Endoteliali Tubo cellulare saggio Formazione per la

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare i geni o le vie coinvolte nell'angiogenesi attraverso l'utilizzo di un metodo in vitro rapido e quantitativo. Ciò viene ottenuto innanzitutto sottoponendo le cellule endoteliali primarie o immortalizzate a digiuno sierico il giorno precedente il saggio. Il secondo passaggio consiste nell'incubare le cellule endoteliali con calcine per 30 minuti, seguito da un lavaggio delle cellule con PBS.

Successivamente, le cellule endoteliali vengono trattate con tripsina, filtrate per rimuovere gli aggregati e contate. L'ultimo passaggio consiste nell'unire le cellule endoteliali a un mezzo condizionato contenente possibili fattori angiogenici e distribuirle sopra un estratto di membrana basale solidificato. Infine, si utilizza microscopia ottica o fluorescente per visualizzare le reti tubulari, che possono quindi essere quantificate mediante programmi informatici specifici.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi per il saggio dell'angiogenesi è che è semplice da allestire, relativamente economica, produce tubuli entro poche ore ed è quantificabile, dimostrando tale tecnica. È Erica Bullwinkle, una studentessa laureanda del dipartimento di biologia della American University? Utilizzando il mezzo appropriato, trasferire tre cellule B11 in un nuovo fiasco due giorni prima di iniziare il saggio; per ottenere i migliori risultati, le cellule devono essere comprese tra il secondo e il sesto passaggio quando vengono utilizzate.

Successivamente, coltivare le cellule per 24 ore in dmm supplementato. Quando le cellule sono pronte, sottoporle a siero privazione. Sostituendo il mezzo con un mezzo a basso contenuto di siero, coltivare le cellule sottoposte a siero privazione per ulteriori 24 ore.

Per ottenere i migliori risultati, è importante verificare con il produttore che la concentrazione della soluzione madre di BME sia di 10 milligrammi per millilitro. Scongelare la BME con fattore di crescita ridotto in frigorifero. Poiché la BME si solidifica a temperatura ambiente, va mantenuta fredda prima dell'uso.

In seguito, scongelare il mezzo necessario per il saggio per la visualizzazione mediante microscopia a fluorescenza o microscopia confocale e aggiungere il calcineurio AM al mezzo a una concentrazione finale di due microgrammi per millilitro; incubare le cellule marcate con calcineurio AM al buio per circa 30-45 minuti. Trascorso questo tempo, rimuovere il mezzo e lavare le cellule TIB-11 in DPBS. Successivamente, trattare le cellule con tripsina aggiungendo un millilitro di tripsina-EDTA. Al termine della digestione con tripsina.

Risospendere le cellule in un volume finale di 10 millilitri. Nel dmm supplementato, rimuovere eventuali aggregati cellulari filtrando attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri. Dopo aver contato le cellule risospese, sospenderle alla concentrazione finale corretta per iniziare il saggio di formazione dei tubuli in condizioni di freddo.

Una piastra a 24 pozzetti e le punte da un millilitro per 20-30 minuti prima del caricamento. Questo impedisce che la BME si solidifichi prematuramente. Quando si è pronti, pipettare 250 microlitri di BME con fattore di crescita ridotto in ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Evitare la formazione di bolle non premendo la pipetta fino all'arresto finale.

Quando si pipetta, una volta caricati i pozzetti, verificare che rimanga una quantità sufficiente di BME al centro del pozzetto. Quando si forma il menisco, se la matrice è troppo sottile, le cellule formeranno soltanto un monostrato. Successivamente, incubare la piastra per 30 minuti per far solidificare il BME.

Una volta che il BME si è solidificato, mescolare circa 300 microlitri di mezzo condizionato con 10 microlitri di cellule B11 tre sospese e suddividere il sospensione cellulare nei pozzetti della piastra. Dopo aver posizionato la piastra nell'incubatore, i tubuli inizieranno a formarsi entro due-quattro ore; a seconda della concentrazione del fattore angiogenico nel mezzo condizionato, il picco di formazione dei tubuli può verificarsi tra le tre e le 12 ore. I tempi del saggio dovranno essere ottimizzati in base alle singole condizioni dello studio.

I tubi spesso iniziano a deteriorarsi entro 18 ore, e le cellule endoteliali andranno incontro ad apoptosi al momento della formazione massima dei tubi. Aspirare con attenzione il mezzo di coltura dal pozzetto per evitare di alterare la rete tubulare. Successivamente, lavare ogni pozzetto con un millilitro di DPBS per una visualizzazione immediata.

Aggiungere un millilitro di DPBS fresco in ogni pozzetto e acquisire un'immagine della rete tubulare al microscopio confocale per fissare la rete tubulare per una successiva visualizzazione. Aggiungere paraformaldeide al 4% in ogni pozzetto aspirato e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso la paraformaldeide, lavare due volte con DPBS e quindi aggiungere un millilitro di DPBS fresco in ogni pozzetto. Queste immagini mostrano che i fattori angiogenici secreti da cheratinociti o fibroblasti di topo sono in grado di indurre la formazione di tubuli.

Nel tempo, le cellule endoteliali migrano e iniziano a formare piccoli rami entro una o due ore dalla semina. La formazione massima di tubuli viene raggiunta tra le quattro e le sei ore. Dopo 24 ore, alcuni rami rimangono, ma molte cellule diventano apoptotiche e i tubuli iniziano a disconnettersi.

Il numero di cellule ha un impatto notevole sulla formazione di tubuli. Quando viene seminato un numero insufficiente di cellule, si formano pochi tubuli e la rete risulta minima; aumentando il numero di cellule seminate, la rete di tubuli diventa più estesa. Tuttavia, a concentrazioni troppo elevate, le cellule iniziano ad aggregarsi o a formare monociti, e le differenze tra i gruppi trattati risultano mascherate. Le cellule dovrebbero avere un minimo di due passaggi per garantire una formazione adeguata di tubuli.

Il tasso di crescita di tre B 11 è così rapido che il 25% delle cellule passate in un giorno produrrà un flacone confluenziale il giorno successivo. Qui, ImageJ con il plugin per l'angiogenesi viene utilizzato su una rete di tubi colorati con calcine AM per rilevare il numero totale di nodi, tubi nella rete e maglie in combinazione, e fusi sulla rete. Inoltre, questo programma può essere utilizzato per rilevare singolarmente nodi, tubi o maglie, che possono essere quantificati.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'angiogenesi in vitro in modo rapido e affidabile, evitando al contempo errori comuni.