano i ricercatori a studiare l'effetto di composti terapeutici sulle prestazioni muscolari.

Valutare prestazioni funzionali nel

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