Name: Nanopodia - sottili, fragili Proiezioni membrana con ruoli in movimento delle cellule e interazioni intercellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-03T15:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Scopri come visualizzare i nanopodi nelle cellule endoteliali e tumorali mediante immunofluorescenza TM4SF1. Questo metodo preserva le fragili proiezioni membranali per studiare movimento cellulare e interazioni intercellulari.

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Noi riconosciamo il dottor Harold Dvorak per utili discussioni, tra cui il suggerimento di provare fissazione in 37 ° C PFA. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere P01 CA92644 e da un contratto della Fondazione Nazionale per la Ricerca sul Cancro.

1. Coltura cellulare sul collagene rivestito disco di vetro <ol><li> Dischi Luogo di vetro (12 mm di diametro) in un barattolo di vetro (4 oz) e autoclave per sterilizzare i dischi. </li><li> Mettete 25 ml di etanolo al 70% in un tubo Falcon da 50 ml e metterlo in una cappa di coltura cellulare. Questa soluzione può essere riutilizzato più volte fino a quando il livello della soluzione scende a 20 ml. </li><li> Posizionare una pinza nitide con un punto extra fine in etanolo al 70% per 5 minuti prima di utilizzarlo per gestire il disco di vetro. </li><li> Rimuovere con cautela la pinza dal tubo e chiudere il tappo, quindi inserire delicatamente i etanolo trattati pinza sulla parte superiore del tubo di aria secca per 2 min. Non permettere che la punta delle pinze per toccare nulla nel cofano. </li><li> Utilizzare le pinze sterili per afferrare un disco di vetro sterile fuori del vaso di vetro e metterla in un pozzetto della piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti. Ripetere l&#39;operazione fino a quando il numero desiderato di pozzetti è stato popolato con dischi. </li><li> Mettete 500 ml di soluzione di collagene bovino (50 ng / ml) in ciascun pozzetto contenente un disco di vetro e porlo in 37 ° C, 5% CO 2 incubatore di coltura cellulare per almeno 30 min. Non vi è nulla di male in un incubazione più lungo. </li><li> Harvest HUVEC (cellule umane ombelicale Vena endoteliali) o PC3 (prostata cellule tumorali) che erano già coltivate in 150 millimetri piastra di coltura cellulare attraverso tripsinizzazione e bloccano l&#39;attività tripsina utilizzando il suo terreno di coltura completo. Raccogliere le cellule in una provetta Falcon da 15 ml. </li><li> Contare il numero di cellulare e assicurarsi che la redditività è superiore al 90%. </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione a 200 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante. </li><li> Utilizzare il mezzo di coltura per diluire le cellule a 10 5 cellule / ml. Posizionare cellule su ghiaccio. </li><li> Aspirare il collagene nella cappa coltura cellulare e posizionare delicatamente 500 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto in cui i dischi di vetro sono state fase solida con collagene. 5 x 10 4 cellule / pozzetto della piastra a 24 pozzetti darà il 60% confluency per HUVEC e il 30% di confluenza di cellule PC3. Nota: aggiungi sospensione più cellulare per densità delle cellule superiore. </li><li> Cultura le celle di una 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 1 ora, 2 ore, 4 ore, 6 ore, o 24 ore per tracciare le attività nanopodia e il passaggio delle cellule. Tipicamente, le cellule saranno allegare al disco di vetro nei primi 30 min, poi iniziano a polarizzare e migrare nella prima ora, e svolgono interazioni intercellulari e divisione cellulare nelle ore successive. </li></ol> 2. Fissazione delle cellule <ol><li> Ogni bene avrà bisogno di 500 microlitri 4% PFA (paraformaldeide) per fissare le cellule. Sia fabbricata commercialmente o appena fatto 4% PFA può essere utilizzato. Calcolare la quantità di PFA necessario in base al numero di pozzetti preparati, e posizionare PFA in un tubo Falcon da 15 ml. ATTENZIONE: paraformaldeide è un sospetto cancerogeno. </li><li> Inserire il tubo falco in uno stand di polistirolo che era già in atto in un 37 ° C incubatore. Lasciare il tubo in incubatrice per 30 min alla guerram il PFA a 37 ° C. </li><li> Posizionare una piastra elettrica nel cofano cultura e accenderlo. </li><li> Estrarre la piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti e preriscaldata PFA fuori dell&#39;incubatore e collocarlo sulla parte superiore del pad di riscaldamento. </li><li> Utilizzare una sola mano per aspirare il mezzo da un pozzo, e subito dopo utilizzare l&#39;altra mano per far scorrere delicatamente 500 microlitri PFA nel pozzo attraverso il bordo bene. Per facilitare l&#39;aspirazione, inclinare la piastra di coltura a circa 45 °, appoggiandola contro il supporto polistirolo in modo che sia stabile a tale angolo. Ciò faciliterà l&#39;aspirazione e l&#39;aggiunta di soluzione PFA al pozzo senza disturbare le cellule in coltura. Questo è il passo più importante per preservare la struttura cellulare delle attività cellulari. </li><li> Ripetere il processo fino a quando tutti i pozzetti con un disco di vetro hanno ricevuto PFA. Nota: tutti i passi che devono cambiare soluzione pre-esistente dal pozzo si applicano stesse procedure di aspirazione. </li><li> Porre la piastra in 37 ° C per 5 min. </li&gt; <li> Prendere la piastra posteriore alla cappa cultura e inclinare contro Styrofoam come descritto al punto 2.5. Con una mano per trasferire delicatamente la PFA dal pozzo in un tubo di raccolta; utilizzare l&#39;altra mano per posizionare subito dopo almeno 500 microlitri camera temperatura PBS nel pozzo. Dopo che tutti i pozzetti sono stati lavati, tornare e ripetere il lavaggio PBS ancora una volta in ogni bene. Svuotare la raccolta PFA in un contenitore per rifiuti pericolosi. </li><li> Preparare tampone di bloccaggio ICC con l&#39;aggiunta di 2% siero fetale bovino da PBS. Sodio azide 0,04% (diluito dal 20% soluzione madre) è aggiunto come conservante. ATTENZIONE: sodio azide è un composto tossico. Il tampone può essere conservato in 4 ° C per un lungo periodo di tempo senza contaminazione batterica. </li><li> Con la piastra di coltura ancora inclinata contro uno stand, ancora una volta, il ciclo attraverso ogni bene aspirando per rimuovere PBS e subito dopo l&#39;aggiunta di 500 ml di ICC tampone di bloccaggio. Le cellule sono ora pronti per immunofluorescenza. Se necessario, lacellule fisse possono essere memorizzati in un frigorifero a 4 ° C per una settimana senza significativa perdita di proteine ​​TM4SF1. </li></ol> 3. TM4SF1 immunofluorescenza colorazione di Nanopodia <ol><li> In ogni pozzetto, sostituire il tampone bloccante 500 microlitri ICC con un nuovo tampone di bloccaggio contenente 0,01% Triton X-100 e lasciare riposare a temperatura ambiente per 1 ora. Non utilizzare superiore a 0,03% Triton X-100 in cui solleverà TM4SF1 dalle membrane cellulari. PBS lavato cellule dal punto 2.10 possono essere spostati direttamente al tampone bloccante contenente Triton se la colorazione è pronta per essere avviata immediatamente. </li><li> Diluire l&#39;anticorpo primario anti-TM4SF1 (o anti-CD9) a 0,5 mg / ml a ICC tampone di bloccaggio. </li><li> In ogni pozzetto, rimuovere il tampone Triton ICC/0.01% e sostituirlo con 300 microlitri della soluzione anti-TM4SF1-anticorpo. Incubare 2 ore a temperatura ambiente o lasciare per una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare ogni pozzetto con non meno di 500 microlitri di PBS. Ripetere 3x; ogni volta dare a least 5 min di tempo di incubazione. </li><li> Preparare una soluzione di anticorpo e phalloidin secondario ICC tampone di bloccaggio, utilizzando una diluizione 1.000 volte di Alexa 488 marcato asino anti-topo anticorpo secondario (2 mg / ml concentrazione finale) e 1000 x diluizione falloidina (50 ng / ml concentrazione finale). </li><li> Rimuovere PBS e aggiungere 300 ml di anticorpo secondario e la soluzione phalloidin ad ogni pozzetto e incubare per 2 ore o lasciare tutta la notte a 4 ° C. </li><li> Ripetere i passaggi di lavaggio PBS con almeno 5 minuti di incubazione per lavaggio. In ultimo lavaggio, lasciare ogni bene in PBS per 1 ora. </li><li> Cada una sola goccia (~ 10 ml) di fissaggio anti-sbiadimento media su un vetrino. </li><li> Piegare la punta di un 19 G 1 ½ in siringa 90 ° premendo delicatamente su una superficie dura. Con una mano tenere l&#39;ago piegato e sollevare delicatamente un disco di vetro dal pozzo, e utilizzare l&#39;altra mano per afferrare il disco usando le pinze taglienti. </li><li> Ruotare il disco di vetro &amp;# 160; rivolto verso il basso lasciando il contatto lato della cella del supporto di montaggio sul vetrino. Inserire delicatamente il disco di vetro e lasciare asciugare durante la notte in un luogo buio a temperatura ambiente. </li><li> Procedere con l&#39;immagine immunofluorescenza macchiato nanopodia, o conservare le diapositive in una scatola di diapositive a -20 ° C. Le diapositive resteranno visibili per alcuni mesi in -20 ° C. </li></ol>

<ol><li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+actin%3A+matching+assembly+factors+with+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).</li>
<li>Shih, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L6+protein+TM4SF1+is+critical+for+endothelial+cell+function+and+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis.</a> Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).</li>
<li>Zukauskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TM4SF1%3A+a+tetraspanin-like+protein+necessary+for+nanopodia+formation+and+endothelial+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration.</a> Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).</li>
<li>Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+effects+of+L6%2C+an+IgG2a+antibody+that+reacts+with+most+human+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).</li>
<li>Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+and+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imag%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging and stem cell research.</a> Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).</li>
<li>Hemler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraspanin+functions+and+associated+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tetraspanin functions and associated microdomains.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).</li>
<li>Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+thymosin+beta-10+by+early+passage+and+senescent+vascular+endothelium+is+modulated+by+VPF%2FVEGF%3A+evidence+for+senescent+endothelial+cells+in+vivo+at+sites+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB%22%5BJournal%5D)">Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis.</a> FASEB. 15, 458-466 (2001).</li>
<li>Itoh, T. J., Hotani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+and+the+regulation+by+microtubule-associated+proteins+%28MAPs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Uchu+Seibutsu+Kagaku%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs).</a> Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).</li>
<li>Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-jump+studies+of+microtubule+dynamic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability.</a> J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).</li>
<li>Pollice, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+paraformaldehyde+and+methanol+fixation+for+simultaneous+flow+cytometric+analysis+of+DNA%2C+cell+surface+proteins%2C+and+intracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins.</a> Cytometry. 13, 432-444 (1992).</li>
<li>Macarulla, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+solubilization+by+the+non-ionic+detergent+triton+X-100.+A+comparative+study+including+model+and+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Espanola+de+Fisiologia%22%5BJournal%5D)">Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes.</a> Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).</li>
<li>Koley, D., Bard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triton+X-100+concentration+effects+on+membrane+permeability+of+a+single+HeLa+cell+by+scanning+electrochemical+microscopy+%28SECM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).</li>
<li>Chang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD13+%28aminopeptidase+N%29+can+associate+with+tumor-associated+antigen+L6+and+enhance+the+motility+of+human+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Nanopodia sono sottili canali di membrana cellulare che attaccano saldamente alla matrice attraverso TMED e può estendersi più di 100 micron da una cella cellulare polarizzata di percepire l&#39;ambiente e mediare le interazioni intercellulari 2,3. Nanopodia aderire alla matrice così fermamente che i residui sono lasciati alle spalle come le cellule si allontana (figure 1 e 2). Nanopodia permettono quindi di studiare come le cellule percepiscono il loro ambiente e determinare...

Durante la polarizzazione per il movimento, cellule animali si estendono una serie di dinamiche, protrusioni di membrana dalle loro superfici, tra cui filopodia, lamellipodia, fibre di retrazione, e volant 1. Recentemente aggiunto a questa lista fosse nanopodia, un tipo recentemente riconosciuta sottile (100-300 micron di diametro), allungato (fino a 50-100 micron), membrana di proiezione che forniscono canali di membrana per l&#39;estensione delle strutture di F-actina come filopodia e fibra di svincolo e quella macchia positivamente con TM4SF1 (transmembrana-4-L-sei-famiglia-1) in endoteliali tumorali e cellule in coltura 2,3. TM4SF1 è una proteina con topologia tetraspanin-come originariamente conosciuto come un antigene sulla cellula tumorale 4 prima della scoperta che la molecola è un biomarker cellule endoteliali che gioca un ruolo essenziale nella proliferazione delle cellule endoteliali e la migrazione 2,3. Immunofluorescenza ha rivelato che TM4SF1 è localizzato perinucvescicole Lear e alla membrana plasmatica, e si arricchisce in TM 4SF1 e nriched micro omains d (TMED). TMED ancoraggio nanopodia alla matrice e presente in uno schema a fasce regolarmente distanziate di 1-3 lunghezza TMED / micron di nanopodia. Nanopodia tipicamente estendono dalla porta anteriore di una cella e finali posteriore durante polarizzazione cellulare per il movimento. A causa della natura aderente ditta di TMED, nanopodia sono in grado di rientrare nella cella mentre si allontana; residui nanopodia abbandonati tracciano così il percorso del movimento cellulare. Nanopodia fornire canali di membrana per l&#39;estensione F-actina e retrazione, e sono siti di interazioni intercellulari e comunicazioni 2,3. Queste caratteristiche fanno sì che nanopodia offrono un&#39;opportunità unica di studiare i meccanismi alla base di montaggio F-actina durante la polarizzazione cellulare, rilevamento cellulare dell&#39;ambiente, la determinazione del percorso e la direzione del movimento delle cellule, e le interazioni intercellulari unnd comunicazioni. A causa della natura altamente idrofoba TMED e la natura membranoso sottile e fragile di nanopodia, particolare attenzione deve essere presa al fine di preservare TMED e nanopodia. La distruzione di nanopodia e la rimozione di TMED con metodi di laboratorio più comuni è un possibile motivo per cui solo sessantatré pubblicazioni sono apparsi su TM4SF1 fin dalla sua prima scoperta nel 1986 1 e per la totale mancanza di conoscenza di TM4SF1 arricchimento 100-300 micron microdomini su superficie delle cellule fino alla relazione del TM4SF1 in cellule endoteliali nel 2009 2. Metodi di immunoistochimica convenzionali comunemente utilizzare solventi organici come etanolo, metanolo, acetone o riparare cellule e usare 0,1% o maggiore concentrazione di Triton X-100 per permeabilize celle 5. Gli studi qui descritti implementati tre importanti modifiche al metodo convenzionale per rivelare TMED e nanopodia: (i) utilizzano 37 ° C 4% PFA e fissare le cellule a 3776; C incubatore, (ii) applicare dolce temperatura ambiente lavaggio PBS, e (iii) utilizzare meno dello 0,03% Triton X-100 solo brevemente permeabilize celle prima aggiunta di anticorpo primario, come Triton X-100 superiore a 0,03% estrarrà TM4SF1. Tutti tetraspanine formano microdomini sulla membrana cellulare 6 e alcuni colocalize con TMED in endoteliali e cellule tumorali 2,3. Come tetraspanine come CD9, CD81 e CD151 sono espressi ubiquitariamente, il protocollo di colorazione qui descritto può essere estesa a diversi tipi di cellule che mancano TM4SF1 per il controllo della funzione nanopodia.

<table><tbody><tr><td>Dischi di vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td> Barattolo di vetro <td>da 12 mm di diametro</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>02-912-310</td><td>Barattoli dritti in vetro trasparente pulito certificato,</td></tr><tr><td>vetrino in vetro</td> da 4 once <td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td>Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Vetrini Tubo</td></tr><tr><td>Falcon da 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Provetta da centrifuga conica in polipropilene ad alta trasparenza da 50 ml, grado di protezione 16.000 RCF. Sterile.</td></tr><tr><td>Provetta Falcon da 15 ml con rack in polistirolo</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>Corning Provette da centrifuga in PP da 15 ml</td></tr><tr><td>Pinze affilate</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-42</td><td>Pinze per schegge appuntite extra fini da</td></tr><tr><td>24 pozzetti</td> per colture cellulari <td>BD Bioscience</td><td>353047</td><td>Piastra per colture cellulari da</td></tr><tr><td>150 mm Piastra per colture cellulari</td><td>BD Bioscience</td><td>353025</td><td>da 150 mm</td></tr><tr><td>19 G 1 &frac12; Ago per siringa</td><td>BD Bioscience</td><td>309635</td><td>19 G 1 &frac12;</td></tr><tr><td>Laboratori Decon di</td> <td>etanolo</td>, Inc.<td>2701</td><td>Decon's Pure Ethanol 200 Proof</td></tr><tr><td>Soluzione di collagene</td><td>BD Bioscience</td><td>354249</td><td>Collagene I, alta concentrazione, coda di ratto, 100 mg</td></tr><tr><td>di tripsina/EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td>0,25% tripsina-EDTA 1x</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>DMEM ad alto glucosio (1x), liquido, con L-glutammina, senza piruvato di sodio</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Affymetrix</td><td>75889 5 LT</td><td>PBS, 10x Soluzione, pH 7,4</td></tr><tr><td>PFA (paraformaldeide)</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td>4% in PBS</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500ML</td><td>Siero fetale bovino</td></tr><tr><td>EGM2-MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml e EGM-2 SingleQuot Kit Supplemento & Fattori di crescita</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>Solubilizzato in acqua. Soluzione madre al 4% e concentrazione di lavoro è 0,4%.</td></tr><tr><td>Anticorpo TM4SF1 anti-umano di topo&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>MAB3127</td><td>Epitopo si trova nel dominio extracellulare</td></tr><tr><td>dell'anticorpo CD9 umano del topo&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>555370</td><td>Epitope si trova nel dominio extracellulare</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Asino anti-topo 2nd antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H + L)</td></tr> <tr><td>Falloidina</td><td>Chemicon</td><td>90324</td><td>Falloidina coniugata con rodamina</td></tr><tr><td>Mezzi di montaggio anti-sbiadimento.</td><td>Life Technologies</td><td>P-36931</td><td>Reagente antisbiadimento ProLong Gold con DAPI</td></tr><tr><td>70% etanolo&nbsp;</td><td></td><td></td><td>17,5 ml di etanolo (200 proof) 7,5 ml di acqua a doppia deionizzazione</td></tr><tr><td>10x PBS (per 200 ml)</td><td></td><td></td><td>20 ml di 10x PBS 180 ml di acqua a doppia deionizzazione</td></tr><tr><td>20% Triton X-100 (per 20 ml)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>4 ml di Triton X-100 16 ml di acqua a doppia deionizzazione</td></tr><tr><td>4% NaN3 (per 25 ml)</td><td></td><td></td><td>1 g di NaN3 25 ml di acqua a doppia deionizzazione</td></tr><tr><td>50 ng/ml Soluzione di collagene bovino in PBS (fare 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Soluzione madre da 50 &mu; g/ml (50 ml) 830 &mu; l di Collagene I (3 mg) 50 ml di tampone bloccante PBS</td></tr><tr><td>ICC (50 ml)</td><td></td><td></td><td>49 ml di PBS 2% FBS (aggiungere 1 ml) 0,04% NaN3 (aggiungere 100 &mu; l di 4% NaN3)</td></tr><tr><td>ICC Blocking Buffer/0,01% Triton X-100 (fare 50 ml)</td><td></td><td></td><td>50 ml di ICC Blocking Buffer 25 &mu; l di 20% Triton X-100</td></tr><tr><td>HUVEC&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx">www.lonza.com</a></td></tr><tr><td>PC3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1435</td><td><a href="http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7">www.atcc.org</a></td></tr><tr><td>Cappa per coltura cellulare</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td>NU-425 (Serie 60) Cabina di sicurezza biologica&nbsp;</td></tr><tr><td>37 gradi C, 5% CO2 Incubatore per colture cellulari&nbsp;</td><td>CellStar</td><td>QWJ300DABA</td><td>Cellstar CO2 Cuscinetto riscaldante per incubatore con rivestimento ad acqua</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>K& H Produzione</td><td>1020</td><td>K& H Lectro Kennel Pad riscaldato con copertura in pile libero (<a href="http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5x28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y">www.amazon.com</a>)</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Sorvall</td><td>T6000B</td><td>Sorvall T6000 (B) Emocitometro centrifugo da banco</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Bright-Line</td></tr></tbody></table>

nanopodia - sottili, fragili proiezioni membrana con ruoli in movimento delle cellule e interazioni intercellulari

Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

Cellule aderenti in coltura mantenere uno stato polarizzato per sostenere il movimento e le interazioni intercellulari. Nanopodia sono sottili, di forma allungata, in gran parte F actina-negativo-proiezioni di membrana in cellule endoteliali e tumorali che possono essere visualizzati attraverso TM4SF1 (transmembrana-4-L-sei-famiglia-1) immunofluorescenza. Cluster TM4SF1 di 100-300 micron di diametro TMED (TM 4SF1 e nriched micro omains d) contenente da 3 a ben 14 singoli TM4SF1 molecole. TMED sono disposte in modo intermittente lungo nanopodia ad una distanza regolare di 1 a 3 TMED per μ m ed ancorare saldamente nanopodia a matrice. Ciò consente nanopodia di estendere oltre 100 μ m dalla porta anteriore o posteriore finale delle cellule endoteliali tumorali o polarizzati, e fa sì che i residui di membrana di essere lasciato in matrix quando la cella si allontana. TMED e nanopodia sono stati trascurati a causa della loro estrema fragilità e sensibilità alla temperatura. Lavaggio di routine e la fissazione disturbare la struttura. Nanopodia sono conservate mediante fissaggio diretto in paraformaldeide (PFA) a 37 ° C, seguito da una breve esposizione al 0,01% Triton X-100 prima della colorazione. Nanopodia aprire nuovi orizzonti in biologia cellulare: promettono di rimodellare la nostra comprensione di come le cellule percepiscono il loro ambiente, rilevare e identificare altre cellule a distanza, avviare interazioni intercellulari a stretto contatto, e dei meccanismi di segnalazione coinvolte nel movimento, la proliferazione, e la cella -CELL comunicazioni. I metodi che sono sviluppati per lo studio nanopodia TM4SF1-derivati ​​possono essere utili per gli studi di nanopodia che si formano in altri tipi di cellule attraverso l&#39;agenzia di tetraspanine classici, in particolare il ubiquitariamente espressa CD9, CD81 e CD151.

Per la Fase 1: Se le cellule (come HUVEC e PC3 utilizzato in questo studio) sono in grado di crescere normalmente, le cellule si attaccano al disco collagene rivestite entro 30 minuti dopo che sono teste di serie, polarizzano e diventano mobili poco dopo, e si estendono nanopodia prima del loro percorso di movimento. figure 1A e 1B mostrano rispettivamente una polarizzata e proliferanti HUVEC. Figura 2A mostra cellule PC3 polarizzate in uno sta...

Nanopodia sono canali di membrana sottile ma fragili che si estendono fino a 100 micron dai principali anteriore o posteriore finale di una cella e percepiscono l&#39;ambiente cellulare. Fissaggio diretto a 37 ° C, lavaggio delicato, e di evitare di solventi organici come l&#39;etanolo, metanolo o acetone e di maggiori Triton X-100 le concentrazioni sono tenuti ad osservare queste strutture cellulari.

Nanopodia - sottili, fragili Proiezioni membrana con ruoli in movimento delle cellule e interazioni intercellulari

Adherent cells in culture maintain a polarized state to support movement and intercellular interactions. Nanopodia are thin, elongated, largely ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare i nanopodi attraverso la colorazione immunofluorescente in cellule in coltura. In vitro. Ciò si ottiene coltivando prima le cellule di interesse su dischi di vetro rivestiti di collagene.Nella seconda fase, le cellule vengono fissate al disco con PFA caldo, quindi le cellule vengono lavate e quindi incubate in tampone bloccante per un'ora a temperatura ambiente. Nella fase finale, le cellule vengono colorate con anticorpi contro TM 4, SF 1 e montate su un vetrino. In definitiva, la presenza di estensioni dei nanopodi nelle cellule mobili proliferanti o interagenti può essere visualizzata mediante microscopia a immunofluorescenza.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia e alla diagnosi dei tumori umani perché il movimento di proliferazione delle cellule endot e tumorali e le interazioni intercellulari sono processi chiave coinvolti nell'angiogenesi e nella crescita delle cellule tumorali. A dimostrare la procedura saranno due magri, un postdoc di un laboratorio Iniziare con l'autoclavaggio di dischi di vetro da 12 millimetri in un barattolo di vetro da quattro once mentre i dischi vengono sterilizzati. Inserire una provetta conica da 50 millilitri contenente 25 millilitri di etanolo al 70% in una cappa per colture cellulari.Metti una pinza affilata con una punta extra fine nell'etanolo per cinque minuti, quindi rimuovi con cura la pinza e tappa il tubo, posizionando la pinza sopra il tubo per asciugarla all'aria per due minuti. Quando le pinze sono asciutte, posizionare un disco di vetro sterile per pozzetto in uno dei pozzetti desiderati di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti. Quindi coprire ogni disco con 500 microlitri di soluzione di collagene bovino e posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti.Mentre i dischi sono in incubazione, gocciolano e guardano le cellule di interesse, interrompendo la reazione con terreni di coltura completi. Quando le cellule si sono staccate, raccogli le cellule galleggianti in una provetta Falcon da 15 millilitri e poi contale dopo aver confermato che la loro vitalità è superiore al 90%Pellet le celle per 10 minuti a 200 G e quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e quindi diluire le cellule a una volta da 10 a una quinta cellula per millilitro in terreni di coltura cellulare e posizionare le cellule sul ghiaccio.Ora aspirare la soluzione di collagene da ciascun pozzetto nella cappa di coltura cellulare, quindi erogare delicatamente 500 microlitri di cellule su ciascuna coltura di dischi rivestiti di collagene. Le cellule per il tempo appropriato per tracciare le attività dei nanopodi e il passaggio cellulare. In genere, le cellule si attaccano al disco di vetro nei primi 30 minuti, iniziano a polarizzarsi e migrare nella prima ora ed eseguono interazioni intercellulari e divisione cellulare nelle ore successive per fissare le cellule prima riscaldano abbastanza PFA per tutti i dischi in un incubatore a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Quindi posizionare un termoforo nella cappa di coltura. Accendilo, quindi posiziona il PFA di preriscaldamento sopra il termoforo. L'aggiunta di PFA ai dischi è il passaggio più cruciale per preservare la struttura cellulare originale delle attività cellulari per facilitare la rimozione del terreno di coltura e l'aggiunta del PFA senza disturbare le cellule in coltura, coda la piastra a circa 45 gradi, appoggiandola a un supporto di polistirolo in modo che sia stabile all'angolo Usando una mano.Quindi, aspirare il terreno da ciascun pozzetto, quindi utilizzare immediatamente l'altra mano per far scivolare 500 microlitri di PFA in ciascun pozzetto attraverso il bordo del pozzetto e incubare i dischi per altri cinque minuti. Quindi, rimuovere il PFA come appena dimostrato per i terreni di coltura cellulare, erogando il PFA usato in una provetta di raccolta con una mano e sostituendo immediatamente il PFA con 500 microlitri di PBS a temperatura ambiente con l'altra dopo che i pozzetti sono stati lavati due volte con PBS, rimuovere il lavaggio finale con PBS come appena dimostrato e aggiungere 500 microlitri di tampone bloccante immunochimico a ciascun disco. Per visualizzare i nanopodi mediante microscopia a fluorescenza, sostituire prima il tampone di blocco immunocitochimico in ciascun pozzetto con un tampone bloccante 0,01% di tritton X 100 a temperatura ambiente per un'ora.Quindi sostituire il tampone bloccante tritton con 300 microlitri di soluzione anticorpale anti TM four SF one appena diluita per due ore a temperatura ambiente. Quindi, lavare ogni disco tre volte con PBS come appena dimostrato, lasciando il PBS sui dischi per cinque minuti durante ogni lavaggio dopo l'ultimo lavaggio. Incubare ogni pozzetto con 300 microlitri di anticorpo secondario appena diluito e soluzione Phin e incubare i dischi per altre due ore a temperatura ambiente.Ora lavate nuovamente i dischi tre volte, lasciando il lavaggio finale PBS nei pozzetti per un'ora. Quindi, con una singola goccia da 10 microlitri di Antifa, il supporto di montaggio su un vetrino per ogni disco. Quindi, piega delicatamente la punta di un ago per siringa da 19 gauge, un pollice e mezzo di 90 gradi su una superficie dura.Quindi, tenendo l'ago in una mano, sollevare delicatamente il disco di vetro uno per uno usando una pinza affilata per afferrare il disco con l'altra mano. Posizionare ciascun disco di vetro rivolto verso il basso sul supporto di montaggio sui vetrini, quindi posizionare con cura i vetrini in un luogo buio a temperatura ambiente per asciugarli durante la notte. I nanopodi colorati possono quindi essere ripresi o conservati in una scatola di vetrini a meno 20 gradi Celsius.Normalmente, le cellule in crescita si attaccheranno ai dischi rivestiti di collagene entro 30 minuti dopo la seduta, si polarizzeranno e diventeranno mobili subito dopo aver esteso i nanopodi prima del loro percorso di movimento. Come dimostrato in queste immagini, l'H-U-V-E-C isolato mostrerà generalmente una morfologia chiaramente polarizzata con proiezioni di f actina alla periferia della cellula incorporate all'interno del nano podi PC tre cellule mostreranno una morfologia polarizzata con i loro nano podi che rivelano il percorso del movimento delle tre cellule PC. Se le cellule sono nello stato di divisione cellulare, come si vede qui in una divisione H-U-V-E-C, i nano podi si attaccano saldamente alla matrice attraverso TM E e permettono all'actina F di estendersi o ritrarsi all'interno dei nano podi.Le interazioni intercellulari che portano alla formazione della giunzione cellulare sono anche comunemente osservate attraverso temperature subottimali dei nanopodi, come mostrato in questi esempi utilizzando la fissazione del PFA a quattro gradi Celsius e il lavaggio freddo con PBS disturbano e distruggono la struttura dei nanopodi nelle cellule polarizzate. Nel freddo le cellule proliferanti di PFA e PBS fredde saranno prive di podi e quindi si osserverà una retrazione della f actina all'interno dei nanopodi. E le lacune alle giunzioni intercellulari saranno prodotte artificialmente poiché i nanopodi sono sottili e lunghe proiezioni di membrana che si attaccano alla matrice extracellulare attraverso il team.L'intensità combinata dovrà probabilmente essere migliorata attraverso le funzioni di luminosità e contrasto nel software di elaborazione delle immagini per rivelare il percorso del movimento cellulare attraverso i residui di nano podi. Come è stato fatto nel riquadro di questa immagine qui, H-U-V-E-C che sono stati coltivati per sei ore dopo la placcatura a una fluenza del 60% di co su un disco di vetro rivestito di collagene, e poi fissati a 37 gradi Celsius, il 4% di PFA come appena dimostrato sono mostrati in questa immagine. I nano podi sono stati rivelati con l'anticorpo anti CD nove e l'actina F è stata colorata con Phin, dimostrando che anche il CD nove si localizza nei nano podi.Seguendo la procedura. Altri metodi, come la citometria a flusso nel sangue occidentale, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio in che modo alcuni trattamenti influenzano i livelli di espressione di TM 4 SF one e quindi influenzano la proliferazione del movimento cellulare e le interazioni intracellulari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il sostegno immunocongelato per studiare il ruolo dei nano podi nel movimento cellulare e nelle interazioni intercellulari.

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