Preparazione di DNA-reticolato poliacrilammide idrogel

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare idrogeli in poliacrilammide incrociati con DNA che possano indurirsi o ammorbidirsi mediante l'aggiunta con pipetta di DNA a singolo filamento nel mezzo di coltura dopo che le cellule sono state seminate sulla superficie. Questo viene ottenuto innanzitutto risospendendo separatamente i DNA a singolo filamento SA1, SA2, L2, R2 e di controllo in un tampone e polimerizzando individualmente le soluzioni SA1 e SA2 in un reticolo di poliacrilammide. Il secondo passaggio consiste nel mescolare le soluzioni polimerizzate SA1 e SA2 con la soluzione L2 per formare il gel di DNA.

Successivamente, la soluzione del gel di DNA viene immobilizzata su coprioggetti di vetro utilizzando una colla ottica. L'ultimo passaggio consiste nel funzionalizzare i gel trattandoli con sulsampa e poi con PDL. Infine, le cellule vengono seminate sui gel di DNA e l'elasticità del gel viene modulata aggiungendo R due L due o DNA a singolo filamento come controllo, per ammorbidire, indurire o non modificare rispettivamente l'elasticità del gel.

I risultati di questi esperimenti mostrano che la natura dinamica del substrato sottostante influenza direttamente il comportamento cellulare. Il vantaggio nell'utilizzo di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come CROs, lingo, idrogeli sferici, è che gli idrogeli di DNA non richiedono uno stimolo come UV per modulare la loro elasticità. Invece, gli idrogeli di DNA vengono induriti e ammorbiditi mediante la diffusione di L due o R due, DNA a singolo filamento, all'interno del gel rispettivamente. Prima di tutto, centrifugare il DNA a singolo filamento SA uno liofilizzato a 2000 g per 15 secondi per assicurarsi che tutto il DNA a singolo filamento si trovi sul fondo del tubo.

Dopo la centrifugazione, preparare una soluzione di SA un millimolare aggiungendo 107 microlitri di tampone tris, EDTA o TE 1x al tubo. Riscaldare il tampone SA un NTE a 70 gradi Celsius per cinque minuti o fino a quando il pellet di DNA a singolo filamento è completamente disciolto. Successivamente, preparare la soluzione polimerizzata di SA un aggiungendo 45 microlitri di acrilamide al 40% e 18 microlitri di tampone tribo, EDTA o TBE 10x e centrifugare. Questa miscela per favorire l'omogeneizzazione.

Inserire un puntale P 200, collegarlo a una sorgente di gas azoto ed far passare lentamente il gas azoto nella soluzione per due o tre minuti. Successivamente, centrifugare il campione per 15 secondi a 2000 G per raccogliere la soluzione. Alla fine, aggiungere al campione 4,5 microlitri di solfato di ammonio al 2% o un PS per avviare la polimerizzazione del gel; capovolgere il tubo diverse volte per mescolare. Dopo aver centrifugato il campione per raccogliere la soluzione e garantire una polimerizzazione omogenea, aggiungere 4,5 microlitri di tetraetilene diammina al 20% o TEED al campione per catalizzare la polimerizzazione. Una volta completati mescolamento e centrifugazione, degasare la soluzione con gas azoto per tre a cinque minuti per completare la polimerizzazione e ridurre al minimo i monomeri non reagiti.

In seguito, incubare la soluzione per 10 minuti a temperatura ambiente per completare la polimerizzazione e ottenere la soluzione polimerizzata di SA uno. Ripetere i passaggi precedenti con il DNA a singolo filamento SA due liofilizzato, aggiungendo rispettivamente 45, 18, 4, 0,5 e 4,5 microlitri di acrilamide, T-B-E-A-P-S e teed a 108 microlitri della soluzione di SA due. Per preparare le soluzioni L due, R due e la soluzione controllo, centrifugare il DNA a singolo filamento liofilizzato e aggiungere le seguenti quantità di tampone TE al corrispondente DNA a singolo filamento liofilizzato come descritto in precedenza, quindi riscaldare la soluzione fino a completa dissoluzione per la soluzione del gel.

Riscaldare le soluzioni polimerizzate di SA uno e SA due a 70 gradi Celsius per circa un minuto, fino a quando la viscosità della soluzione diminuisce. Aggiungere 10 microlitri o 10 parti della soluzione polimerizzata di SA uno a 10 microlitri o 10 parti della soluzione polimerizzata di SA due.

Quindi mescolare insieme le soluzioni polimerizzate SA uno e SA due alternando un riscaldamento di 15 secondi a 70 gradi Celsius e un'agitazione di 15 secondi con la punta di una pipetta, per un totale di un minuto. Dopo il mescolamento, aggiungere sei microlitri o sei parti di soluzione L due al 100% per formare un gel al 100%. Una volta che il campione è stato mescolato come descritto in precedenza, trasferire con la pipetta il gel al 100% in una piastra di Petri da 60 millimetri e riscaldare il gel per un'ora alla temperatura ottimale di ricottura.

Successivamente, permettere ai crosslink del DNA di continuare a ibridarsi nuovamente incubando i gel per quattro ore a temperatura ambiente. Coprire il gel con PBS contenente calcio e magnesio dopo un'incubazione notturna a temperatura ambiente, rimuovere il buffer residuo dalla piastra di Petri e posizionare il gel in una provetta per microcentrifuga. A questo punto, riscaldare il gel al 100% a 70 gradi Celsius per circa 30 secondi o fino a quando il gel diventa meno viscoso.

Per la pipettaggio, posizionare coprioggetti di vetro su un blocco riscaldante a 70 gradi Celsius e lasciarli riscaldare per uno o due minuti. Aggiungere una goccia di adesivo ottico su ciascun coprioggetto di vetro. Quindi aggiungere 20 microlitri del gel al 100% su ogni coprioggetto di vetro e lasciare che il gel si sciolga e si spanda su di essi.

Rimuovere ogni contenitore di vetro contenente il gel dal blocco riscaldante e posizionarli in una piastra da coltura tissutale a 24 pozzetti. Esporre i gel a una luce UV di 365 nanometri per 15 minuti. Dopo aver riscaldato il gel per un'ora alla temperatura anale ottimale e aver permesso ai crosslink del DNA di ri-ibridarsi per quattro ore, aggiungere PBS.

Quindi incubare i gel durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone dai pozzetti con una pipetta, avendo cura di non aspirare il gel. Successivamente, aggiungere il sulfa sampa per coprire ciascun gel.

Dopo aver esposto i gel alla luce UV a 365 nanometri per 15 minuti, rimuovere il sulfa sampa. Risciacquare i gel una volta con PBS per rimuovere l'eccesso di sulfa sampa, quindi ripetere i passaggi precedenti. Incubare i gel in circa 300 microlitri di polilisina allo 0,2 milligrammi per millilitro per tutta la notte a quattro gradi Celsius. Al termine, lavare i gel due volte con PBS per cinque minuti per rimuovere l'eccesso di polilisina e aggiungere il mezzo di coltura. Dopo che i gel sono stati incubati nel mezzo di coltura per 30 minuti, rimuovere immediatamente il mezzo prima della semina delle cellule per la coltura cellulare e l'analisi microscopica.

I fibroblasti coltivati su gel con indurimento non hanno mostrato alterazioni nel rapporto di forma, ma hanno esibito un'area di proiezione maggiore rispetto ai fibroblasti coltivati su gel al 100%. I fibroblasti coltivati su gel al 100% presentavano un'area di proiezione più piccola e un rapporto di forma maggiore rispetto ai fibroblasti coltivati su gel all'80%. Questi risultati indicano che il comportamento dei fibroblasti dipende dalla natura dinamica del microambiente.

I neuroni coltivati su gel con proprietà di indurimento non hanno mostrato differenze nel numero di dendriti primari o nella lunghezza dell'assone, ma presentavano dendriti primari più corti rispetto ai neuroni coltivati su gel al 50%. Come negli studi sui fibroblasti, i fenotipi neuronali su gel statici erano diversi dai fenotipi neuronali su gel dinamici. I neuroni coltivati su gel al 50% avevano meno dendriti primari e assoni più lunghi rispetto ai neuroni coltivati su gel al 100%.

È estremamente importante ricordare, durante il tentativo di questa procedura, di pipettare accuratamente il gel viscoso, poiché le concentrazioni sono cruciali per evitare la rottura del gel; la pipettaggio accurato potrebbe richiedere diversi tentativi, e offriamo diverse altre opzioni nella sezione della discussione di questo protocollo.