Una rapida e specifica Microplate Assay per la determinazione di ascorbato intra-ed extracellulare in cellule in coltura

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare i livelli di ascorbato intracellulare o extracellulare in cellule coltivate o isolate. Ciò si ottiene incubando estratti cellulari o cellule intere con un punteggio ossidasi per esaurire selettivamente un punteggio BA nelle fasi successive. Nel primo metodo, gli estratti cellulari vengono incubati con cianuro per generare ferro cianuro in modo ascorbato dipendente, il che fornisce una rappresentazione diretta della quantità di ascorbato negli estratti.

Successivamente, la quantità di ferro cianuro formata negli estratti cellulari viene determinata ossidando quantitativamente il ferro cianuro con l'aggiunta di ferro ferrico per formare ferro Ferris al fine di generare un complesso cromogenico di ferro e due felci S che può essere quantificato spettrofotometricamente. Nel secondo metodo, tutte le cellule vengono incubate direttamente con il ferro due chelanti felce S e il citrato ferrico. I risultati mostrano differenze nei livelli di ascorbato intracellulare o extracellulare in base alla riduzione quantitativa e specifica dei complessi extracellulari di ferro che possono essere rilevati.

Spettro. Il vantaggio principale della tecnica attuale rispetto ai metodi già in uso come il rilevamento basato su HBLC è che questo test su micropiastra altamente specifico può essere eseguito molto rapidamente e tutti i campioni e gli standard possono essere elaborati in parallelo piuttosto che in modo seriale Prima di iniziare questa procedura. Coltura K 5 62 cellule in sospensione e creazione in un punteggio BA contenente estratto cellulare.

Successivamente, preparare una soluzione madre di acido ascorbico 10 millimolare in PBS ghiacciato. Quindi preparare con cura una serie di standard di ascorbato tra zero e 20 micromolari. Rimuovere con cautela quattro aliquote da 100 microlitri da ogni standard e aggiungerle a una sequenza orizzontale di pozzetti.

In una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti che contiene 25 microlitri per pozzetto di PBS o 45,5 unità per millilitro. La soluzione madre di L-ascorbato ossidasi o AO in PBS copre la piastra a 96 pozzetti con un foglio e orbitale. Mescolare a 550 giri/min a temperatura ambiente per cinque minuti.

Al termine, aggiungere 50 microlitri di cianuro Ferris di potassio da 3,5 millimolari in PBS a tutti i pozzetti per ottenere una concentrazione finale di cianuro Ferris di un millimolare dopo la miscelazione orbitale della piastra a 96 pozzetti, utilizzando le stesse condizioni di prima. Aggiungere immediatamente 25 microlitri di una soluzione di nuova costruzione contenente il 50% di acido acetico e il 30% di acido tricloroacetico. Quindi, aggiungere 100 microlitri di una soluzione per la determinazione del cianuro Pharaoh appena preparata a ciascun orbitale del pozzetto.

Mescolare la piastra al buio a 550 giri/min per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi leggere i valori di assorbanza dei pozzetti a 593 nanometri. Per iniziare il saggio.

Innanzitutto, ossidare l'ascorbato extracellulare in pozzetti selezionati aggiungendo 50 microlitri di 120 unità per millilitro AO o HBSD a pozzetti accoppiati in triplicato per ottenere una concentrazione finale di AO di 10 unità per millilitro. Seguendo questa etichetta, i pozzetti accoppiati come meno AO e più ao. Dopo aver mescolato le piastre con una delicata miscelazione orbitale per cinque minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere 50 microlitri di Ferne S da 2,4 millimolari a tutti i pozzetti per ottenere una concentrazione finale di felce di 200 micromolari, mescolare le piastre come sopra per cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Successivamente, aggiungere 50 microlitri di citrato ferrico 120 micromolare appena preparato a tutti i pozzetti per ottenere le concentrazioni finali di ferro e citrato rispettivamente di 10 micromolari di ferro e 50 micromolari di citrato. Mescolare bene alla fine del test dell'ascorbato FLX. Aspirare rapidamente il terreno sovrastante da ciascun pozzetto e aggiungerlo ai pozzetti adeguatamente etichettati in una piastra da 24 pozzetti.

Successivamente, aggiungere aliquote di tre microlitri di surnatante a una piastra a 96 pozzetti per determinare l'ascorbato extracellulare. Leggere i valori di assorbanza dei pozzetti a 593 nanometri in uno spettrofotometro per micropiastre. Infine, calcolare la quantità di ascorbato extracellulare come m ascorbato per milligrammo di proteina mostrata.

Ecco una tipica curva standard per un insieme di standard di ascorbato, da zero a 20 micromolari o da zero a due NMO di ascorbato per pozzetto. Della piastra a 96 pozzetti, anche se non mostrata qui, la linearità è mantenuta fino a otto NMO di ascorbato per pozzetto, che corrisponde a una concentrazione di ascorbato del campione di circa 80 micromolari. Il test può essere utilizzato per rilevare con successo livelli di ascorbato inferiori a 0,25 ole ascorbato per pozzetto.

Le cellule K 5 62 accumulano rapidamente ascorbato intracellulare dall'acido ascorbico deidro L extracellulare, ma non dall'ascorbato. In questo esperimento rappresentativo, le cellule K 5 62 sono state incubate in PBS con 500 micromolari di ascorbato deidro L acido ascorbico deidro L acido ascorbico più 50 micromolari di cito B ascorbato più cinque millimolari di cianuro o ascorbato più 50 unità per millilitro AO per 30 minuti a 37 gradi Celsius. L'ascorbato intracellulare è stato determinato come descritto in precedenza.

L'assorbimento dell'acido ascorbico deidro L da parte delle cellule K 5 62 avviene mediante trasporto mediato da glutei trasportatori di glucosio facilitante per valutare il coinvolgimento dei glutei nell'assorbimento dell'acido ascorbico deidro L. In questo esperimento rappresentativo, le cellule K 5 62 sono state incubate con concentrazioni crescenti di cito B o diidro cito B prima dell'incubazione con acido ascorbico deidro L. È importante notare che, mentre sia la citocallina B che la diidrocitocito-B inibiscono i processi mobili a concentrazioni micromolari, solo la cito-callina B, che differisce dalla diidro-cito-B per la presenza di un singolo doppio legame, inibisce il trasporto dipendente dai glutei a basse concentrazioni micromolari.

Pertanto, come deidro L, l'assorbimento dell'acido ascorbico è stato inibito dal cito B con un IC 50 inferiore a 2,5 micromolari, ma non è stato inibito dal diidrocitocito. B deidro. L'assorbimento dell'acido L-ascorbico avviene probabilmente attraverso il trasporto mediato dai glutei.

In alternativa, le cellule lavate sono state esposte a concentrazioni crescenti dell'analogo del glucosio trasportabile, ma non metabolizzabile, del glucosio tre O metilD o dell'isomero stereo L glucosio non trasportabile ai glutei, durante l'incubazione con acido ascorbico deidro L. Ancora una volta, i risultati indicano il coinvolgimento del glu nell'importazione dell'acido ascorbico deidro L poiché l'inibizione dell'accumulo intracellulare di ascorbato si verifica solo in presenza dell'analogo del glucosio trasportabile dal gluteo. Nel secondo saggio.

È possibile determinare il tasso di efflusso di ascorbato dalle cellule in coltura. Questo test specifico è importante in quanto il rilascio di ascorbato dalle cellule sembra essere cruciale per l'assorbimento cellulare regolato dall'ascorbato del ferro non legato alla transferrina da parte delle cellule. L'assorbimento del ferro non legato alla transferrina è considerato rilevante per la fisiopatologia dei disturbi da sovraccarico di ferro, come l'emocromatosi, nonché per lo scambio di ferro dei neuroni degli astrociti e l'omeostasi nel cervello dei mammiferi.

Infatti, il principale neurotrasmettitore eccitatorio L glutammato innesca il rilascio di ascorbato per gli astrociti in un modo che dipende dal glutammato L, dall'assorbimento da parte del vetro, e probabilmente da GLT uno e dal successivo rigonfiamento cellulare che innesca il rilascio di ascorbato da parte di presunti VSO. In analogia, il rilascio di A score bate da A score B caricato con astrociti può essere stimolato dall'aminoacido eccitatorio L aspartato, ma non dall'aminoacido non eccitatorio L glutammina. Questo effetto è illustrato qui, che mostra le curve dose-risposta per la stimolazione del rilascio di ascorbato da parte di aspartato e glutammina da colture primarie di astrociti di topo caricati con ascorbato Una volta padroneggiato.

Questa tecnica può essere eseguita in appena due ore se eseguita correttamente.