Name: Usando RNA-interferenza per Indagare sulla risposta immunitaria innata in mouse macrofagi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Impara a utilizzare l'RNA interference per studiare la risposta immunitaria innata nei macrofagi murini. Questo metodo consente di silenziare geni candidati e analizzare la produzione di citochine dopo stimolazione con LPS.

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Grazie a Brad Lackford per l'assistenza nell'ottimizzazione di alcune delle tecniche descritte in questo manoscritto.

1. Manutenzione di macrofagi linee cellulari <ol><li> Grow RAW264.7 e linee cellulari J774A.1 in DMEM supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS), a 37 ° C in presenza del 5% di CO 2. Per aiutare a mantenere la sterilità, aggiungere 1% di penicillina / streptomicina (penna / strep) ai media (anche se questo non è strettamente necessario). </li><li> Passaggio fondamentale: Assicurarsi che i macrofagi sono in crescita in uno stato di salute per la trasfezione efficiente e siRNA-indotta knockdown gene. Utilizzare le cellule tra i passaggi 3 e 10 dopo lo scongelamento fresco, come queste righe macrofagi presentano la migliore efficienza di trasfezione e mantenere solida la sopravvivenza dopo la trasfezione in questa fase; non utilizzare un numero di brano superiore (&gt; 20), come l&#39;efficienza di trasfezione e Silenziamento genico entrambi diminuiscono notevolmente. </li><li> Per ottimizzare la trasfezione di siRNA, cellule piastra a 20% di confluenza e crescere uno o due giorni fino a quando le cellule raggiungono non confluenza superiore all&#39;80%. Cellule Overgrown non trasfettare efficposi- zione ergonomica. </li></ol> 2. Programmazione del 96 pozzetti sistema Shuttle per la trasfezione <ol><li> Avviare il software di navetta a 96 pozzetti sul computer collegato alla navetta. Seleziona nuovo file di parametri nel menu File in alto a sinistra. </li><li> Selezionare i pozzetti che verranno transfettate sul visualizzata 96 pozzetti schematica. Un riquadro verde indica che i pozzi sono selezionati. </li><li> Selezionare il programma che corrisponde alla linea cellulare di macrofagi in uso (DS-136 per RAW264.7 o DS-130 per J774A.1) e selezionare Applica, che si trova al di sotto della piastra a 96 pozzetti nel diagramma. Si noti che dopo la selezione di un programma, i pozzetti sulla piastra schematica saranno di colore blu scuro. Cerchi vuoti indicano pozzi che non è stato assegnato un programma e non saranno scioccati. </li></ol> 3. Preparazione dei Reagenti per la trasfezione <ol><li> Preparare la soluzione Nucleofector ™ di lavoro mescolando linea cellulare SF 96 e soluzione Nucleofector ™con l&#39;intero contenuto della provetta supplemento allegata. Lasciare i reagenti misti equilibrare a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. Conservare la soluzione in eccesso completa Nucleofector ™ a 4 ° C per un massimo di 3 mesi per un utilizzo futuro. </li><li> Preriscaldare il salino DMEM, RPMI-1640, 0,25% tripsina / EDTA, e tampone fosfato (PBS) a 37 ° C prima di preparare i macrofagi per la trasfezione. </li><li> Preparare il siRNA per trasfezione di scongelamento sul ghiaccio. Per ridurre al minimo il numero di disgelo congelamento del siRNA, congelare nuovi siRNA in aliquote la prima volta che vengono utilizzati. </li><li> In esperimenti iniziali, utilizzare siRNA ad una dose relativamente alta di 2 micron (diluito 1:10 da 20 micron scorte). Successivamente titolare siRNA che inducono robusta gene knockdown fino a dosi più basse, anche se sono necessarie dosi più elevate di solito per un efficiente atterramento gene nei macrofagi rispetto ad altri tipi di cellule. NOTA: siRNA sono disponibili da diverse fonti; abbastanza robusto knockdown gene può essere ottenutoutilizzando SmartPools siGenome, che sono quattro piscine di siRNA mirati ogni gene. Come controllo negativo, usare una delle varie piscine non-targeting siRNA o siRNA. </li><li> Per monitorare l&#39;efficienza di trasfezione, transfettare sia il plasmide pmaxGFP di controllo (fornito nel kit Amaxa) o siRNA fluorescenza marcata in parallelo ai siRNA sperimentali. Aspettatevi 30-50% trasfezione del plasmide GFP (analizzati mediante microscopia o citometria a flusso il giorno dopo trasfezione) e&gt; 99% trasfezione di fluorescenza marcata siRNA (analizzati mediante citometria di flusso immediatamente dopo la trasfezione e recupero). </li></ol> 4. Preparazione dei macrofagi per la trasfezione <ol><li> Staccare macrofagi aderenti dalle piastre di coltura cellulare mediante tripsinizzazione. Aspirare i media e lavare le cellule due volte con 10 ml di PBS. Dopo aver rimosso la PBS, incubare le cellule con pre-riscaldato 0,25% tripsina / EDTA (1 ml / 10 cm Piatto) per 1-2 minuti fino a quando le cellule iniziano a staccarsi. Agitare gentilmente la piastra e spostare la soluzione durante l&#39;incubazione per massimizzare tripsinizzazione. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 9 ml supporto DMEM + FBS, mescolare delicatamente su e giù, e raccogliere le cellule pipettando in una provetta sterile. </li><li> Contare il numero di macrofagi isolati utilizzando un emocitometro. Aspettatevi circa 10 milioni di macrofagi ogni 10 cm Piatto. Calcolare il numero totale di macrofagi necessari; ciascun pozzetto sulla navetta 96 pozzetti richiede 200.000 cellule. Ricordarsi di aggiungere un valore di celle a pochi pozzi in più &#39;per consentire perdite di pipettaggio. </li><li> Pipettare il numero calcolato di cellule in una provetta da centrifuga. Centrifugare le cellule per 10 min a 150 xg a temperatura ambiente. Non centrifugare troppo in fretta come questo diminuirà la salute dei macrofagi e l&#39;efficienza di trasfezione. </li></ol> 5. Nucleofection dei macrofagi con siRNA <ol><li> Utilizzando uno sterile a 96 pozzetti piastra rotonda inferiore (che facilita la miscelazione, riducendo al minimo la perdita di reagente), aggiungere 2 ml di ogni siRNA a ciascun pozzetto per essere trasfette. Nota: A seconda del numero di siRNA, questo può essere effettuato durante la fase di centrifugazione macrofagi. </li><li> Aspirare il supporto dalle cellule centrifugati. Risospendere delicatamente le cellule in soluzione Nucleofector ™ SF (contenenti la soluzione supplemento), con 20 pl per 200.000 cellule pellet. Una volta risospeso, utilizzare immediatamente le cellule per la trasfezione ottimale. </li><li> Trasferire cellule risospese in un trogolo sterili; usando una pipetta multicanale, trasferimento 20 microlitri della miscela cellulare risospeso in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti contenente la siRNA. Mescolare delicatamente pipettando su e giù. </li><li> Trasferire 20 ml di miscela di cellule / siRNA in ben 96 piastra Nucleocuvette ™ passaggio fondamentale:. Evitare la generazione di bolle durante la fase di trasferimento in quanto ciò può indurre errori durante Nucleofection. </li><li> Dopo aver posizionato tutti i campioni sperimentali nella piastra trasfezione, coprire la piastra a 96 pozzetti con il coperchio in dotazione e very toccare delicatamente su una superficie dura per rimuovere eventuali bolle dai campioni. </li><li> Posizionare piastra a 96 pozzetti con coperchio in ben 96 navetta Nucleofector e selezionare &#39;caricare e avviare&#39; in basso a destra della finestra del programma. Prima di Nucleofection, seguire la richiesta del programma per salvare i risultati. Nota: Durante il processo di Nucleofection, pozzi tranfected con successo saranno raffigurati sul 96 pozzetti schema sullo schermo da un cerchio verde con un segno più. Un cerchio rosso con segno meno indica un errore, molto probabilmente a causa di bolle o mis-stato aggiunto il corretto volume di reagenti. </li></ol> 6. Recupero e placcatura dei macrofagi <ol><li> Subito dopo Nucleofection, con una pipetta multicanale, aggiungere 80 ml di pre-riscaldato (37 ° C) RMP1-1640 media per ciascun pozzetto. Aggiungere il supporto al lato di ogni pozzetto, consentendo al supporto di mescolare lentamente con le cellule trasfettate, che sono molto delicati in questa fase. Non aggiungere i media troppo in fretta, in modo daridurre notevolmente la redditività. </li><li> Posizionare le piastre a 96 pozzetti con campioni trasfettati e RPMI-1640 in un incubatore 37 ° C con il 5% di CO 2 per 2 min; questo è fondamentale per permettere alle cellule di recuperare prima di ulteriori manipolazioni. </li><li> Rimuovere la piastra a 96 pozzetti dall&#39;incubatore e trasferire accuratamente la miscela da ciascun pozzetto in una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti usando una pipetta multicanale. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ml di pre-riscaldato (37 ° C) DMEM + FBS medio in ciascun pozzetto. </li><li> Incubare la piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti con i campioni in un incubatore 37 ° C con il 5% di CO 2 per 24-36 ore (ottimizzare i tempi esatti per i singoli siRNA, anche se questo intervallo di tempo in generale funziona bene). </li></ol> 7. La stimolazione dei macrofagi con LPS <ol><li> Dopo il 24-36 ore post-Nucleofection incubazione, preparare LPS (o altro PAMPs) in mezzi freschi. Preparare abbastanza terreno fresco per tutti i pozzi (200 ml media / pozzetto della piastra a 96 pozzetti, più un piccolo extra per il pipettaggio). Diluire LPS ad una concentrazione finale di 20 ng / ml in DMEM + FBS. </li><li> Supporti con attenzione aspirare dalla piastra a 96 pozzetti e aggiungere il supporto di fresco contenente LPS alle cellule. </li><li> Monitorare la risposta a LPS o altri PAMPs in vari momenti dopo la stimolazione. 6 ore è sufficiente a generare una robusta risposta citochina infiammatoria di citochine come IL-6 e TNFa. </li></ol> 8. Monitoraggio della risposta immunitaria indotta Innata, Gene Knockdown e vitalità nei macrofagi <ol><li> Per monitorare LPS-indotta la produzione di citochine, pipettare il surnatante dalle cellule in una piastra di archiviazione da 96 pozzetti. La produzione di citochine può essere misurato con ELISA. </li><li> Una volta che il surnatante viene rimosso, monitorare la vitalità cellulare con diacetato di fluoresceina (quando spaccati dalle esterasi cellulari in cellule vive, questo composto diventa fluorescente). Identificare siRNA che hanno come target i geni che controllano la vitalità cellulare tramite til suo approccio. Nota: il processo di transfezione stesso dovrebbe avere scarso effetto sulla vitalità se eseguita correttamente. <ol><li> Aggiungere fluoresceina diacetato (5 mg / ml magazzino in acetone) a ciascun pozzetto (diluizione 1: 100 in PBS finale). </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 1-5 minuti e quindi monitorare la fluorescenza nelle cellule utilizzando un lettore di piastre (460 nm di eccitazione, emissione 515 nm). </li><li> Opzionale: Per garantire che la fluorescenza nei pozzetti è uniforme, lisare le cellule utilizzando tamponi, come RIPA; ciò fornisce un segnale fluorescente uniforme nel pozzo, come alcuni lettori di piastre sono configurati per controllare solo una piccola parte del pozzo; se le cellule non sono placcati uniformemente, la fluoresceina diacetato potrebbe dare una lettura imprecisa. </li></ol></li><li> In alternativa al monitoraggio vitalità cellulare, monitorare gene siRNA indotta knockdown da qPCR utilizzando RNA derivato dalle cellule aderenti. <ol><li> Dopo il surnatante viene rimosso dalle cellule (punto 8.1), pubblicitàd Buffer RLT (che viene utilizzato per la lisi e la conservazione di RNA) direttamente alle cellule aderenti per lisare loro. </li><li> Isolare RNA utilizzando un kit di preparazione RNA come il RNeasy mini-kit, e utilizzare qPCR con primer gene-specifici per monitorare gene knockdown rispetto al trattamento di controllo siRNA. Utilizzare primer per Βactin o GAPDH per la normalizzazione. </li></ol></li><li> Come ulteriore alternativa per monitorare altri aspetti della risposta immunitaria innata, monitorare la capacità fagocitica dei macrofagi aggiungendo marcato con FITC E. particelle coli direttamente sulla cellule aderenti con un kit. In seguito il protocollo del produttore, che richiede solo un paio d&#39;ore, monitorare l&#39;assorbimento fagocitaria utilizzando un lettore di piastre o microscopia. </li></ol>

<ol><li>Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufmann%2C+SHE+%22The+innate+immune+response+to+infection%22">The innate immune response to infection</a>. , ASM Press. (2004).</li>
<li>Adams, D. O., Hamilton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of macrophage activation.</a> Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).</li>
<li>Fujiwara, N., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+inflammation.+Current+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+allergy%22%5BJournal%5D)">Macrophages in inflammation. Current drug targets.</a> Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).</li>
<li>Gordon, S., Martinez, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%3A+mechanism+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages: mechanism and functions.</a> Immunity. 32, 593-604 (2010).</li>
<li>Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%3A+an+immunologic+functional+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective.</a> Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).</li>
<li>Fairweather, D., Cihakova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+activated+macrophages+in+infection+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity.</a> Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).</li>
<li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).</li>
<li>Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization comes of age.</a> Immunity. 23, 344-346 (2005).</li>
<li>Burke, B., Lewis, C. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurke%2C+B+%22The+macrophage%22">The macrophage</a>. , 2nd edn, Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+methodologies+for+the+functional+study+of+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules.</a> PloS one. 4, (2009).</li>
<li>Carralot, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-throughput+siRNA+transfection+in+raw+264.7+macrophages%3A+a+case+study+for+optimization+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+screening%22%5BJournal%5D)">Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure.</a> Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).</li>
<li>Alper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+innate+immunity+genes+and+pathways+using+a+comparative+genomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22ProcNatl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach.</a> ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).</li>
<li>De Arras, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+innate+immunity+protein+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bio.+Chem%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network.</a> J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).</li>
<li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+regulators+of+the+systemic+response+to+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).</li>
<li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+innate+immune+genes+by+transcriptional+profiling+of+macrophages+stimulated+with+TLR+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands.</a> Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).</li>
<li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+genes+that+mediate+innate+immunity+using+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice.</a> Genetics. 183, 1535-1544 (2009).</li>
<li>Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+macrophage+cell+lines+transformed+by+Abelson+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus.</a> Cell. 15, 261-267 (1978).</li>
<li>Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysozyme+synthesis+by+established+human+and+murine+histiocytic+lymphoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines.</a> The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).</li>
<li>Zumbansen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+siRNA+library+screening+in+hard-to-transfect+HUVEC+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+RNAi+and+gene+silencing%22%5BJournal%5D)">First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells.</a> Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).</li>
<li>Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS%2FTLR4+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42, 145-151 (2008).</li>
<li>Aliprantis, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+activation+and+apoptosis+by+bacterial+lipoproteins+through+toll-like+receptor-2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2.</a> Science. 285, 736-739 (1999).</li>
<li>Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+double-stranded+RNA+and+activation+of+NF-kappaB+by+Toll-like+receptor+3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3.</a> Nature. 413, 732(2001).</li>
<li>Conforti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+effects+of+toll-like+receptor+%28TLR3%29+signaling+in+tumors+can+be+therapeutically+uncoupled+to+optimize+the+anticancer+efficacy+of+TLR3+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands.</a> Cancer Res. 70, 490-500 (2010).</li>
<li>Fernandez-Botran, R., Větvička, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFernandez-Botran%2C+R+%22Methods+in+Cellular+Immunology%22">Methods in Cellular Immunology</a>. 8, CRC Press. 8(2001).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione. Questo articolo è stato sponsorizzato da Lonza, Inc.

Numerosi studi sono stati pubblicati in cui i singoli geni sono stati presi di mira da siRNA in macrofagi murini. Mentre trasfezione lipidico-mediata è stato utilizzato per fornire siRNA di linee cellulari di macrofagi su base individuale, questi metodi soffrono di potenziali effetti sulla vitalità, limitata knockdown gene, e la variabilità da gene a gene. Per sviluppare analisi più robusti che potrebbero essere utilizzati ai geni della moda medio o alto-rendimento obiettivo, abbiamo ottimizzato le tecniche che utilizza...

In questo protocollo, si descrivono i metodi efficaci per inibire i geni in linee cellulari di macrofagi del mouse utilizzando siRNA e monitorare gli effetti di questi trattamenti sulla risposta immunitaria innata. Queste procedure vengono eseguite in formato a 96 pozzetti, consentendo schermi RNAi in modo medio o high-throughput. In risposta alle infezioni, gli esseri umani montare una risposta immunitaria innata immediata e una risposta immunitaria adattativa lento ma più preciso. Questa rapida risposta immunitaria innata coinvolge il reclutamento e l&#39;attivazione delle cellule immunitarie innate fagociti, tra cui i macrofagi 1. Classicamente macrofagi attivati ​​sono coinvolti nelle risposte infiammatorie acute e producono proteine ​​antimicrobiche e composti, citochine e chemochine, e presentano antigeni 2,3. In alternativa macrofagi attivati ​​svolgono un ruolo nella regolazione del sistema immunitario, mantenendo la tolleranza, la riparazione dei tessuti e la guarigione delle ferite 4-8. A causa della loro vasta gamma di funzioni, I macrofagi possono svolgere un ruolo in numerose malattie tra cui l&#39;aterosclerosi, artrite, cancro e 9. Pertanto, lo studio dei macrofagi è stata un&#39;area chiave di ricerca per un certo tempo in un&#39;ampia varietà di campi malattia. Nonostante la loro importanza nella risposta immunitaria innata, i macrofagi può essere difficile cellule con cui lavorare. In particolare, è difficile ottenere trasfezione efficiente utilizzando reagenti lipidici nei macrofagi senza tossicità associata 10,11. Inoltre, anche quando siRNA è efficiente consegnato macrofagi, la robustezza del gene RNAi indotta atterramento spesso può essere abbastanza moderato e può variare da gene a gene. Per superare queste sfide tecniche, abbiamo ottimizzato la trasfezione e tecniche di atterramento 12-16 in due linee cellulari di macrofagi del mouse, RAW264.7 17 e J774A.1 18. Questo approccio utilizza la Amaxa Nucleofector 96 pozzetti Sistema navetta per la trasfezione; questo sistemautilizza una combinazione di reagenti specializzati e elettroporazione per trasfettare cellule in formato a 96 pozzetti 19. A seguito di trasfezione, si descrivono i metodi per massimizzare il recupero delle cellule e la vitalità e per massimizzare la successiva gene knockdown siRNA-indotta. Per illustrare l&#39;utilità di questo approccio, si descrive un protocollo per la consegna di siRNA a queste linee cellulari di macrofagi, stimolare queste cellule con lipopolisaccaride (LPS), e monitorare la risposta immunitaria innata a livello della produzione di numerose citochine pro-infiammatorie. Forniamo dati di esempio in cui TARGET famiglia dei recettori Toll-like (TLR), i cui membri percepire LPS e altri modelli molecolari patogeni associati (PAMP), per regolare l&#39;immunità innata.

<table><tbody><tr><td>Sistema navetta a 96 pozzetti per nucleofector Amaxa</td><td>Lonza</td><td>AAM-1001S</td><td></td></tr><tr><td>Kit per nucleofector a 96 pozzetti per linea cellulare Amaxa SF</td><td>Lonza</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 linea cellulare di macrofagi di topo</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 linea cellulare di macrofagi di</td><td>topo ATCC</td><td>TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>siGenome smartpool siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>varia a seconda su gene</td><td></td></tr><tr><td>Pool di siRNA di controllo non mirato</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-13-20</td><td></td></tr><tr><td>Block-iT oligo fluorescente per elettroporazione</td><td>Invitrogen</td><td>13750062</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure E. coli O111:B4 LPS</td><td>List Biological Laboratories</td><td>421</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto glucosio</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina (Pen/Strep)</td><td>Fisher</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>0,25% di tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>piastre per coltura tissutale a 96 pozzetti</td><td>Fisher</td><td>07-200-89</td><td></td></tr><tr><td>Piastre sterili a fondo tondo a 96 pozzetti (non rivestite)</td><td>Fisher</td><td>07-200-745</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA per topi IL-6 Duoset</td><td>R& D Biosystems</td><td>DY406</td><td></td></tr><tr><td>Topo TNF&alfa; Kit ELISA Duoset</td><td>R& D Biosystems</td><td>DY410</td><td></td></tr><tr><td>Diacetato di fluoresceina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378</td><td></td></tr><tr><td>Tampone RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr> Kit per il <tr><td>test di fagocitosi di Vybrant</td><td>Invitrogen</td><td>V-6694</td><td></td></tr></tbody></table>

usando rna-interferenza per indagare sulla risposta immunitaria innata in mouse macrofagi

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

I macrofagi sono cellule immunitarie innate fagocitiche chiave. Quando i macrofagi incontrano un agente patogeno, producono proteine e composti antimicrobici per uccidere l'agente patogeno, producono varie citochine e chemochine per reclutare e stimolare altre cellule immunitarie e presentano antigeni per stimolare la risposta immunitaria adattativa. Pertanto, essere in grado di manipolare in modo efficiente i macrofagi con tecniche come l'RNA-interferenza (RNAi) è fondamentale per la nostra capacità di studiare questa importante cellula immunitaria innata. Tuttavia, i macrofagi possono essere tecnicamente difficili da trasfettare e possono mostrare un knockdown genico inefficiente indotto dall'RNAi. In questo protocollo, descriviamo i metodi per trasfettare in modo efficiente due linee cellulari di macrofagi di topo (RAW264.7 e J774A.1) con siRNA utilizzando il sistema navetta a 96 pozzetti Amaxa Nucleofector e descriviamo le procedure per massimizzare l'effetto del siRNA sul knockdown genico. Inoltre, i metodi descritti sono adattati per funzionare in formato a 96 pozzetti, consentendo studi a media e alta produttività. Per dimostrare l'utilità di questo approccio, descriviamo esperimenti che utilizzano l'RNAi per inibire i geni che regolano la produzione di citochine indotta dai lipopolisaccaridi (LPS).

Per dimostrare l&#39;efficienza di trasfezione usando questo approccio, abbiamo monitorato assorbimento di marcata con FITC siRNA usando un citometro a flusso (Figura 1). Per illustrare l&#39;utilità del nostro approccio per il monitoraggio della risposta immunitaria innata, abbiamo trasfettato siRNA mirate note innate geni regolatori del sistema immunitario nella linea cellulare di macrofagi RAW264.7, stimolato le cellule con LPS, e poi monitorato la produzione delle citoch...

In questo protocollo, descriviamo metodi per trasfettare in modo efficiente linee cellulari di macrofagi murini con siRNA utilizzando il sistema navetta a 96 pozzetti Amaxa Nucleofector, stimolare i macrofagi con lipopolisaccaride e monitorare gli effetti sulla produzione di citochine infiammatorie.

Usando RNA-interferenza per Indagare sulla risposta immunitaria innata in mouse macrofagi

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare l'interferenza dell'RNA per studiare l'effetto di geni candidati sulla risposta immunitaria innata. Per farlo nei macrofagi murini, linee cellulari di macrofagi murini vengono trypsinizzate e combinate con soluzione di trasfezione e con gli siRNA di interesse; la miscela viene quindi trasferita in una piastra nucleo VETE a 96 pozzetti e un sistema di trasfezione Maxa 96 Well viene utilizzato per trasfettare gli siRNA nei macrofagi. Dopo un'incubazione con mezzo di coltura cellulare, vengono aggiunti ai macrofagi trasfettati LPS o altri attivatori dell'immunità innata per stimolarli. Infine, vengono eseguiti test Eliza per monitorare la produzione di citochine e valutare l'effetto del trattamento con siRNA sulla risposta immunitaria innata.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alla trasfezione mediata da lipidi è che il nostro saggio è robusto e può essere applicato a molti geni in modo ad alta produttività. La chiave di questo metodo consiste nel lavorare con cellule sane, trattarle delicatamente e operare in modo efficiente durante il processo di trasfezione. Come dimostreremo, questo protocollo utilizza la linea cellulare di macrofagi murini RAW 264.7, che viene coltivata come descritto nel documento allegato.In previsione della piastra per la trasfezione INA, seminare le cellule al 20% di confluenza e farle crescere per uno o due giorni fino a quando non raggiungono una confluenza massima dell'80%. È importante ricordare di utilizzare cellule comprese tra il terzo e il decimo passaggio. Dopo lo scongelamento, iniziare questa procedura programmando il sistema shuttle a 96 pozzetti che verrà utilizzato per la trasfezione.Per fare ciò, avviare il software della piastra shuttle a 96 pozzetti sul computer collegato allo shuttle, selezionandolo dal menu file in alto a sinistra. Selezionare un nuovo file di parametri. Evidenziare i pozzetti che verranno trasfettati sullo schema della piastra a 96 pozzetti visualizzato.Una casella verde indicherà le pozzette selezionate. Scegliere il programma corrispondente alla linea cellulare di macrofagi utilizzata per le cellule raw 2 64 0.7. Scegliere DS 1 36, selezionare e applicare.Si noti che dopo aver selezionato un programma, i pozzetti nella piastra schematica verranno colorati. Cerchi vuoti di colore blu scuro indicano pozzetti a cui non è stato assegnato alcun programma e che non riceveranno stimolazione elettrica. Successivamente, preparare la soluzione nucleo effettore di lavoro mescolando la soluzione nucleo effettore per linea cellulare SF in piastra a 96 pozzetti con il contenuto completo del tubo del supplemento incluso.Lasciare equilibrare i reagenti miscelati a temperatura ambiente. Riscaldare il D-M-E-M-R-P-M-I 1640 con tripsina al 0,25% EDTA e il PBS a 37 gradi Celsius. Preparare il plasmide di controllo sperimentale S-I-R-N-A-P max GFP o gli siRNA marcati con fluorescenza scongelandoli sul ghiaccio per staccare i macrofagi aderenti dalle piastre di coltura cellulare.Aspirare il mezzo e lavare le cellule due volte con 10 millilitri di PBS. Successivamente, dopo aver rimosso il PBS, incubare le cellule con un millilitro di tripsina 0,25% EDTA preriscaldata per piastra fino a quando le cellule iniziano a staccarsi. Questo richiede da uno a due minuti.Battere leggermente sulla piastra e muovere la soluzione durante l'incubazione per massimizzare la tripsinizzazione. Dopo che le cellule si sono staccate, aggiungere nove millilitri di DMEM più FBS mescolando delicatamente mediante pipettaggio su e giù, quindi raccogliere le cellule aspirandole con la pipetta in un tubo sterile. Contare il numero di macrofagi isolati utilizzando un emocitometro.Si prevedono circa 10 milioni di macrofagi per ogni piastra da 10 centimetri. Calcolare il numero totale di macrofagi necessari, considerando che ogni pozzetto della piastra shuttle a 96 pozzetti richiede 200.000 cellule. Pipettare il numero calcolato di cellule in un tubo da centrifuga.Centrifugare le cellule per 10 minuti a 150 G a temperatura ambiente in una piastra sterile da 96 pozzetti con fondo rotondo, che facilita il mescolamento riducendo al minimo la perdita di reagenti. Aggiungere due microlitri di ciascun IRNA in ogni pozzetto da trasfettare. Si noti che, a seconda del numero di siRNA, questa operazione può essere eseguita durante il passaggio di centrifugazione dei macrofagi.L'aspetto più difficile di questa procedura è l'elettroporazione; le chiavi sono trattare le cellule con molta delicatezza e lavorare molto rapidamente. Una volta che le cellule si trovano in una soluzione tossica di trasfezione, aspirare il mezzo dalle cellule centrifugate, quindi risospendere delicatamente in soluzione nucleo effector SF contenente la soluzione supplementare.Trasferire immediatamente le cellule in una vaschetta sterile utilizzando una pipetta multicanale, trasferendo 20 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contenente gli siRNA, mescolando delicatamente mediante aspirazione e dispensazione ripetuta. Successivamente, trasferire 20 microlitri della miscela cellulare INA nella piastra nucleo vete a 96 pozzetti. È fondamentale evitare la formazione di bolle durante questo passaggio, poiché ciò potrebbe indurre errori durante la nucleo affezione.Dopo aver posizionato tutti i campioni sperimentali nella piastra per la trasfezione, coprirla con il coperchio fornito e battere leggermente su una superficie dura. Per rimuovere eventuali bolle d'aria, inserire la piastra a 96 pozzetti nella navetta nucleo effector a 96 pozzetti e, nell'angolo in basso a destra della schermata del programma, selezionare "upload and start". Quindi seguire le indicazioni del programma per salvare correttamente i risultati durante il processo di nucleo affezione.Le piastre trasfettate saranno rappresentate nello schema a 96 pozzetti sullo schermo da un cerchio verde con un segno più. Un cerchio rosso con un segno meno indica un errore, probabilmente dovuto a bolle d'aria o a un volume errato di reagenti pipettati immediatamente dopo la nucleofezione. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 80 microlitri di RPMI 1640 preriscaldato.Aggiungere il mezzo ai lati di ciascun pozzetto. Far sì che il mezzo si mescoli lentamente con le cellule transfezionate, che in questa fase sono molto delicate. Aggiungere il mezzo troppo velocemente ridurrebbe notevolmente la vitalità.Posizionare la piastra a 96 pozzetti con i campioni trasfettati e RPMI 1640 in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% CO2 per due minuti o più. È fondamentale permettere alle cellule di riprendersi prima di ulteriori manipolazioni. Dopo aver rimosso la piastra dall'incubatore, utilizzare una pipetta multicanale per trasferire con attenzione la miscela da ogni pozzetto in una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti.Quindi, utilizzando la pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di DMEM con FBS a ciascun pozzetto. Incubare per 24-36 ore e immediatamente dopo la trasfezione e il recupero eseguire la citometria a flusso. Per valutare l'efficienza di trasfezione dell'RNAi marcato fluorescentemente, più del 99% delle cellule dovrebbe risultare trasfettato il giorno successivo alla trasfezione. Per l'efficienza di trasfezione del plasmide GFP, il 30-50% delle cellule dovrebbe esprimere GFP. Al termine dell'incubazione di 24-36 ore, preparare il LPS o altri attivatori dell'immunità innata nel mezzo fresco, diluendo il LPS a una concentrazione finale di 20 nanogrammi per millilitro in DMEM con FBS.Quindi aspirare con attenzione il mezzo dalla piastra a 96 pozzetti e aggiungere il mezzo fresco contenente il LPS alle cellule. Collocare la piastra in un incubatore per monitorare la risposta al LPS o ad altri stimolatori dell'immunità innata in diversi momenti successivi alla stimolazione. Pipettare il sopranatante delle cellule in una piastra di conservazione a 96 pozzetti per l'analisi mediante ELISA.Dopo aver rimosso il soprannatante per monitorare la vitalità cellulare, aggiungere 100 microlitri di fluoresceina diacetato al rapporto uno a 100 in PBS in ogni pozzetto e incubare a temperatura ambiente per uno a cinque minuti. Monitorare la fluorescenza nelle cellule utilizzando un lettore di piastre quando il composto viene scisso dagli esterasi cellulari nelle cellule vive. Questo composto diventa fluorescente per illustrare l'utilità di questo approccio nel monitorare la risposta immunitaria innata.siRNA mirati a geni noti per la regolazione dell'immunità innata sono stati trasfettati nella linea cellulare di macrofagi RAW 264.7. Le cellule sono state quindi stimolate con LPS e la produzione di citochine pro-infiammatorie, IL-6 e TNF-α, è stata monitorata mediante ELISA, come mostrato qui.Inibizione del recettore toll-simile quattro, il recettore per LPS, ma non di altri TLR. Utilizzando SIR, si è osservata una produzione fortemente ridotta di IL sei e TNF alfa indotta da LPS. Si noti che l'inibizione di IL sei mediante irna ha ridotto la produzione di IL sei, ma non ha influenzato la produzione di TNF alfa.Questi dati indicano una buona efficacia e una buona specificità dell'abbattimento mediato da siRNA di regolatori candidati dell'immunità innata. È importante ricordare che la chiave per una buona trasfezione e un buon recupero cellulare consiste nel lavorare con cellule molto sane, trattarle delicatamente durante le fasi di trasfezione e recupero, e operare rapidamente una volta che le cellule sono in una soluzione con effettore nucleare. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire molte altre analisi, inclusa la QPCR per monitorare l'abbattimento genico e numerosi altri saggi per studiare la risposta immunitaria innata.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video mostra un test basato su cellule reporter per lo screening di potenziali nanoparticelle bioattive che inibiscono la segnalazione del recettore Toll-like (TLR). Il test prevede l'introduzione di lipopolisaccaridi (LPS) mescolati con ibridi di nanoparticelle peptidico-oro ai macrofagi reporter che esprimono le proteine reporter: fosfatasi alcalina embrionale secreta (SEAP) e luciferasi. La riduzione del segnale TLR indotto da LPS mediata dagli ibridi è determinata misurando i segnali...

Un test per lo screening di nanoparticelle bioattive per l'inibizione della segnalazione del recettore toll-like

Descriviamo un protocollo per misurare la produzione di citochina antivirale in topi infettati con un modello herpesvirus, murina gamma herpesvirus 68 (γ HV68) che è strettamente correlata alla associato al sarcoma herpesvirus di Kaposi umano (KSHV) e virus di Epstein-Barr (EBV). Utilizzando ceppi di topi geneticamente modificati e fibroblasti embrionali di topo (MEF), abbiamo valutato la produzione di citochina antivirale sia in vivo e ex vivo. "Ricostituzione" l'espressione di componenti...

Dissezione Innate Immune Signaling in Evasion virale di produzione di citochine

Descriviamo qui un semplice protocollo per isolare i macrofagi peritoneali murini. Questa procedura è seguita dall'estrazione dell'RNA per effettuare l'analisi dell'espressione genica dopo la stimolazione dei recettori Toll-like.

Isolamento di murini peritoneale macrofagi di effettuare analisi di espressione genica Al Toll-like recettori stimolazione

Descriviamo la rilevazione di NLRP3 inflammasome attivazione su base cellulare utilizzando la microscopia a fluorescenza e la macchiatura per active caspasi-1 e l'adattatore, ASC. Un test di rilascio di lattato deidrogenasi è presentato per rilevare pyroptotic lisi su base di popolazione. Queste tecniche possono essere adattate per studiare molti aspetti della biologia inflammasome.

Rilevamento di attivazione Inflammasome e morte delle cellule Pyroptotic in macrofagi murini derivate da midollo osseo

Descriviamo un metodo di utilizzo polyethyleneimine (PEI)-rivestito di nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico per macrofagi trasfezione con siRNA. Queste nanoparticelle è in grado di fornire in modo efficiente siRNA di espressione del gene bersaglio macrofagi in vitro e in vivo e silenzio.

Nanoparticelle di ossido di ferro rivestite con Polyethyleneimine come un veicolo per la consegna di piccolo RNA interferente ai macrofagi In Vitro e In Vivo

Un approccio è descritto per la rilevazione in tempo reale della risposta immunitaria innata di ferite cutanee e Staphylococcus aureus infezione dei topi. Di confronto LysM-EGFP topi (che possiedono i neutrofili fluorescenti) con un LysM-EGFP incrociate topo immunodeficiente, abbiamo anticipato la nostra comprensione dell'infezione e lo sviluppo di approcci per combattere l'infezione.

Un modello di topo per valutare risposta immunitaria innata per infezione da Staphylococcus aureus

I macrofagi, in particolare i macrofagi primari, sono difficili da trasfecare in quanto sono specializzati nel rilevamento di molecole di origine non auto. Descriviamo un protocollo che consente una trasfezione altamente efficiente dei macrofagi primari con mRNA generati da modelli di DNA come i plasmidi.

Trasfezione altamente efficiente dei macrofagi primari con mRNA trascritto in vitro

Per testare l'effetto di una chemiochina sul reclutamento di macrofagi in vivo, l'intero montaggio in situ ibridazione è stato utilizzato per rilevare l'espressione ectopica della chemiochina, e l'immunostainizzazione è stata utilizzata per etichettare i macrofagi. L'imaging dal vivo è stato utilizzato per l'osservazione in tempo reale della migrazione dei macrofafi.

Un modello di espressione della chemiochina ectopica per testare il reclutamento macrofrofo in vivo

Questo protocollo fornisce ai ricercatori un metodo rapido e indiretto per misurare l'attività del fattore di trascrizione NF-B-B/AP-1 dipendente da TLR in una linea cellulare murina di macrofaci in risposta a una varietà di superfici polimeriche e strati proteici adzuolabili che modellano il microambiente implantare biomateriale.

Un analisi della cella del Macrophage Reporter per esaminare la segnalazione NF-kB/AP-1 mediata da un rata a tollo su superfici polimetiche

Dimostriamo un protocollo passo-passo per lo studio della funzione genica nei macrofagi residenti nel tessuto peritoneale in vivo, utilizzando vettori lentivirali.

Preparazione di vettori lentivirali per un'efficiente modulazione di geni e microRNA di macrofagi residenti nei tessuti della cavità peritoneale in vivo nei topi

Impara a utilizzare l'RNA interference per studiare la risposta immunitaria innata nei macrofagi murini. Questo metodo consente di silenziare geni candidati e analizzare la produzione di citochine dopo stimolazione con LPS.

Usando RNA-interferenza per Indagare sulla risposta immunitaria innata in mouse macrofagi

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