Isolamento di CA1 nucleari arricchiti Frazioni di fettine di ippocampo per studiare l'attività-dipendente nucleare Importazione di Messenger proteine ​​Synapto-nucleari

Forniamo un protocollo dettagliato per l'induzione del potenziamento a lungo termine nella regione CA1 dell'ippocampo e il successivo isolamento di frazioni arricchite nucleari dalla zona tetanized della fetta. Questo approccio può essere utilizzato per determinare l'attività dipendente di importazione proteina nucleare in modelli cellulari di apprendimento e memoria.

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di studiare lo shuttle citoplasmatico nucleo-dipendente dell'attività delle proteine utilizzando fette acute dell'ippocampo in cui la connettività e la funzione neuronale sono ben preservate. Per raggiungere questo obiettivo, l'ippocampo di un ratto maschio adulto viene prima isolato e le fette trasversali acute vengono preparate come seconda fase. Le fette dell'ippocampo vengono trasferite nella camera di registrazione e la forma tardiva di LTP viene indotta nell'atomo CA di uno strato radi. Successivamente, le fette potenziate e di controllo vengono congelate e le regioni di ca one stimolate vengono sezionate al fine di isolare la frazione arricchita di nuclei per ulteriori analisi immuno-blott.

I risultati basati sull'analisi del western blotting mostrano differenze nei livelli di fosfoproteina nucleare tra le fette potenziate e quelle di controllo 30 minuti dopo l'induzione di LTP. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà per due motivi. In primo luogo, la bassa quantità di campione di tessuto e, in secondo luogo, il periodo di tempo critico che si ripete per la lisi dei campioni nel tampone di lisi ipotonica, consentendo il rilascio dei nuclei La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la preparazione della vita dell'ippocampo e l'isolamento della regione C one richiedono dissezioni rapide e molto accurate, ma ci sono alcuni trucchi.

Per renderlo più facile, sarebbe necessario seguire sia le istruzioni scritte che quelle visualizzate per la preparazione della frazione arricchita di nuclei dall'area C uno dell'ippocampo. La dimostrazione della procedura sarà eseguita dal laboratorio postale pinon. Mostrerà come preparare la lisi acuta dell'ippocampo e indurre l'LTP.

Dopo la dissezione di una regione C attraverso Berra, uno studente del nostro laboratorio vi mostrerà come isolare il nucleare e la distruzione. Inizia questa procedura isolando il cervello di ratto e immergendolo nella soluzione pregassata per lo sguardo ghiacciato. Successivamente, rimuovere il cervelletto e parte della corteccia enterale.

Separare gli emisferi corticali con un taglio sagittale medio. Successivamente, fai un taglio da 50 a 70 gradi lungo il bordo dorsale di ciascun emisfero. Quindi posizionare ogni semisfera sulla sua superficie mediale, incollare ogni emisfero con la superficie appena tagliata sulla piattaforma di affettatura del vibrato.

Successivamente coprire la piattaforma con la soluzione pre-carbogenato per lo sguardo ghiacciato. Tagliare fette da 350 micrometri contenenti la formazione ippocampale, le cortecce subulari ed enterali dal lato anteriore a quello posteriore con il vibram. Successivamente, trasferire le fette in un'incubatrice a forma di U e di tipo sommerso e incubarle per almeno due ore a 32 gradi Celsius con carbogeno A CSF.

Ora trasferisci una fetta di ippocampo nella camera di registrazione di tipo sommerso montata al microscopio. Perfondere la fetta con A CSF gassato a sei millilitri al minuto per almeno 30 minuti a 32 gradi Celsius. Dopo 30 minuti, riempire i microelettrodi capillari in vetro con un liquido cerebrospinale.

Posizionare un micro elettrodo nel CA, una fibra collaterale di Schaefer per la stimolazione e un altro nell'atomo pronto per lo strato per la registrazione di EPSP di campo a una distanza di 300 micrometri l'uno dall'altro. Quindi evoca gli SSP EP di campo erogando da tre a quattro volt tramite impulsi di corrente rettangolari fasici alle fibre collaterali di Schafer. Eseguire il test di massima stimolazione misurando la relazione di ingresso e uscita e definire l'intensità di stimolazione come il 40% del valore massimo di pendenza EPSP del campo.

Successivamente, registra la linea di base per almeno 15 minuti misurando le risposte agli stimoli del test ogni minuto durante l'esperimento. Per indurre l'LTP tardivo, applicare tein ad alta frequenza per aumentare gli EPSP del campo evocato in circa una regione. Applicare cinque micromolari di COE sul liquido cerebrospinale A due minuti prima del tetin e risciacquare immediatamente dopo l'ultimo tetano.

Interrompere la registrazione. Due minuti o 30 minuti dopo l'induzione tardiva dell'LTP, rimuovere gli elettrodi e trasferire rapidamente la fetta su una piattaforma metallica pre-raffreddata posta su ghiaccio secco. Quindi raccogliere ogni fetta in un tubo di orph da 1,5 millilitri e conservarla a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.

In questo passaggio, togli le fette congelate dagli 80 gradi Celsius negativi e tienile in ghiaccio. Aggiungere 0,5 millilitri di tampone TBS freddo fresco contenente inibitori della proteasi e della fosfatasi nella provetta. Incubarli per due o tre minuti prima di trasferirli in uno stereomicroscopio.

Quindi, sezionare la CA in uno strato della regione del parama dole dell'ippocampo tenendo la fetta con un ago e tagliando il CA in un'area con l'altra. Successivamente, raccogliere le regioni ca-1 sezionate da cinque fette per gruppo in una nuova provetta da un millilitro contenente 50 microlitri di tampone di lisi. Quindi omogeneizzare i tessuti raccolti pipettandoli accuratamente su e giù con una pipetta da 200 microlitri.

Incubare il lisato su ghiaccio per cinque-sette minuti per consentire alle cellule di gonfiarsi. Dopodiché, prendi due microlitri di lisato e lascialo cadere su un vetrino da microscopio. Visualizza il rigonfiamento delle cellule al microscopio a campo chiaro.

I nuclei appaiono come strutture rotonde e intatte con un corretto rigonfiamento. A questo punto, raccogliere 20 microlitri di campione in una provetta fresca da 1,5 millilitri come frazione omogeneizzata. Aggiungere otto microlitri di tampone per campioni XSDS denaturante.

Quindi centrifugare il lisato rimanente a 1100 RCF per un minuto. Dopo un minuto, raccogliere con cura il surnatante dall'alto e trasferirlo in un nuovo tubo. Successivamente, aggiungere 20 microlitri di quattro tamponi per campioni.

Quindi risospendere il pellet in 60 microlitri di tampone ipotonico e aggiungere 20 microlitri di quattro tampone campione. Questa frazione è indicata come frazione arricchita di nucleo. Conservare le frazioni omogeneizzate, citosoliche e arricchite di nuclei a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius o negativa di 80 gradi Celsius.

Per il successivo immunoblotting in questa procedura, scongelare i campioni e farli bollire per cinque minuti a 95 gradi Celsius prima di misurare la concentrazione proteica mediante il test AM mito nero, o carico del test BCA, una quantità uguale di campioni proteici provenienti dalle frazioni omogenate, citoplasmatiche e arricchite nucleari. Su una pagina SDS, i campioni di gel delle fette di controllo e LTP devono essere posizionati sullo stesso gel per il confronto diretto nel Western blot. Questa figura mostra un immuno blot per le frazioni omogenate, citosoliche e arricchite di lisato di ca one sondate con marcatori citosolici e nucleari.

Questa è un'analisi immuno blot dei livelli di PJS 180 nell'omogenato due minuti e 30 minuti dopo l'induzione della teina, e questa è un'analisi immuno del sangue dei livelli di PJS 180 nella frazione arricchita nucleare. Due minuti e 30 minuti dopo l'iniezione, i livelli di fosfo, Jacob sono rimasti inalterati negli omogeneizzati totali di CA 1 e nella frazione arricchita nucleare due minuti dopo l'izzazione. Ma un aumento significativo è stato riscontrato in p Jacob, S 180 Immunoreattività 30 minuti dopo l'induzione di LTP.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare un volume appropriato di valvola di lisi ipotonica. Inoltre, il periodo di tempo critico per la lisi dei campioni deve essere standardizzato. In particolare, quando questo metodo viene applicato per l'isolamento di nuclei e frazioni da campioni di tessuto cerebrale di ratto o topo diversi dall'ippocampo Seguendo questa procedura, altri metodi come la colorazione immunitaria complementare con anticorpi contro proteine candidate importate nel nucleo dopo l'induzione di OTP o molecole di segnalazione come forme attive di chinasi o fosfatasi, possono essere utili per verificare tali risultati.

Il trattamento farmacologico può essere eseguito per rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, quali cascate di segnalazione sono coinvolte nella traslocazione delle proteine nucleari sinaptiche, o come influenzano una funzione nucleare. Inoltre, si potrebbe studiare il ruolo delle proteine messaggere nucleari delle sinape nelle malattie che coinvolgono l'ippocampo.

Ad esempio, il morbo di Alzheimer.