Analisi delle reazioni RNA di trasformazione che utilizzano cellulari Sistemi gratis: 3 'Fine Decolleté di pre-mRNA Substrati In vitro
May 3rd, 2014
RNA polimerasi II sintetizza un RNA precursore che si estende oltre l'estremità 3 'del mRNA maturo. La fine del RNA maturo viene generato cotranscriptionally, in un sito dettata da sequenze di RNA, tramite l'attività di endonucleasi del complesso scissione. Qui, dettaglio il metodo per studiare le reazioni di dissociazione in vitro.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esaminare con successo la scissione di tre mRNA principali in vitro. Ciò si ottiene producendo prima un estratto nucleare trascrizionalmente attivo da cellule cresciute in sospensione. La seconda fase della procedura consiste nel realizzare substrati di RNA radiomarcati tramite trascrizione in vitro.
Il terzo passo consiste nel gelificare i substrati di RNA marcati. Il passaggio finale consiste nell'assemblare la reazione di scissione, compreso l'estratto nucleare e il substrato di RNA marcato. In definitiva, i risultati possono mostrare tre mRNA primari, substrati scissi UNC e prodotto scisso attraverso l'elettroforesi verticale su gel radioattivo.
La dimostrazione visiva di questo metodo è importante, anche se è stata eseguita dagli anni '80, non è facile da eseguire in quanto ci sono molti passaggi specifici durante la procedura che sono impegnativi. Avere celle lavate, pellettate e pronte per la lisi. Per iniziare questo protocollo al pellet cellulare, aggiungere un tampone con DTT fresco.
Aggiungere cinque volumi del CPV stimato e utilizzare una pipetta per rompere il pellet e lasciare che la sospensione si raffreddi sul ghiaccio. Dopo 10 minuti, far girare le celle a quattro gradi Celsius in un secchio oscillante. Centrifugare con cura per aspirare il surnatante.
Il pellet avrà assorbito un po' di soluzione e si sarà gonfiato di dimensioni. Quindi aggiungere un CPV di tampone A e rompere delicatamente il pellet con un puntale per pipetta. Versare la sospensione in un omogeneizzatore raffreddato e con cinque-12 colpi di pestello stretto svuotare le cellule.
Rimuovere una piccola aliquota, applicare il trian blue e controllare le cellule per determinare la completezza della loro lisi. Se necessario, continuate a omogeneizzare le cellule fino a quando non saranno lisizzate al 90%, ma senza esagerare. Ora trasferisci il lisato in una provetta da ultracentrifuga ultra trasparente.
Registra il volume totale e giralo come fatto in precedenza. Aspirare il surnatante torbido e conservarlo con ghiaccio. E per l'analisi del citosol, fare attenzione a non disturbare il pellet.
Contiene i nuclei. Quindi, far girare il pellet ad alta velocità per 15 minuti. Rimuovere il piccolo volume di surnatante rimanente e raggrupparlo con la raccolta del citosol.
Quindi determinare il volume nucleare PACT. Aggiungere al pellet un equivalente in volume di tampone C. Quindi rimuovere il pellet utilizzando la pipetta in un omogeneizzatore pulito.
Usa da cinque a 10 colpi di pestello stretti per risus. Sospendere il pellet. Trasferire l'omogeneizzato in un tubo freddo e mescolarlo per inversione per 30 minuti.
A quattro gradi Celsius, è possibile utilizzare una piastra di agitazione. Se il volume è sufficientemente grande, trasferire il lisato in una provetta per ultracentrifuga UltraClear e, a quattro gradi Celsius, centrifugarlo per 30 minuti. A circa 25.000 gs, il surnatante è l'estratto nucleare.
Seguendo il protocollo di testo, completare la dialisi da un solo microgrammo di modello. Preparare la sonda mediante trascrizione in vitro utilizzando un kit con un promotore compatibile SP six o T seven. Quando si carica la pagina, utilizzare tre microlitri di marcatore e tutti i 25 microlitri della reazione per ogni substrato di RNA.
Inoltre, previeni la contaminazione incrociata distanziando le corsie di trascrizioni di dimensioni simili. Far funzionare il gel in modo tale che una sonda da 600 nucleotidi funzioni a 25 watt per circa due ore dopo. Per contrassegnare la posizione delle bande di gel, illuminare la pellicola esposta con una scatola luminosa e mettere sopra il gel avvolto.
Allineare il marcatore rad automatico e il marcatore esposto sulla pellicola. E poi segna le posizioni dei cinturini con un pennarello nero per rimuovere i cinturini Scartare il gel. E con una lama pulita, asportare le sezioni della banda del gel, trasferire ciascuna sezione nella propria provetta ed eluire l'RNA seguendo le procedure standard.
Dopo che tutti i reagenti sono stati preparati, riscaldare l'RNA marcato a 80 gradi Celsius per due minuti. Quindi trasferire l'RNA nel vortice di ghiaccio, il 10% PVA, quindi farlo girare ad alta velocità per alcuni minuti per rimuovere le bolle, quindi procedere a creare le miscele master per ogni reazione. Per ogni reazione, erogare 5,25 microlitri di master mix one.
Quindi, aggiungi 6,25 microlitri della miscela di estratto nucleare. Quindi aggiungere un microlitro di substrato di RNA marcato diluito a 50 ano molari in tutto. Ogni reazione utilizza meno di cinque RNA marcati anomolari.
Ora, vorticare delicatamente e far girare rapidamente le miscele di reazione. Lasciare che la reazione avvenga per un massimo di due ore a 30 gradi Celsius. Prendendo un corso temporale della reazione si otterranno i migliori risultati Dopo aver utilizzato la proteinasi K per digerire la proteina nella reazione e quindi purificare la reazione Utilizzando il metodo del cloroformio fenolo, eseguire i prodotti con un carico di pagina del 6%, tre microlitri di marcatore o cinque microlitri per prodotto di reazione per corsia.
Quindi eseguire il gel e successivamente smontare con cura l'apparato del gel. Per raccogliere il gel, premere saldamente la carta da filtro contro di esso e capovolgerlo. Premere con decisione il vetro per assicurarsi che il gel sia completamente afferrato dalla carta.
Quindi staccare lentamente la carta da filtro con il gel attaccato. Avvolgi il lato esposto del gel nella plastica e fissa l'involucro alla carta da filtro sull'altro lato. Terminare mettendo il gel in un essiccatore per 15 minuti con la carta da filtro rivolta verso l'aspirapolvere.
Successivamente, analizza il gel esponendolo a una pellicola o a un imager fosfo. Il si è spezzato. Il substrato dell'RNA è la banda che migra più lentamente nella parte superiore del gel.
Il prodotto specifico sfaldato, contrassegnato da una freccia in grassetto, scorre più velocemente nel gel alla dimensione prevista. Questo prodotto è assente dal controllo con una mutazione puntiforme nella sequenza pollier. La quantificazione dell'attività di scissione è stata determinata con un grafico metrico DS.
Confronto del rapporto tra RNA scisso e scisso, normalizzato con il controllo dell'RNA scisso. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come un test di poliadenilazione, per rispondere a ulteriori domande, come l'attività della poliA polimerasi. Questo test viene eseguito modificando le condizioni di reazione, come l'aggiunta di magnesio e la rimozione dell'EDTA.
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Panoramica
Questo studio si concentra sull'esame della scissione dei tre primi mRNA in vitro, un processo cruciale nella maturazione dell'RNA. Il metodo prevede l'uso di un estratto nucleare trascrizionalmente attivo e substrati di RNA marcati radioattivamente per analizzare le reazioni di scissione.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia dell'RNA
- Biologia molecolare
- Biochimica
Sfondo
- L'RNA polimerasi II sintetizza l'RNA precursore che si estende oltre l'estremità 3' dell'mRNA maturo.
- Il complesso di scissione determina il sito per la generazione dell'RNA maturo.
- I processi cotrascrizionali sono essenziali per la maturazione dell'RNA.
- Comprendere le reazioni di scissione può fornire informazioni sui meccanismi di elaborazione dell'RNA.
Obiettivo dello studio
- Esaminare la scissione dei tre primi mRNA in vitro.
- Comprendere il ruolo degli estratti nucleari nell'elaborazione dell'RNA.
- Analizzare i prodotti delle reazioni di scissione utilizzando l'elettroforesi su gel.
Metodi utilizzati
- Preparazione di estratto nucleare trascrizionalmente attivo da cellule coltivate in sospensione.
- Sintesi di substrati di RNA marcati radioattivamente mediante trascrizione in vitro.
- Purificazione su gel di substrati di RNA marcati.
- Montaggio delle reazioni di scissione con estratto nucleare e substrati di RNA marcati.
Principali risultati
- È stata osservata una scissione di successo dei substrati di mRNA tre primi.
- I risultati sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel radioattivo verticale.
- Sono stati identificati substrati e prodotti di scissione UNC.
- La metodologia fornisce un quadro per lo studio delle reazioni di scissione dell'RNA.
Conclusioni
- Questo studio delinea un metodo affidabile per esaminare la scissione dell'mRNA in vitro.
- Comprendere i meccanismi di scissione può migliorare la conoscenza dell'elaborazione dell'RNA.
- I risultati contribuiscono al più ampio campo della biologia dell'RNA.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Understanding RNA 3' end processing is critical for target validation in RNA-based therapeutics, where precise transcript maturation influences protein expression levels and functional outcomes. This in vitro cleavage assay enables mechanistic de-risking by isolating the biochemical requirements for accurate pre-mRNA processing, supporting predictive confidence in target engagement. The method provides a quantitative, reproducible system to evaluate how genetic or pharmacological perturbations affect RNA stability and function, informing early discovery decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of RNA processing mechanisms to validate transcript-specific targets involved in gene expression regulation.
- Operational Value: Provides a controlled system to assess how mutations in polyadenylation signals affect cleavage efficiency and RNA stability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of cleavage products to support assay standardization for screening modulators of RNA processing factors.
- Operational Value: Uses gel-based detection to ensure reproducibility and scalability across multiple RNA substrates and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by linking RNA processing defects to aberrant transcript isoforms observed in pathological states.
- Operational Value: Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation by defining biochemical thresholds for functional RNA maturation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, where RNA target validation precedes lead identification and preclinical evaluation by clarifying the functional impact of transcript processing on protein output.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of RNA regulatory elements and mechanistic de-risking of targets involved in mRNA maturation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized substrate preparation and quantitative product detection via gel electrophoresis.
- Analytics: Enables comparison of cleavage efficiency across conditions using normalized product-to-substrate ratios for data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical work by defining processing competence as a biomarker for RNA-based therapeutic suitability.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating RNA-targeting modalities across multiple programs and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in RNA target validation by reducing ambiguity in transcript processing mechanisms.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized nuclear extract preparation and labeled substrate quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking RNA processing fidelity to expected protein expression and functional outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying targets with robust, regulatable RNA maturation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, RNA biochemistry, and radioactive labeling techniques.
- Dependent on ultracentrifugation, gel electrophoresis, and autoradiography infrastructure for nuclear extract preparation and product detection.
- Necessitates cross-team standardization of substrate design, reaction conditions, and quantification methods to ensure comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the assay to diverse RNA substrates or disease-relevant systems.
- Limited by the technical complexity of nuclear extract isolation and the need for careful optimization to avoid nonspecific degradation.
