Usando RNA-interferenza per Indagare sulla risposta immunitaria innata in mouse macrofagi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare l'interferenza dell'RNA per studiare l'effetto dei geni candidati sulla risposta immunitaria innata. Nei macrofagi di topo per fare ciò, le linee cellulari di macrofagi di topo vengono tripizzate e combinate con la soluzione di trasfezione e gli RNA SI di interesse, la miscela viene quindi trasferita su una piastra VETE nucleo a 96 pozzetti e un sistema di trasfezione Maxa 96 Well viene utilizzato per trasfettare siRNA nei macrofagi e dopo un'incubazione con coltura cellulare, terreno, LPS o altri attivatori dell'immunità innata vengono applicati ai macrofagi trasfettati per stimolarli. Infine, le Eliza vengono quindi eseguite per monitorare la produzione di citochine e valutare l'effetto del trattamento con siRNA sulla risposta immunitaria innata.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alla trasfezione mediata dai lipidi è che il nostro test è robusto e può essere applicato a molti geni nella professione ad alto rendimento. La chiave di questo metodo è lavorare con cellule sane, trattarle delicatamente e lavorare in modo efficiente durante il processo di trasfezione. Come dimostreremo, questo protocollo utilizza la linea cellulare di macrofagi di topo grezza 2 64 0.7, che viene coltivata come descritto nel documento di accompagnamento.

In preparazione per la piastra di trasfezione INA, le cellule hanno una fluenza del 20% di co e crescono per uno o due giorni fino a quando le cellule non sono confluenti per più dell'80%. È importante ricordare di utilizzare celle che si trovano tra i passaggi tre e 10. Dopo lo scongelamento, iniziare questa procedura programmando il sistema di navette a 96 pozzi che verrà utilizzato per la trasfezione.

Per fare ciò, avviare il software della navetta a 96 pozzetti sul computer collegato alla navetta dal menu file in alto a sinistra. Selezionare un nuovo file di parametri. Evidenziare i pozzetti che verranno trasfettati sullo schema della piastra a 96 pozzetti visualizzato.

Una casella verde indicherà i pozzetti selezionati. Scegliere il programma che corrisponde alla linea cellulare di macrofagi utilizzata per 2 64 0,7 cellule grezze. Scegliere DS 1 36 selezionare applicare.

Si noti che dopo aver selezionato un programma, i pozzetti sulla piastra schematica saranno colorati. I cerchi vuoti blu scuro indicano i pozzetti a cui non è stato assegnato un programma e non saranno scioccati. Successivamente, preparare la soluzione effettrice nucleo funzionante mescolando la soluzione nucleo-effettrice della linea cellulare SF a 96 pozzetti con l'intero contenuto della provetta supplementare inclusa.

Lasciare equilibrare i reagenti miscelati a temperatura ambiente. Riscaldare il D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0,25% in EDTA e PBS a 37 gradi Celsius. Preparare il plasmide sperimentale di controllo S-I-R-N-A-P max GFP o i siRNA marcati in fluorescenza scongelandoli su ghiaccio per staccare i macrofagi aderenti dalle piastre di coltura cellulare.

Aspirare il terreno e lavare le cellule due volte con 10 millilitri di PBS. Quindi, dopo aver rimosso il PBS, incubare le cellule con un millilitro di tripsina EDTA allo 0,25% preavvertita per piastra fino a quando le cellule iniziano a staccarsi. Questa operazione richiede da uno a due minuti.

Picchiettare delicatamente la piastra e muovere la soluzione durante l'incubazione per massimizzare la tripsinizzazione. Dopo che le cellule si sono staccate, aggiungere nove millilitri di DMEM più FBS e mescolare delicatamente pipettando su e giù, quindi raccogliere le cellule pipettandole in una provetta sterile. Contare il numero di macrofagi isolati utilizzando un citometro Hema.

Aspettatevi circa 10 milioni di macrofagi per piastra di 10 centimetri. Calcola il numero totale di macrofagi necessari Ogni pozzetto della navetta da 96 pozzetti richiede 200.000 cellule. Pipettare il numero calcolato di cellule in una provetta da centrifuga.

Centrifugare le cellule per 10 minuti a 150 g a temperatura ambiente su una piastra di fondo rotonda sterile a 96 pozzetti, che facilita la miscelazione riducendo al minimo la perdita di reagente. Aggiungere due microlitri di ciascun IRNA a ciascun pozzetto da trasfettare. Si noti che, a seconda del numero di siRNA, questo può essere ottenuto durante la fase di centrifugazione dei macrofagi.

L'aspetto più difficile di questa procedura è l'elettroporazione, le chiavi che trattano le cellule molto delicatamente e per lavorare molto rapidamente. Una volta che le cellule sono in una soluzione di trasfezione tossica, aspirare il terreno dalle celle di centrifugazione, quindi risospenderle delicatamente in una soluzione effettrice di nucleo. SF contenente la soluzione di integratore.

Trasferire immediatamente le cellule in un trogolo sterile utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 20 microlitri della miscela di cellule risospese in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti contenente i siRNA delicatamente miscelati pipettando su e giù. Quindi, trasferire 20 microlitri della miscela di cellule INA nella piastra vete nucleo a 96 pozzetti. È fondamentale evitare di generare bolle durante questa fase, in quanto ciò può indurre errori durante l'affezione del nucleo.

Dopo aver posizionato tutti i campioni sperimentali nella piastra di trasfezione, coprirla con il coperchio in dotazione e picchiettarla molto delicatamente su una superficie dura. Per rimuovere eventuali bolle, posizionare la piastra a 96 pozzetti nella navetta dell'effettore nucleo a 96 pozzetti e, in basso a destra della schermata del programma, selezionare carica e avvia. Quindi seguire le istruzioni del programma per salvare con successo i risultati durante il processo di affezione del nucleo.

Trasfettato sarà rappresentato sullo schema a 96 pozzetti sullo schermo da un cerchio verde con un segno più. Un cerchio rosso con un segno meno indica un errore, molto probabilmente dovuto alle bolle o al pipettaggio del volume errato di reagenti subito dopo l'affezione del nucleo. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 80 microlitri di RPMI 1640 di preriscaldamento.

Medio a lato di ciascuno. Lasciare che il terreno si mescoli lentamente con le cellule trasfettate, che sono molto delicate in questa fase. L'aggiunta del terreno troppo velocemente ridurrà notevolmente la vitalità.

Posizionare la piastra a 96 pozzetti con campioni trasfettati e RPMI 1640 in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 per due o più minuti. È fondamentale consentire alle cellule di riprendersi prima di ulteriori manipolazioni. Dopo aver rimosso la piastra dall'incubatore, utilizzare una pipetta multicanale per trasferire con cura la miscela da ciascun pozzetto in una piastra di coltura tissutale da 96 pozzetti.

Inoltre, utilizzando la pipetta multicanale, aggiungere a ciascuna 100 microlitri di DMEM con FBS. Incubare bene per 24-36 ore subito dopo la trasfezione e il recupero, eseguire la citometria a flusso. Per valutare l'efficienza di trasfezione dell'irna SI marcato in fluorescenza, oltre il 99% delle cellule deve essere trasfettato il giorno dopo il saggio di trasfezione Per l'efficienza di trasfezione del plasmide GFP, dal 30 al 50% delle cellule deve esprimere GFP Dopo l'incubazione di 24-36 ore, preparare LPS o altri attivatori dell'immunità innata in terreno fresco diluire l'LPS a una concentrazione finale di 20 nanogrammi per millilitro in DMEM con FBS.

Quindi aspirare con cura il terreno dalla piastra a 96 pozzetti e aggiungere il terreno fresco contenente l'LPS alle celle. Posizionare la piastra in un'incubatrice per monitorare la risposta all'LPS o ad altri stimolatori dell'immunità innata in vari momenti dopo la stimolazione. Pipettare il surnatante dalle cellule in una piastra di conservazione a 96 pozzetti per l'analisi da parte di Eliza.

Dopo aver rimosso il surnatante per monitorare la vitalità cellulare, aggiungere 100 microlitri di fluoresceina di acetato in PBS a ciascun pozzetto da incubare a temperatura ambiente per uno o cinque minuti. Monitorare la fluorescenza nelle cellule utilizzando un lettore di piastre quando vengono scisse dalle esterasi cellulari nelle cellule vive. Questo composto diventa fluorescente per illustrare l'utilità di questo approccio per il monitoraggio della risposta immunitaria innata.

I siRNA che hanno come bersaglio noti geni regolatori dell'immunità innata sono stati trasfettati nella linea cellulare grezza di macrofagi 2 64 0.7. Le cellule sono state quindi stimolate con LPS e produzione di citochine pro-infiammatorie. IL sei e TNF alfa sono stati monitorati da Eliza, come mostrato qui.

Inibizione del recettore toll-like quattro, il recettore per LPS, ma non di altri TLR. Utilizzando SIR, una produzione fortemente diminuita di LPS ha indotto IL sei e TNF alfa. Si noti che l'inibizione di IL 6 con irna ha diminuito la produzione di IL sei, ma non ha influenzato la produzione di TNF alfa.

Questi dati suggeriscono una buona efficacia e una buona specificità del knockdown mediato da siRNA di candidati regolatori dell'immunità innata. È importante ricordare che la chiave per una buona trasfezione e un buon recupero cellulare è lavorare con cellule molto sane, trattarle delicatamente durante il processo di trasfezione e recupero e lavorare rapidamente una volta che le cellule sono in una soluzione effettrice nucleo. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti molti altri test, tra cui la QPCR per monitorare il knockdown genico e molti altri test per studiare la risposta immunitaria innata.