Endoteliali Tubo cellulare saggio Formazione per la In Vitro Studio di Angiogenesi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di determinare geni o vie coinvolte nell'angiogenesi attraverso l'uso di un metodo in vitro rapido e quantitativo. Ciò si ottiene con il primo siero che affama le cellule endoteliali primarie o immortalizzate il giorno prima del test. Il secondo passo consiste nell'incubare le cellule endoteliali con calcina per 30 minuti, seguito dal lavaggio delle cellule con PBS.

Successivamente, le cellule endoteliali vengono filtrate con trippi per rimuovere i grumi e contate. Il passaggio finale consiste nel combinare le cellule endoteliali con terreni condizionati contenenti possibili fattori angiogenici e dispensarli su un estratto solidificato della membrana basale. In definitiva, la microscopia ottica o fluorescente viene utilizzata per visualizzare le reti di tubi, che possono quindi essere quantificate utilizzando programmi informatici specializzati.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi per l'angiogenesi con saggio è che è facile da impostare, relativamente poco costosa, produce tubuli in poche ore ed è quantificabile dimostrando questa tecnica. Erica Bullwinkle, una studentessa laureata nel dipartimento di biologia dell'American University? Utilizzando il terreno appropriato, trasferire tre cellule B 11 in un nuovo pallone due giorni prima di iniziare il test per ottenere i migliori risultati, le cellule devono trovarsi tra il secondo e il sesto passaggio quando vengono utilizzate.

Successivamente, fai crescere le cellule per 24 ore in dmm integrato. Quando le cellule sono pronte, sono affamate di siero. Sostituendo il terreno con un siero ridotto, far crescere le cellule affamate di siero per altre 24 ore.

Per ottenere i migliori risultati, è importante confermare con il produttore che la concentrazione della soluzione madre BME sia di 10 milligrammi per millilitro. Scongelare il fattore di crescita ridotto BME in frigorifero. Poiché il BME si solidifica quando è caldo, viene mantenuto freddo prima dell'uso.

Successivamente, scongelare il terreno necessario per il test per la visualizzazione con fluorescenza o microscopia confocale, aggiungere la calcina AM al terreno a una concentrazione finale di due microgrammi per millilitro, posizionare al buio le cellule marcate con la calcina AM per circa 30-45 minuti. Trascorso questo tempo, rimuovere il terreno e lavare le tre celle B 11 in DPBS. La tripsina successiva è l'aggiunta di un millilitro di tripsina, EDTA Dopo che la tripsina è completa.

Resus sospendere le cellule a un volume finale di 10 millilitri. Nel dmm integrato, rimuovere eventuali grumi dalle cellule filtrandoli attraverso un colino cellulare da 100 micrometri. Dopo aver contato le cellule resus, sospenderle alla corretta concentrazione finale per iniziare il raffreddamento del saggio di formazione delle provette.

Una piastra da 24 pozzetti e puntali da un millilitro per 20-30 minuti prima del caricamento. In questo modo si evita che il BME si solidifichi prematuramente quando è pronto per iniziare a pipettare 250 microlitri di BME a fattore di crescita ridotto in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Evitare la formazione di bolle non premendo la pipetta fino all'arresto finale.

Durante il pipettaggio, una volta caricati i pozzetti, verificare che al centro del pozzetto rimanga una quantità sufficiente di BME. Quando si forma il menisco, se la matrice è troppo sottile, le cellule formeranno solo un monostrato. Successivamente, incubare la piastra per 30 minuti per solidificare il BME.

Una volta che il BME si è solidificato, mescolare circa 300 microlitri di terreno condizionato con 10 microlitri di tre cellule B 11 risospese e aliquotare la sospensione cellulare nei pozzetti della piastra. Dopo aver posizionato la piastra nell'incubatore, i tubi inizieranno a formarsi entro due o quattro ore, a seconda della concentrazione del fattore angiogenico nella condizione in cui si verifica un picco di formazione del tubo del fluido, tra tre e 12 ore. La tempistica del test dovrà essere ottimizzata per le singole condizioni di studio.

I tubi spesso iniziano a deteriorarsi entro 18 ore e le cellule endoteliali subiscono l'apoptosi al momento del picco di formazione del tubo. Aspirare con cura il fluido dal pozzo per evitare di interrompere la rete di tubi. Quindi, lavare ogni pozzetto con un millilitro di DPBS per una visualizzazione immediata.

Aggiungere un millilitro di DPBS fresco a ciascun pozzetto e visualizzare la rete di tubi su un microscopio confocale per fissare una rete di tubi per una successiva visualizzazione. Aggiungere il 4% di paraldeide a ciascun pozzetto aspirato e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente Dopo aver rimosso la paraformaldeide, lavare due volte con DPBS e quindi aggiungere un millilitro di DPBS fresco a ciascuno. Ebbene, queste immagini mostrano che i fattori angiogenici secreti dal topo, dai cheratinociti o dai fibroblasti sono in grado di indurre la formazione di tubi.

Nel tempo, le cellule endoteliali migrano e iniziano a formare piccoli rami entro una o due ore dalla placcatura. La massima formazione del tubo è stata raggiunta da quattro a sei ore. Entro 24 ore rimanevano alcuni rami, ma molte delle cellule diventavano apoptotiche e i tubi cominciavano a disconnettersi.

Il numero di cellule ha un profondo impatto sulla formazione del tubo. Quando viene seminato un numero insufficiente di cellule, si formano poche provette e la rete è minima, man mano che vengono seminate più cellule, la rete di tubi diventa più estesa. Tuttavia, a una concentrazione troppo alta, le cellule iniziano a raggrupparsi o a formare monostrati e le differenze tra i gruppi di trattamento diventano mascherate, le cellule dovrebbero avere un minimo di due passaggi per garantire un'adeguata formazione del tubo.

Il tasso di crescita di tre B 11 è così rapido che il 25% del passaggio cellulare di un giorno produrrà un pallone confluente il giorno successivo. Qui, l'immagine J con il plugin per l'angiogenesi viene utilizzata su una rete di tubi di colorazione AM di calcina per rilevare i nodi totali, i tubi in mesh in combinazione e fusi sulla rete. Inoltre, questo programma può essere utilizzato per rilevare individualmente nodi, tubi o mesh, che possono essere quantificati.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'angiogenesi in vitro in modo rapido e affidabile, evitando le insidie comuni.