Analisi delle reazioni RNA di trasformazione che utilizzano cellulari Sistemi gratis: 3 'Fine Decolleté di pre-mRNA Substrati In vitro
3 maggio 2014
RNA polimerasi II sintetizza un RNA precursore che si estende oltre l'estremità 3 'del mRNA maturo. La fine del RNA maturo viene generato cotranscriptionally, in un sito dettata da sequenze di RNA, tramite l'attività di endonucleasi del complesso scissione. Qui, dettaglio il metodo per studiare le reazioni di dissociazione in vitro.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esaminare con successo la scissione di tre mRNA principali in vitro. Ciò si ottiene producendo prima un estratto nucleare trascrizionalmente attivo da cellule cresciute in sospensione. La seconda fase della procedura consiste nel realizzare substrati di RNA radiomarcati tramite trascrizione in vitro.
Il terzo passo consiste nel gelificare i substrati di RNA marcati. Il passaggio finale consiste nell'assemblare la reazione di scissione, compreso l'estratto nucleare e il substrato di RNA marcato. In definitiva, i risultati possono mostrare tre mRNA primari, substrati scissi UNC e prodotto scisso attraverso l'elettroforesi verticale su gel radioattivo.
La dimostrazione visiva di questo metodo è importante, anche se è stata eseguita dagli anni '80, non è facile da eseguire in quanto ci sono molti passaggi specifici durante la procedura che sono impegnativi. Avere celle lavate, pellettate e pronte per la lisi. Per iniziare questo protocollo al pellet cellulare, aggiungere un tampone con DTT fresco.
Aggiungere cinque volumi del CPV stimato e utilizzare una pipetta per rompere il pellet e lasciare che la sospensione si raffreddi sul ghiaccio. Dopo 10 minuti, far girare le celle a quattro gradi Celsius in un secchio oscillante. Centrifugare con cura per aspirare il surnatante.
Il pellet avrà assorbito un po' di soluzione e si sarà gonfiato di dimensioni. Quindi aggiungere un CPV di tampone A e rompere delicatamente il pellet con un puntale per pipetta. Versare la sospensione in un omogeneizzatore raffreddato e con cinque-12 colpi di pestello stretto svuotare le cellule.
Rimuovere una piccola aliquota, applicare il trian blue e controllare le cellule per determinare la completezza della loro lisi. Se necessario, continuate a omogeneizzare le cellule fino a quando non saranno lisizzate al 90%, ma senza esagerare. Ora trasferisci il lisato in una provetta da ultracentrifuga ultra trasparente.
Registra il volume totale e giralo come fatto in precedenza. Aspirare il surnatante torbido e conservarlo con ghiaccio. E per l'analisi del citosol, fare attenzione a non disturbare il pellet.
Contiene i nuclei. Quindi, far girare il pellet ad alta velocità per 15 minuti. Rimuovere il piccolo volume di surnatante rimanente e raggrupparlo con la raccolta del citosol.
Quindi determinare il volume nucleare PACT. Aggiungere al pellet un equivalente in volume di tampone C. Quindi rimuovere il pellet utilizzando la pipetta in un omogeneizzatore pulito.
Usa da cinque a 10 colpi di pestello stretti per risus. Sospendere il pellet. Trasferire l'omogeneizzato in un tubo freddo e mescolarlo per inversione per 30 minuti.
A quattro gradi Celsius, è possibile utilizzare una piastra di agitazione. Se il volume è sufficientemente grande, trasferire il lisato in una provetta per ultracentrifuga UltraClear e, a quattro gradi Celsius, centrifugarlo per 30 minuti. A circa 25.000 gs, il surnatante è l'estratto nucleare.
Seguendo il protocollo di testo, completare la dialisi da un solo microgrammo di modello. Preparare la sonda mediante trascrizione in vitro utilizzando un kit con un promotore compatibile SP six o T seven. Quando si carica la pagina, utilizzare tre microlitri di marcatore e tutti i 25 microlitri della reazione per ogni substrato di RNA.
Inoltre, previeni la contaminazione incrociata distanziando le corsie di trascrizioni di dimensioni simili. Far funzionare il gel in modo tale che una sonda da 600 nucleotidi funzioni a 25 watt per circa due ore dopo. Per contrassegnare la posizione delle bande di gel, illuminare la pellicola esposta con una scatola luminosa e mettere sopra il gel avvolto.
Allineare il marcatore rad automatico e il marcatore esposto sulla pellicola. E poi segna le posizioni dei cinturini con un pennarello nero per rimuovere i cinturini Scartare il gel. E con una lama pulita, asportare le sezioni della banda del gel, trasferire ciascuna sezione nella propria provetta ed eluire l'RNA seguendo le procedure standard.
Dopo che tutti i reagenti sono stati preparati, riscaldare l'RNA marcato a 80 gradi Celsius per due minuti. Quindi trasferire l'RNA nel vortice di ghiaccio, il 10% PVA, quindi farlo girare ad alta velocità per alcuni minuti per rimuovere le bolle, quindi procedere a creare le miscele master per ogni reazione. Per ogni reazione, erogare 5,25 microlitri di master mix one.
Quindi, aggiungi 6,25 microlitri della miscela di estratto nucleare. Quindi aggiungere un microlitro di substrato di RNA marcato diluito a 50 ano molari in tutto. Ogni reazione utilizza meno di cinque RNA marcati anomolari.
Ora, vorticare delicatamente e far girare rapidamente le miscele di reazione. Lasciare che la reazione avvenga per un massimo di due ore a 30 gradi Celsius. Prendendo un corso temporale della reazione si otterranno i migliori risultati Dopo aver utilizzato la proteinasi K per digerire la proteina nella reazione e quindi purificare la reazione Utilizzando il metodo del cloroformio fenolo, eseguire i prodotti con un carico di pagina del 6%, tre microlitri di marcatore o cinque microlitri per prodotto di reazione per corsia.
Quindi eseguire il gel e successivamente smontare con cura l'apparato del gel. Per raccogliere il gel, premere saldamente la carta da filtro contro di esso e capovolgerlo. Premere con decisione il vetro per assicurarsi che il gel sia completamente afferrato dalla carta.
Quindi staccare lentamente la carta da filtro con il gel attaccato. Avvolgi il lato esposto del gel nella plastica e fissa l'involucro alla carta da filtro sull'altro lato. Terminare mettendo il gel in un essiccatore per 15 minuti con la carta da filtro rivolta verso l'aspirapolvere.
Successivamente, analizza il gel esponendolo a una pellicola o a un imager fosfo. Il si è spezzato. Il substrato dell'RNA è la banda che migra più lentamente nella parte superiore del gel.
Il prodotto specifico sfaldato, contrassegnato da una freccia in grassetto, scorre più velocemente nel gel alla dimensione prevista. Questo prodotto è assente dal controllo con una mutazione puntiforme nella sequenza pollier. La quantificazione dell'attività di scissione è stata determinata con un grafico metrico DS.
Confronto del rapporto tra RNA scisso e scisso, normalizzato con il controllo dell'RNA scisso. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come un test di poliadenilazione, per rispondere a ulteriori domande, come l'attività della poliA polimerasi. Questo test viene eseguito modificando le condizioni di reazione, come l'aggiunta di magnesio e la rimozione dell'EDTA.
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Panoramica
Questo studio si concentra sull'esame della scissione dell'mRNA a tre prime in vitro, un processo cruciale nella maturazione dell'RNA. Il metodo prevede l'uso di estratto nucleare trascrizionalmente attivo e substrati di RNA marcati radioattivamente per analizzare le reazioni di scissione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia dell'RNA
- Biologia molecolare
- Biochimica
Sfondo
- La RNA polimerasi II sintetizza un RNA precursore che si estende oltre l'estremità 3' dell'mRNA maturo.
- Il complesso di scissione determina il sito di generazione dell'RNA maturo.
- I processi co-trascrizionali sono essenziali per la maturazione dell'RNA.
- La comprensione delle reazioni di scissione può fornire informazioni sui meccanismi di processamento dell'RNA.
Scopo dello studio
- Esaminare la scissione dell'mRNA a livello della regione tre prime in vitro.
- Comprendere il ruolo degli estratti nucleari nell'elaborazione dell'RNA.
- Analizzare i prodotti delle reazioni di scissione mediante elettroforesi su gel.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di estratto nucleare trascrizionalmente attivo da cellule in coltura in sospensione.
- Sintesi di substrati di RNA marcati radioattivamente mediante trascrizione in vitro.
- Purificazione su gel dei substrati di RNA marcati.
- Assemblaggio delle reazioni di scissione con estratto nucleare e substrati di RNA marcati.
Risultati principali
- È stata osservata una scissione efficace di tre substrati di mRNA a valle.
- I risultati sono stati analizzati mediante elettroforesi verticale su gel radioattivo.
- I substrati scissi da UNC e i prodotti di scissione sono stati identificati.
- La metodologia fornisce un quadro di riferimento per lo studio delle reazioni di scissione dell'RNA.
Conclusioni
- Questo studio descrive un metodo affidabile per esaminare il taglio dell'mRNA in vitro.
- Comprendere i meccanismi di scissione può approfondire le conoscenze sul processamento dell'RNA.
- I risultati contribuiscono al campo più ampio della biologia dell'RNA.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere l'elaborazione dell'estremità 3' dell'RNA è fondamentale per la validazione degli obiettivi terapeutici basati sull'RNA, in cui la maturazione precisa del trascritto influenza i livelli di espressione proteica e gli esiti funzionali. Questo saggio di scissione in vitro consente una riduzione del rischio meccanicistica isolando i requisiti biochimici necessari per l'elaborazione accurata del pre-mRNA, sostenendo una previsione affidabile dell'interazione con l'obiettivo. Il metodo fornisce un sistema quantitativo e riproducibile per valutare come perturbazioni genetiche o farmacologiche influenzino la stabilità e la funzione dell'RNA, guidando le decisioni nelle fasi iniziali della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi dei meccanismi di processamento dell'RNA per convalidare bersagli specifici per trascritto coinvolti nella regolazione dell'espressione genica.
- Valore operativo: Fornisce un sistema controllato per valutare come le mutazioni nei segnali di poliadenilazione influenzino l'efficienza del taglio e la stabilità dell'RNA.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative dei prodotti di scissione per supportare la standardizzazione dei saggi nella selezione di modulatori dei fattori di processamento dell'RNA.
- Valore operativo: Utilizza un rilevamento basato su gel per garantire riproducibilità e scalabilità su diversi substrati di RNA e condizioni sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Favorisce la modellizzazione di rilevanza patologica collegando i difetti di processamento dell'RNA a isoforme di trascritto aberranti osservate in condizioni patologiche.
- Valore operativo: Permette un percorso continuo dalla scoperta meccanicistica alla validazione preclinica definendo soglie biochimiche per la maturazione funzionale dell'RNA.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, in cui la validazione dell'RNA bersaglio precede l'identificazione dei composti promettenti e la valutazione preclinica, chiarificando l'impatto funzionale dell'elaborazione del trascritto sull'espressione proteica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sugli elementi regolatori dell'RNA e la riduzione del rischio meccanicistica di bersagli coinvolti nella maturazione dell'mRNA.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso la preparazione standardizzata del substrato e il rilevamento quantitativo del prodotto mediante elettroforesi su gel.
- Analisi: Permette il confronto dell'efficienza di scissione tra diverse condizioni utilizzando rapporti normalizzati tra prodotto e substrato, per una selezione dei bersagli basata sui dati.
- Ricerca traslazionale: Si collega ai lavori preclinici definendo la competenza di elaborazione come biomarcatore per la valutazione dell'idoneità terapeutica basata sull'RNA.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per la valutazione di modalità di intervento sull'RNA in diversi programmi e classi di bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli RNA bersaglio riducendo l'ambiguità nei meccanismi di processamento dei trascritti.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso la preparazione standardizzata di estratti nucleari e la quantificazione di substrati marcati.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto collegando la fedeltà del processamento dell'RNA all'espressione proteica attesa e ai risultati funzionali.
- Impatto sul portafoglio: Permette un avanzamento proporzionato al rischio identificando bersagli con profili di maturazione dell'RNA robusti e regolabili.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biologia molecolare, biochimica dell'RNA e tecniche di marcatura radioattiva.
- Dipende da infrastrutture per l'ultracentrifugazione, l'elettroforesi su gel e l'autoradiografia per la preparazione degli estratti nucleari e il rilevamento dei prodotti.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la progettazione dei substrati, le condizioni di reazione e i metodi di quantificazione, al fine di garantire la confrontabilità.
- Richiede considerazioni di adattamento quando si applica il saggio a diversi substrati di RNA o a sistemi rilevanti per le malattie.
- È limitato dalla complessità tecnica dell'isolamento degli estratti nucleari e dalla necessità di un'attenta ottimizzazione per evitare degradazioni non specifiche.
