Name: Preparazione di DNA-reticolato poliacrilammide idrogel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Impara a preparare idrogeli di poliacrilammide reticolati con DNA per studiare come la rigidità del tessuto influenza il comportamento cellulare. Questo metodo consente di modulare dinamicamente l'elasticità senza stimoli esterni.

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Gli autori desiderano ringraziare: Dr. Frank Jiang, il dottor David Lin, il Dr. Bernard Yurke e il Dr. Uday Chippada per i loro contributi sullo sviluppo della tecnologia del gel del DNA; Dr. Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter per i loro commenti e le modifiche di questo manoscritto; fonti di finanziamento, tra cui il New Jersey Commissione su Spinal Cord Research (Grant # 07A-019-SCR1, NAL) e New Jersey Neuroscience Institute (MLP); e editori di Ingegneria Tissutale, parte A, per il permesso di ristampare figure 2 e 4 e Biomateriali per il permesso di ristampare figura 3.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La capacità del gel di DNA per ammorbidire o irrigidire prima e dopo l&#39;adesione cellulare li rende un modello ideale per studiare il ruolo della rigidità dei tessuti dinamica sulla funzione delle cellule. Tutti e tre i disegni sono stati utilizzati in studi meccanici e biologici. Tuttavia, tutti e tre i disegni hanno elasticità simili in varie percentuali di reticolazione, indicante la lunghezza di reticolazione non influenza l&#39;elasticità del gel del DNA (Tabella 2). Al contrario, la concentrazi...

Supporti statici e dinamici sono due categorie di biomateriali che sono stati sviluppati per studiare gli effetti di elasticità dei tessuti o di rigidità sulla funzione cellulare. Supporti statici sono in grado di cambiare le loro proprietà fisiche dopo che sono stati fabbricati e / o una volta che le cellule sono placcati. Poliacrilammide (PA) gel sono stati i primi bidimensionali, supporti statici che sono stati sintetizzati per le indagini mechanobiology 5,17. Gel PA sono facili da preparare, economico, versatile e può essere fabbricato con una vasta gamma di moduli elastici. Anche se questi vantaggi tecnici rendono PA gelifica un substrato comunemente applicato, supporti statici non sono indicativi della natura dinamica della matrice extracellulare (ECM) e di ambiente cellulare circostante in vivo. Ad esempio, l&#39;ECM subisce alterazioni rigidità come risultato di lesioni, sviluppo, o malattia. Supporti dinamici sono quindi favoriti come modelli substrato di tessuto-mimando negli studi mechanobiology <sup&gt; 22,24,25. Numerosi sintetico, bidimensionale biomateriali, tridimensionali, statiche e dinamiche naturali sono stati sviluppati per imitare il tessuto rigidità 1,3,6,16,23,26. Alcuni supporti dinamici richiedono calore, ai raggi UV, corrente elettrica, gli ioni, e variazioni di pH per alterare le loro proprietà meccaniche 2,4,7,8,12,15,16, ma questi stimoli possono limitare bio-applicazione del idrogel. Idrogel di poliacrilamide DNA-reticolato (gel di DNA) sono substrati elastici bidimensionali dinamici. Legami crociati DNA permettono la modulazione temporale, spaziale, e reversibile di gel DNA rigidità con l&#39;aggiunta di DNA a singola elica (ssDNA) a supporto o tampone 9-11,13,14,18,21. A differenza dei gel dinamici suddetti in cui si applicano stimoli per la modulazione di elasticità, i gel di DNA basano sulla diffusione di ssDNA applicata per la modifica di elasticità. Pertanto, la superficie del gel superiore, dove si coltivano cellule, è la prima zona modulato perché il tasso omodulazione elasticità f dipende dallo spessore del gel. Gel di DNA sono simili alle loro controparti gel PA dal fatto che essi hanno un backbone poliacrilammide, tuttavia i legami crociati bis-acrilamide vengono sostituiti con legami crociati costituite da DNA (Figura 1). Due ssDNAs (SA1 e SA2) ibridano con un filamento reticolante (L2) per compensare i legami crociati DNA del gel. SA1 e SA2 hanno sequenze distinte che contengono sia una modifica Acrydite alla fine 5&#39;per incorporazione efficace nella rete PA. Per la preparazione del gel, SA1 e SA2 sono individualmente polimerizzati in una spina dorsale PA e, in seguito, la SA1 e SA2 polimerizzato sono mescolati insieme. L2, il reticolante, viene aggiunto alla miscela SA1 e SA2. La sequenza di basi L2 è complementare ad entrambe le sequenze SA1 e SA2 e L2 si ibrida con SA1 SA2 più per formare i legami crociati DNA. , Elasticità del gel DNA iniziale è determinato da entrambe le concentrazioni L2 e reticolazione (tabelle 1 </strong&gt; e 2). Gel di DNA contenenti uguali quantità stechiometriche di L2, SA1, SA2 e sono i gel più rigide perché SA1 e SA2 sono reticolati al 100% da L2 (designato come 100% gel). Concentrazioni minori di risulta L2 in una percentuale inferiore di reticolazione DNA e, quindi, più morbide gel di DNA. Gel a partire da 50% reticolato (designato come il 50% gel) sono stati costruiti 9-11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig1highres.jpg" /> Figura 1 gel DNA reticolazione e uncrosslinking schematica 9-11,13,14,18,21 Passo 1:. SA1 (rosso) e SA2 (blu) sono individualmente polimerizzati in una spina dorsale poliacrilammide (nero). Dopo la polimerizzazione, soluzioni polimerizzati SA1 e SA2 sono mescolati insieme. Fase 2: L2 (verde) si aggiunge e si ibrida con SA1 SA2 più per formare i legami crociati del gel. Fase 3: R2 ibrida con tegli toehold di L2. Fase 4: ibridazione Toehold R2 spinge la decompressione di L2 da SA1 e SA2. A differenza dei gel PA, gel DNA possono irrigidirsi e ammorbidire dopo la sintesi. Per questo motivo, le cellule coltivate su gel di DNA possono essere sottoposti a modifiche di rigidità dinamica. Per irrigidire gel cellule aderenti, L2 può essere aggiunto al mezzo di coltura di gel basse percentuali di aumentare la percentuale di legami crociati. Per ammorbidire gel cellule aderenti, L2 può essere rimosso per diminuire la percentuale di legami crociati 10,13,21. L2 ha una sequenza appiglio supplementare al fine di consentire 3&#39;L2 a uncrosslink da SA1 e SA2 (Tabella 1). Rimozione di L2 è compiuta mediante ibridazione di un filamento inversione chiamato R2. R2 è complementare alla lunghezza della L2 e si ibrida con il primo appiglio L2. Toehold ibridazione spinge la decompressione di L2 da SA1 e SA2, che elimina la reticolazione e riduce la rigidità gel. In questa relazione evideo, passo-passo le istruzioni sono fornite per la preparazione di irrigidimento e ammorbidire gel di DNA. Mentre 100% e 80% preparazioni gel sono descritti, questo protocollo può essere adattato per creare gel di DNA di altre percentuali reticolato iniziali e finali. In generale, 100% e 80% gel vengono preparati, immobilizzati su vetrini di vetro, funzionalizzati, e seminati con cellule. L2 viene aggiunto ai media di 80% gel e R2 si aggiunge ai media di 100% gel, 48 ore dopo la placcatura. L&#39;aggiunta di L2 ai media irrigidisce 80% gel 100% reticolato, mentre l&#39;aggiunta di R2 ai media ammorbidisce 100% gel al 80% reticolato. Gel irrigiditi sono designati come 80 → 100% gel e gel ammorbiditi sono designati come 100 → 80% gel nel testo. Per il controllo o gel statici, ssDNA composto da Ts o AS è consegnato ad un altro gruppo di 100% e 80% gel. Dopo un minimo di due giorni modulazione elasticità, le cellule possono essere elaborati ed analizzati. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:kEEP-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> Reticolazione DNA </td><td rowspan="2"> # Di basi </td><td> Sequence (Toehold) </td><td rowspan="2"> Modifica </td><td rowspan="2"> Temperatura di fusione (T m, ° C) </td><td rowspan="2"> Commenti </td></tr><tr><td> 5 &#39;→ 3&#39; </td></tr><tr><td rowspan="4"> Disegno 1 </td><td> SA1 </td><td> 10 </td><td> GCA CCT TTG C </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 34.9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 10 </td><td> GTC AGA ATG A </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 23.6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 30 </td><td> TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG </td><td></td><td> 56 </td><td>Una sequenza toehold 10 bp è incluso. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 30 </td><td> CAA GTG TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA </td><td></td><td></td><td> R2 è complementare a L2 </td></tr><tr><td rowspan="4"> Design 2 </td><td> SA1 </td><td> 14 </td><td> CGT GGC ATA GGA CT </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 46.9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 14 </td><td> GTT TCC CAA TCA GA </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 40.2 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C </td><td></td><td> 65.9 </td><td> A 12 bp sequenza appiglio è incluso. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 40 </td><td> GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A </td><td></td><td> 65.9 </td><td> R2 è complementare a L2 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Design 3 </td><td> SA1 </td><td> 20 </td><td> ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 55 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 20 </td><td> CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 56.6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T </td><td></td><td> 68.8 </td><td> Toehold non è incluso. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Controllo </td><td rowspan="2"> Controllo </td><td rowspan="2"> 20-40 </td><td> AAA AAA (ecc) o </td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td> TTT TTT (etc.) </td></tr></tbody></table> Tabella 1. sequenze di base per ssDNA 9-11,13,14,18,21. Cellulare e studi meccanici hanno utilizzato diversi ddisegni di reticolazione ifferent per generare gel di DNA con una gamma di statici e dinamici proprietà meccaniche. I parametri modulati nel design di reticolazione sono sequenza di basi e lunghezza della sequenza o la lunghezza di reticolazione. Caratteri in grassetto e in corsivo illustrano appaiamento delle basi tra SA1 e L2 e tra SA2 e L2 rispettivamente. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="8"> Design </td></tr><tr><td colspan="3"> 1 </td><td colspan="3"> 2 </td><td colspan="2"> 3 </td></tr><tr><td> Acrilamide Concentrazione (%) </td><td colspan="3"> 10 </td><td colspan="3"> 10 </td><td> 10 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SA1 SA2 più ibridato a L2 (% reticolato) </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> &lt;strong&gt; Elasticità (kPa, media ± SEM) </td><td> 6.6 ± 0.6 </td><td> 17.1 ± 0.8 </td><td> 29.8 ± 2.5 </td><td> 5.85 ± 0.62 </td><td> 12.67 ± 1.33 </td><td> 22.88 ± 2.77 </td><td> 25.2 ± 0.5 </td><td> 10.4 ± 0.6 </td></tr></tbody></table> Tabella 2 Modulo di Young (E) del gel del DNA 9-11,13,14,18,21. Concentrazione di acrilamide, percentuale di reticolazione, e la lunghezza di reticolazione può essere modulata in gel di DNA. Designs 1, 2, e 3 hanno 20, 28, e 40 bp lunghezze di reticolazione, rispettivamente. 100% gel per tutti i disegni hanno moduli simili indicante la lunghezza di reticolazione non influenza l&#39;elasticità del gel. Tuttavia, le variazioni della concentrazione di acrilamide alterano l&#39;elasticità del gel del DNA.

<table><tbody><tr><td>ssDNA</td><td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com</td><td></td><td>Non vorticare ssDNA. Capovolgere delicatamente la soluzione del flaconcino e/o della pipetta per miscelare.</td></tr><tr><td>PBS con calcio e magnesio</td><td></td><td></td><td>Qualsiasi marca.</td></tr><tr><td>100x tampone Tris-EDTA (tampone TE)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>10x tampone Tris-Borato-EDTA (tampone TBE)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>93290</td><td>TBE è una tossina riproduttiva.</td></tr><tr><td>Soluzione di acrilammide al 40%</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>BP14021</td><td>L'acrilammide è una tossina.</td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio (APS)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>A3678</td><td>Preparare una soluzione al 2% in tampone TE. L'APS è una tossina e un irrazionale.</td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiammina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>T9281</td><td>Preparare una soluzione al 20% in tampone TE. TEMED è infiammabile, corrosivo e tossina.</td></tr><tr><td>Copribicchiere rotondo diametro 12 mm</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo ottico Norland 72</td><td>Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com</td><td>NOA72</td><td></td></tr><tr>Piastra <td></td><td></td> per<td>coltura tissutale a 24 pozzetti</td><td>Qualsiasi marca.</td></tr><tr>Provette <td></td><td></td><td>per microcentrifuga</td><td>di qualsiasi marca.</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>ProteoChem o Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com o thermofisher.com</td><td>C111 o 22589</td><td>Preparare una soluzione di 0,315 mg/ml in acqua immediatamente prima dell'uso. Sciogliere a 37 gradi C e filtro sterilizzante. È normale osservare sulfo-SANPAH non disciolto nel filtro. Sulfo-SANPAH è sensibile alla luce e, pertanto, la soluzione deve essere protetta dalla luce fino all'esposizione ai raggi UV.</td></tr><tr><td>Poli-D-Lisina (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>P6407</td><td>Preparare una soluzione 0,2 mg/ml in acqua e sterilizzare con filtro.</td></tr><tr><td>Collagene Tipo I</td><td>Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com</td><td>13813</td><td>Preparare una soluzione 0,2 mg/ml in acido acetico 0,2 N. La soluzione deve rimanere sempre fredda per evitare la polimerizzazione. L'acido acetico è un infiammabile, tossico e corrosivo.</td></tr><tr><td>22 x 60 vetro di copertura</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta a spostamento positivo</td><td>Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com</td><td>F148504</td><td></td></tr><tr><td>Blocco termico</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente</td><td></td><td></td> di luce UV <td>Posizionare i gel il più vicino possibile alla luce UV. La luce UV può causare lesioni alla pelle o agli occhi.</td></tr><tr><td>Termometro</td><td></td><td></td><td>Qualsiasi marca.</td></tr><tr><td>Azoto gassoso</td><td>GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/</td> <td>NI 5.0UH-R</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione di dna-reticolato poliacrilammide idrogel

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiology è un settore scientifico emergente che affronta il ruolo critico di segnali fisici nel dirigere la morfologia e la funzione delle cellule. Ad esempio, l&#39;effetto di elasticità dei tessuti sulla funzione delle cellule è un importante area di ricerca mechanobiology perché la rigidità del tessuto modula con la malattia, lo sviluppo, e lesioni. Materiali tessuto-mimando statiche, o materiali che non possono alterare la rigidezza volta che le cellule sono placcati, vengono prevalentemente utilizzati per studiare gli effetti della rigidità dei tessuti sulle funzioni cellulari. Mentre le informazioni raccolte da studi statici è prezioso, questi studi non sono indicativi della natura dinamica del microambiente cellulare in vivo. Per affrontare meglio gli effetti della rigidità dinamica sulla funzione delle cellule, abbiamo sviluppato un sistema di poliacrilammide idrogel DNA-reticolato (gel di DNA). A differenza di altri supporti dinamici, gel di DNA hanno la capacità di aumentare o diminuire la rigidità dopo la fabbricazione, senza stimoli. Gel di DNA sono costituiti da DNA crosslinchiostri che vengono polimerizzate in una spina dorsale di poliacrilamide. Aggiunta e rimozione di legami crociati con la consegna di DNA a singolo filamento permette temporale, spaziale, e il controllo reversibile di elasticità del gel. Abbiamo dimostrato in precedenti relazioni che la modulazione dinamica di elasticità del gel DNA influenza dei fibroblasti e neuroni comportamento. In questo rapporto e video, forniamo uno schema che descrive i meccanismi di reticolazione gel del DNA e passo-passo le istruzioni su gel di preparazione del DNA.

Prima i nostri studi, le interazioni cellula-ECM sono stati osservati sui biomateriali compatibili statici o su supporti dinamici irreversibili e unidirezionali. Questi substrati non riflettono con precisione la natura dinamica del microambiente cellulare. Il nostro lavoro si sposta i paradigmi tecnici esistenti, fornendo un modello più fisiologica per lo studio delle interazioni cellula-ECM sul rammollimento e irrigidimento biomateriali dinamici. In studi precedenti, abbiamo analizzato gli effetti dei supporti dinamici...

Il nostro laboratorio ha sviluppato idrogel di poliacrilamide DNA-reticolato, un sistema dinamico di idrogel, per comprendere meglio gli effetti di modulazione rigidità dei tessuti sulla funzione delle cellule. Qui, forniamo schemi, descrizioni e protocolli per preparare questi idrogel.

Preparazione di DNA-reticolato poliacrilammide idrogel

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare idrogeli in poliacrilammide incrociati con DNA che possano indurirsi o ammorbidirsi mediante l'aggiunta con pipetta di DNA a singolo filamento nel mezzo di coltura dopo che le cellule sono state seminate sulla superficie. Questo viene ottenuto innanzitutto risospendendo separatamente i DNA a singolo filamento SA1, SA2, L2, R2 e di controllo in un tampone e polimerizzando individualmente le soluzioni SA1 e SA2 in un reticolo di poliacrilammide. Il secondo passaggio consiste nel mescolare le soluzioni polimerizzate SA1 e SA2 con la soluzione L2 per formare il gel di DNA.Successivamente, la soluzione del gel di DNA viene immobilizzata su coprioggetti di vetro utilizzando una colla ottica. L'ultimo passaggio consiste nel funzionalizzare i gel trattandoli con sulsampa e poi con PDL. Infine, le cellule vengono seminate sui gel di DNA e l'elasticità del gel viene modulata aggiungendo R due L due o DNA a singolo filamento come controllo, per ammorbidire, indurire o non modificare rispettivamente l'elasticità del gel.I risultati di questi esperimenti mostrano che la natura dinamica del substrato sottostante influenza direttamente il compo

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Vi presentiamo i protocolli per le 3 dimensioni (3D) incapsulamento delle celle all'interno di idrogel sintetico. La procedura di incapsulamento viene delineato per due metodi comunemente usati di reticolazione (michael-tipo di addizione e di luce iniziata meccanismi di radicali liberi), come pure una serie di tecniche per la valutazione del comportamento delle cellule incapsulate.

Incapsulamento cellulare in idrogel 3D per l&#39;ingegneria tissutale

L'effetto di rigidità substrati sulla funzione cellulare può essere...

Studiare gli effetti di rigidità Matrix sulla funzione cellulare utilizzando acrilamide a base di idrogeli

In questo video, dimostriamo le tecniche sperimentali utilizzate per fabbricare compatibile, della matrice extracellulare (ECM) substrati rivestiti adatto per colture cellulari e che sono suscettibili di microscopia a forza di trazione e di osservare gli effetti di rigidità ECM sul comportamento delle cellule.

Preparazione di matrici di reclamo per Quantificare Contrazione Cellular

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Rigidità meccanica nel microambiente tumorale gioca un ruolo cruciale nel guidare il comportamento maligno aumentando l'attività Invadopodi e actomiosina contrattilità. Utilizzando gel di poliacrilammide (PaaS), Invadopodi e forza di trazione test possono essere utilizzati per studiare le proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali in risposta alla matrice rigidità.

Gel di poliacrilammide per Invadopodi e trazione Forza saggi sulle cellule tumorali

Qui viene descritto un metodo che consente una preparazione rapida, efficiente ed economica di gel di poliacrilammide in un formato di piastra multipozzetto. Il metodo non richiede alcuna attrezzatura specializzata e potrebbe essere facilmente adottato da qualsiasi laboratorio di ricerca. Sarebbe particolarmente utile nella ricerca incentrata sulla comprensione delle risposte cellulari dipendenti dalla rigidità.

Semplice Poliacrilammide-based a più pozzetti Rigidità Assay per lo Studio della rigidezza-dipendenti le risposte delle cellule

differenziazione delle cellule è regolata da una serie di fattori microambientali, tra cui entrambe le proprietà composizione della matrice e materiale del substrato. Descriviamo qui una tecnica che utilizza microarrays di cellule in combinazione con una forza di trazione microscopio per valutare sia la differenziazione cellulare e biomeccaniche interazioni cellula-substrato in funzione del contesto microambientali.

Una piattaforma cellulare microarray high-throughput per l&#39;analisi correlativa cellulare Differenziazione e forze di trazione

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Preparazione di DNA-reticolato poliacrilammide idrogel

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