Name: Un flusso di Adesione saggio per studiare Leucocyte reclutamento a epatici umani sinusoidali Endotelio in condizioni di stress Shear (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-21T15:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Scopri un saggio di adesione in flusso per studiare il reclutamento dei leucociti sull'endotelio sinusoidale epatico umano in condizioni di stress da taglio fisiologico. Questo metodo aiuta a identificare le interazioni molecolari chiave.

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1. MicroSlide Preparazione <ol><li> Prerivestimento un MicroSlide sei canali con coda di ratto collagene di tipo I (RTC, diluito in PBS 1:100 dare una diluizione di lavoro di 220 mcg / ml). Questo viene effettuato iniettando 30 ml di soluzione diluita RTC direttamente nei canali e incubare per 2 ore a 37 ° C, seguita da tre lavaggi con PBS. </li></ol> 2. Cellule semina in Microslides <ol><li> Dissociare una fiasca T75 confluenti di cellule epatiche umane coltivate sinusoidali endoteliali (HSEC) (isolato da tessuto epatico come descritto in precedenza 13) in tripsina-EDTA, lavate in PBS e risospendere a 3 x 10 6 cellule / ml in mezzi completi (endoteliali umane terreni di base integrate con 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina e la streptomicina 100μg/ml, siero umano il 10% inattivato al calore AB, di 10 ng / ml di fattore di crescita vascolare endoteliale e 10 ng / ml di fattore di crescita degli epatociti). Iniettare 30 ml di sospensione cellulare terribilictly in ciascun canale. </li><li> Lascia cellule di aderire per 1 h in un incubatore umidificato a 37 ° C con CO 2 nell&#39;atmosfera 5% su un rack scorrevole. Dopo permettendo alle cellule di aderire riempire le porte su entrambi i lati di ciascun canale con mezzo completo (Figura 1). </li></ol> 3. Citochina stimolazione delle cellule <ol><li> Lasciare le cellule in incubatore per 24 ore. Valutare la crescita delle cellule utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito. 24 ore prima del dosaggio adesione, stimolare i monostrati endoteliali con citochine sostituendo il materiale di crescita con mezzi completi integrati da fattore di necrosi tumorale alfa e interferone gamma, sia a 10 ng / ml. </li></ol> 4. Isolamento di sangue periferico linfociti <ol><li> Isolare linfociti del sangue periferico di sangue intero purificando inizialmente la frazione mononucleare dal gradiente di densità centrifugazione su un supporto di centrifugazione separazione cellulare appropriato per 25 min a 800x g. Incubare le cellule in plastica per 1 ora per consentire l&#39;adesione dei monociti. </li><li> Dopo l&#39;adesione ad aspirare plastica linfociti arricchito surnatante. Lavare i linfociti e risospendere loro (tipicamente 1 x 10 6 cellule / ml in mezzo di flusso (terreni di base endoteliali contenenti 0,1% (v / v) di albumina di siero bovino (BSA)). </li></ol> 5. Il pretrattamento di endotelio o leucociti con inibitori <ol><li> Preparare diluizioni raccomandate di anticorpi funzionali bloccare o piccole molecole inibitrici a endoteliale media/0.1% (v / v) BSA. Sostituire terreno completo con soluzione bloccante anticorpo / inibitore in canale MicroSlide scelto 30 min prima di fluire dosaggio. </li><li> Dove sono previsti pretrattamento di recettori per chemochine sui linfociti, risospendere leucociti isolati in soluzione RPMI contenente 0,1% (v / v) BSA e incubare con 200 ng / ml di tossina della pertosse per bloccare G-proteina recettore accoppiato attività di recettori per chemochine, in alternativa diluire specifico funzioneanticorpi bloccanti o piccole molecole inibitrici di recettori per chemochine alla diluizione raccomandata. Incubare leucociti a 37 ° C per 30 minuti, poi lavare e risospendere in mezzo flusso. </li></ol> 6. Impostazione del flusso sistema di test <ol><li> Preriscaldare una camera di controllo termostatico trasparente a 37 ° C. La camera deve avere porte per l&#39;inserimento del tubo in silicone e fornitura elettronico per un&#39;elettrovalvola elettronico che consente la commutazione tra le cellule e media praticamente senza volume morto. La camera è montata su un microscopio invertito per consentire microscopio a contrasto di fase. Figura 2 illustra la camera di dosaggio flusso e microscopio e MicroSlide posto sul palco microscopio. </li><li> PreFill una siringa di vetro da 50 ml con un luer lock con 10 ml di acqua distillata sterile e inserire un pezzo di tubo in silicone 25 cm a porta siringa. Inserire in una pompa a siringa. Alterare il tasso di ritiro della pompa siringa seguendoistruzioni del produttore MicroSlide per mantenere una sollecitazione di taglio di 0,05 Pa (0,5 dyne / cm 2, Figura 3). </li><li> Prendete due siringhe da 5 ml, scartare gli stantuffi e allegare i barili alle due porte nel flusso di una valvola a solenoide elettronica utilizzando tubi in silicone. <ol><li> Attaccare 12 cm di tubi in silicone alla valvola out-flow. La valvola permette alternanza tra un buffer cella lavaggio (endoteliale media/0.1% (v / v) BSA) e la sospensione linfocitaria. </li><li> Lavare l&#39;elettrovalvola elettronica inserendo il tampone di lavaggio sia in siringhe e garantendo tampone fluisce da un barile attraverso la valvola e nel tubo di silicone out-flow. </li><li> Con l&#39;interruttore valvola di alternare all&#39;altra canna e garantire il buffer è scorrevole e che tutte le bolle vengono rimossi dal sistema. Rimuovere il tampone di lavaggio da una delle canne e sostituire con linfociti sospensione Figura 4a. </li></ol></li><li> Collegare il Tubin siliconeg dalla pompa siringa ad una porta di un canale MicroSlide scelto tramite un adattatore MicroSlide. Quindi collegare il tubo di silicone dalla valvola di scarico alla porta opposta tramite un adattatore MicroSlide. Assicurarsi che il tubo in silicone e gli adattatori sono riempiti con tampone di lavaggio prima della connessione per evitare bolle d&#39;aria che entra nel sistema (Figura 4b). </li><li> Una volta collegato al sistema di flusso, posizionare il MicroSlide sul palco microscopio e fissare con fermagli o nastro adesivo per impedire il movimento. Impostare il microscopio per l&#39;obiettivo 10X con l&#39;impostazione della fase appropriata. Assicurarsi che il monostrato endoteliale viene visualizzato e messa a fuoco utilizzando la lente oculare. Garantire immagini possono essere catturate tramite una telecamera che è attaccato al microscopio per cui le immagini possono essere inoltrati ad un monitor e registrate. </li></ol> 7. Flusso Tecnica Tenore e registrazione di adesione per l&#39;analisi <ol><li> Profumato strato endoteliale con tampone di lavaggio per 2 minuti per iniziare withdrawal della pompa a siringa per rimuovere eventuali detriti o anticorpo non legato blocco e quindi passare la valvola per permettere un 5 min bolo di soluzione di leucociti in un costante sforzi di taglio di 0,05 Pa. </li><li> Durante gli ultimi 2 min del bolo leucocitaria, registrare 10 campi casuali lungo la lunghezza del MicroSlide. Ciò consente l&#39;analisi offline di linfociti rotolamento / tethering sul monostrato endoteliale. Registrare ogni campo per circa 10 secondi prima di passare alla successiva e garantire che le registrazioni vengono effettuate contro la direzione del flusso per evitare di registrare la stessa cella di laminazione due volte in rapida successione. </li><li> Seguire la bolo leucociti con un 5 min bolo di tampone di lavaggio restituendo la valvola nella sua posizione iniziale. Nella finale 2 min di questa bolo effettuare una seconda fase di registrazione scegliendo almeno 10 campi scelti a caso lungo la lunghezza del MicroSlide. Registrare ogni campo per circa 5 secondi prima di passare alla successiva e assicurarsi che il monostrato endoteliale e leucoc aderentiytes sono in chiaro focus. Questo consente l&#39;analisi offline del pattern di aderenza. </li></ol>

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
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<li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti

La fase più critica per eseguire con successo un saggio di flusso è garantire che un monostrato sano e confluenti di cellule endoteliali è pronto prima del test di adesione flusso. Cellule endoteliali primarie possono essere difficili da cultura e sensibile alle alterazioni nei metodi di coltura. E &#39;importante che 1) camere di flusso vengono adeguatamente e uniformemente rivestite con cellule endoteliali in un monostrato, per HSEC usiamo ratto tipo coda collagene I ma può variare per altre popolazioni endoteliali, 2) terreno di coltura appropriato per il tipo di cellula, per HSEC abbiamo descritto il terreno completo nella sezione del protocollo. Altri passi fondamentali sono l&#39;impostazione della pompa a siringa al tasso appropriato per riflettere i livelli fisiologici di shear stress. Durante il saggio di flusso è necessario evitare bolle d&#39;aria all&#39;interno del circuito di flusso che possono danneggiare il monostrato endoteliale o nastri cellule immuni dalla superficie endoteliale. Ciò può essere evitato ensuring che tutti i tubi silicone e adattatori sono perfusi con tampone di lavaggio prima della connessione, che tutte le bolle d&#39;aria vengono rimosse e che i media sono preriscaldata prima dell&#39;uso. Nel collegare gli adattatori per porte sul MicroSlide è molto importante che vi è una interfaccia liquido / liquido durante la connessione, se c&#39;è aria allora questo formerà uno spazio d&#39;aria all&#39;interno del sistema che interromperà il monostrato endoteliale durante il ritiro siringa passo. La soluzione leucociti nel cilindro della siringa deve agitazione regolare per assicurare che le cellule non si depositano, mantenendo così una densità cellulare costante durante l&#39;esperimento. Durante le fasi di registrazione è importante garantire l&#39;immagine dello strato endoteliale è sufficientemente concentrata e chiaro che permette l&#39;analisi offline accurata, e che durante la seconda fase del saggio flusso (post leucociti bolo) che viene lasciato un tempo sufficiente durante il tampone di lavaggio fase di prima registrazione viene ricominciato a garantire chetutti i leucociti non aderenti sono state rimosse. Analogamente, è indispensabile utilizzare cellule endoteliali in un monostrato di densità appropriata per prevenire la perdita di cellule che possono interferire con modelli di flusso nei capillari stretti e può anche essere difficile discriminare da grandi leucociti aderenti al microscopio a contrasto di fase. Abbiamo descritto ottimale densità di semina per le cellule endoteliali sinusoidali epatiche umane, ma puo &#39;variare tra le diverse popolazioni endoteliali e specie. Notevoli progressi sono stati compiuti nello studio leucociti assunzioni in modelli animali con la microscopia intravitale. Il principale vantaggio del metodo saggi di adesione flusso è che il reclutamento dei leucociti può essere studiata in un sistema binario con cellule endoteliali umane primarie. Inoltre, queste interazioni possono essere studiati sotto i livelli fisiologici rilevanti di shear stress. E &#39;importante per confermare i risultati di studi intravitale negli animali con sistemi cellulari umani in quanto vi possono essere differences nelle proprietà endoteliali tra le specie. Una delle limitazioni del flusso saggio è che il reclutamento dei leucociti viene studiato in un ambiente unicellulare del monostrato endoteliale. Inoltre una volta che i leucociti hanno aderito e trasmigrata attraverso l&#39;endotelio non possono essere presenti in numero sufficiente per essere isolati e sottoposti a processi a valle. Nonostante questi limiti, una volta che il test di adesione flusso è stato masterizzato può essere sviluppato effettuare ulteriori analisi della cascata adesione leucocitaria e adattato ricapitolare un ambiente multicellulare. Registrazione prolungata di singoli campi e l&#39;uso di software di monitoraggio può essere utilizzato per analizzare strisciando comportamento dei leucociti. Inoltre al termine del dosaggio flusso i microslides possono essere interrogati utilizzando microscopia confocale a scansione laser e l&#39;etichettatura immunofluorescenza studiare adesione e trasmigrazione in maggior dettaglio. Inoltre, abbiamo precedentemente sviluppareEd un modello in vitro dove leucociti scorre potrebbero interagire con endotelio epatica condizionato dalla presenza di epatociti. Questo test può anche essere sviluppato per studiare sottopopolazioni di leucociti: il nostro gruppo ha condotto studi con sottoinsiemi come le cellule T regolatorie, cellule B e fegato infiltrante leucociti. Questi studi sono la prova che il saggio di adesione flusso è un potente strumento per studiare il reclutamento generale e organo leucociti specifico in sistemi umani.

E &#39;ormai accertato che il reclutamento dei leucociti, in generale, segue il paradigma della cascata adesione multistep 1. Ciò comporta la cattura di leucociti dal sangue che scorre dalle cellule endoteliali che rivestono la parete del vaso. Inizialmente, leucociti subiscono una fase di laminazione che è mediata da recettori selectina o membri della superfamiglia delle immunoglobuline. Questo permette recettori accoppiati alle proteine ​​G (GPCR) espressi sulla superficie dei leucociti essere attivata da chemochine presentate sul glicocalice endoteliale. Questo porta all&#39;alterazione della conferma integrina ad uno stato &#39;alta affinità&#39; sulla superficie dei leucociti e arrestare e ferma adesione all&#39;endotelio. Ferma adesione è seguito da cambiamento di forma e scansione della leucocitaria sulla nave. Il passo finale è trasmigrazione attraverso il monostrato endoteliale, che può avvenire tramite paracellulare o transcellulare aeree. Mentre la cascata adesione multistep descriveres il meccanismo generale di leucociti assunzioni all&#39;interno del corpo ci sono differenze specifiche organo. Nel fegato la maggior parte dei leucociti assunzione avviene entro i sinusoidi epatici a differenza di altri organi dove il reclutamento avviene generalmente all&#39;interno delle venule post-capillari 2. Le sinusoidi epatici sono un ambiente a basso taglio e leucociti sottoposte ad un breve passo tethering prima di consolidare l&#39;adesione che è selectina indipendenti 2. Questi canali sono rivestite da endotelio sinusoidale epatica che è discontinuo e contiene Fenestrae, pori aperti 100-200 nm di diametro, e mancano di una membrana basale 3. Chiarire i meccanismi molecolari che mediano il reclutamento dei leucociti attraverso l&#39;endotelio sinusoidale epatico umano potrebbe identificare organo specifici bersagli terapeutici per le malattie del fegato infiammatorie. Saggi di adesione di flusso sono strumenti essenziali nello studio leucocitaria assunzioni. Essi consentono la ricostruzione di leucociti recruitment in presenza di shear stress per analizzare l&#39;adesione in forze ben definite. L&#39;uso più frequente per il saggio è lo studio dei leucociti adesione a monostrati endoteliali o substrati purificati. Camere di flusso commercialmente disponibili sono utilizzati per perfusione cellule in condizioni di flusso laminare tra due superfici piane e poi visualizzare il processo dinamico di adesione su un microscopio 4. Gruppi precedenti hanno dimostrato che alcune interazioni adesive avvengono solo sotto il flusso e non possono essere studiata in saggi statici 5,6. Abbiamo utilizzato questa tecnica per ricapitolare i sinusoidi epatici e studiare il reclutamento dei leucociti in condizioni di bassa tensione di taglio. Primario HSEC umano sono coltivate in microslides e leucociti può essere perfuso su questo monostrato ad una velocità di portata calcolata di riprodurre lo sforzo di taglio entro sinusoidi epatici. Lo sforzo di taglio è una sollecitazione che viene applicata parallela o tangente ad una superficie come opposed a sforzo normale, che è perpendicolare. Qualsiasi fluido che si muove lungo un confine eserciterà una sollecitazione di taglio su quel confine. Shear stress ha dimostrato di essere una componente essenziale di linfociti trasmigrazione 7. In queste condizioni ogni passo della cascata adesione può essere visualizzato mediante microscopia a contrasto di fase. Questo metodo ha permesso importanti conoscenze sulla reclutamento di leucociti all&#39;interno del fegato compreso lo studio di molecole di adesione convenzionali 8, il ruolo delle chemochine e recettori per chemochine 9-11, e molecole di adesione atipici quali l&#39;adesione vascolare proteina-1 (VAP-1 ) 8,12 e linfatica e vascolare endoteliale comune recettore-1 (CLEVER-1) 13. Anche questo test è stato citato in diverse pubblicazioni del nostro gruppo, la sua descrizione è stata breve e ci hanno colto questa opportunità per fornire una dettagliata passo passo guida per aiutare nella risoluzione dei problemi e prevenire errori tecnici durante il tentativozione del test. Inoltre, abbiamo recentemente cambiato il reperimento delle camere MicroSlide che permette alterazioni accurati shear stress. Crediamo che questo allarga l&#39;applicabilità del test ad altre cellule endoteliali e immunitarie. Il seguente metodo descrive la preparazione e la tecnica per la realizzazione di un saggio di adesione flusso based con cellule endoteliali sinusoidali epatiche umane e linfociti del sangue periferico.

<table><tbody><tr><td>Camera di flusso a sei canali microslide VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td>Sono disponibili vetrini di altre dimensioni del canale e vetrini prerivestiti a seconda dei requisiti del test.</td></tr><tr><td>Adattatori di flusso&nbsp; microslide VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80646</td><td></td></tr><tr><td>Camera di saggio a flusso</td><td>Solent Scientific</td><td>33-3322</td><td>Queste camere sono realizzate su misura dall'azienda in base al modello di microscopio e accessori.</td></tr><tr><td>Microscopio invertito IX2</td><td>Olympus, Regno Unito</td><td>Modello IX50</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Pompa a siringa</td><td>Harvard Apparato, Regno Unito</td><td>702101</td><td></td></tr><tr><td>Elettrovalvola elettronica</td><td>Lee Products Limited, Regno Unito</td><td>Codice LFYA1226032H</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in silicone grande</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50855</td><td>diametro interno 2 mm, diametro esterno 4 mm</td></tr><tr><td>Tubo in silicone-piccolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50853</td><td>1 mm di diametro interno, 3 mm di diametro esterno</td></tr><tr><td>Siringa in vetro Harvard</td><td>Apparato, Regno Unito</td><td>55-0962</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di separazione cellulare/Linfolita</td><td>VH Bio</td><td>CL-5020</td><td></td></tr><tr><td>Collagene a coda di ratto</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td></td></tr></tbody></table>

un flusso di adesione saggio per studiare leucocyte reclutamento a epatici umani sinusoidali endotelio in condizioni di stress shear

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltrazione nel tessuto epatico umano è un processo comune a tutte le malattie epatiche infiammatorie adulti. Infiltrazione cronica può guidare lo sviluppo di fibrosi e la progressione a cirrosi. La comprensione dei meccanismi molecolari che mediano il reclutamento dei leucociti al fegato ha potuto identificare importanti bersagli terapeutici per le malattie del fegato. L&#39;interazione tasto durante leucociti reclutamento è quella delle cellule infiammatorie con endotelio in condizioni di sforzo di taglio. Assunzioni al fegato si verifica entro le basse canali taglio delle sinusoidi epatici che sono allineati dalle cellule epatiche endoteliali sinusoidali (HSEC). Le condizioni all&#39;interno dei sinusoidi epatici possono essere riepilogati mediante perfusione leucociti attraverso i canali fiancheggiati da monostrati HSEC umani a portate specifiche. In queste condizioni leucociti sottoposte ad un breve passo tethering seguita da attivazione e adesione stabile, seguita da una fase di scansione e successiva trasmigrazione di tutti i endotelialestrato. Utilizzando la microscopia a contrasto di fase, ogni passo di questa &#39;cascata adesione&#39; può essere visualizzato e registrato seguita da analisi offline. Cellule endoteliali o leucociti possono essere pretrattate con inibitori per determinare il ruolo di molecole specifiche durante questo processo.

Questa analisi ha la capacità di visualizzare il multistep cascata adesione flusso e chiarire i meccanismi molecolari alla base confrontando i risultati di esperimenti di controllo a quelli con inibitori molecolari. I vari letti vascolari possono essere riepilogati incorporando cellule endoteliali specifiche e alterando le condizioni di stress di taglio. Ogni passo della cascata di adesione può essere analizzato non in linea seguendo il metodo di registrazione descritto nel protocollo. Il primo passo della cascata adesione è il rotolamento dei leucociti che possono essere espresse come percentuale di cellule aderenti totali. Analisi offline consente al numero di cellule aderenti da enumerare in ogni campo registrato durante il bolo leucocitaria. La riproduzione delle immagini permette il confronto delle cellule che sono saldamente aderenti e quelli che stanno subendo un moto di rollio attraverso l&#39;endotelio. Rollio può essere visualizzato utilizzando questa tecnica, ogni campo viene registrata per almeno 10 sec. Cellule rotolamento sono identificati dal loro velocità ridotta sulla superficie endoteliale rispetto a fluire cellule. Questo comportamento deve essere dimostrata per almeno 5 secondi, senza distacco. La cascata di adesione entro i sinusoidi epatici si svolge in un ambiente a basso taglio e studi in vivo hanno confermato di rotolamento minimo con solo un breve passo tethering. Abbiamo confermato che il saggio flusso riflette l&#39;ambiente dei sinusoidi epatici dimostrando che meno del 10% di leucociti aderenti persistentemente rotolare stimolato HSEC in questi saggi. Il passo successivo della cascata adesione è ferma adesione. Aderenza totale può essere calcolato dalla seconda fase di registrazione durante il bolo tampone di lavaggio (passo 7.3). Analisi offline consente al numero totale di cellule saldamente aderenti da contare in ogni campo (Figura 5). Cellule saldamente aderenti sono definiti come cellule che sono fermi o shapechanged con un comportamento scansione lenta.Il numero medio di cellule per campo può quindi essere calcolato. Questo dato può essere utilizzato, in combinazione con la superficie totale del campo visivo (determinata secondo un reticolo o equivalente), concentrazione di linfociti (tipicamente 1 x 10 6 cellule / ml) e la portata per esprimere la misura di linfociti aderenza come cellule aderenti / mm 2/10 6 cellule perfuso. Studiando il modello di adesione prevede l&#39;analisi degli ultimi due gradini della cascata di adesione compresa la forma-cambiamento, strisciando e migrazione transendoteliale. Leucociti aderenti alla superficie superiore del monostrato HSEC appaiono fase-luminoso mentre quelli che sono migrati attraverso il monostrato appare fase di buio (Figura 6). Le cellule possono quindi essere classificati come espositrici adesione &#39;statica&#39; (nonmigrated / anno), &#39;forma-cambiato&#39; morfologia o come &#39;migrato&#39; e le singole categorie sono poi espressi come percentuale delpopolazione totale adesivo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1.jpg" /> Figura 1. Monostrato di cellule endoteliali epatiche primarie umane sinusoidali all&#39;interno della camera di flusso. A) Microslides riempito con supporti contenenti monostrato di cellule endoteliali prima dell&#39;inizio del flusso adesione saggio. B) fase di contrasto immagine confluenti monostrato endoteliale, cellule endoteliali dovrebbero essere seminate in MicroSlide che sono stati prerivestita (per le cellule endoteliali epatiche umane può essere eseguito un Tipo di coda di topo collagene 1) ed è essenziale che le cellule endoteliali sono sani di cultura e confluenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src= &quot;/ Files/ftp_upload/51330/51330fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Fluire camera di dosaggio. Una camera di dosaggio flusso set-up può essere visto qui, si compone di una camera trasparente che è montato su un microscopio invertito. Un riscaldatore è posta nella camera e deve essere controllata termostaticamente per mantenere una temperatura di 37 ° C. Dovrebbe esserci porte disponibili per collegare tubi in silicone da un MicroSlide all&#39;interno della camera ad una pompa a siringa che si trova all&#39;esterno. Il MicroSlide viene posizionato direttamente sul palco microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3.jpg" /> Figura 3. Pompa a siringa. Una pompa a siringa è collegataEd tramite tubi in silicone alla camera di flusso. La pompa è impostata su un tasso di ritiro specifico a seconda della sollecitazione di taglio desiderata necessaria per il test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4.jpg" /> Figura 4. Valvola di collegamento a fluire da camera. A) Una valvola a solenoide elettronico permette la commutazione tra due siringhe contenenti sia cellule o supporti praticamente senza spazio morto. B) Una volta che la valvola è arrossato e le due canne sono istituiti, il tubo di silicone dalla valvola è collegato alla camera di flusso. E &#39;fondamentale che quando si collega l&#39;adattatore sul tubo in silicone alla porta della camera di flusso vi è una interfaccia liquido / liquido. &lt;a href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5.jpg" /> Figura 5. Misurazione del totale adesione leucocitaria. Durante gli ultimi due minuti del bolo fase di tampone di lavaggio (come delineato nel protocollo), un minimo di dieci campi aleatori deve essere registrata. Questi possono essere analizzati off-line e il numero totale di cellule saldamente aderenti si contano in ogni campo. Totale adesione dei leucociti può essere paragonato tra le camere di controllo e quelli pretrattati con anticorpi bloccanti, qui vi mostriamo un campo rappresentante di un vetrino di controllo e uno scivolo pretrattato con adesione intracellulare molecule-1 (ICAM-1) anticorpo bloccante. Le frecce sono state aggiunte per evidenziare i leucociti aderenti, nella rappresentazionetiva campo dal vetrino di controllo vi sono un totale di 25 leucociti identificati e nel ICAM-1 pattino ci sono un totale di 13 leucociti identificati. Barre di scala = 100 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6.jpg" /> Figura 6. Analisi del modello di adesione leucocitaria su monostrati endoteliali mediante microscopia a contrasto di fase. Analisi offline campi registrati può anche essere usato per studiare la direzione e la velocità di adesione leucocitaria. Passaggi specifici della cascata di adesione possono essere visualizzati e quantificati con l&#39;imaging a contrasto di fase. Fase cellule brillanti che sono saldamente aderenti ma non attivato può essere definito l&#39;adesione &#39;round&#39;, le cellule che sono activated e la fase luminosa può essere definito &#39;cambiato forma&#39; e le cellule che sono fase oscura sono le cellule che hanno subito migrazioni transendoteliale e possono essere chiamati &#39;migrazione&#39;. L&#39;immagine mostra esempi di ogni modello di adesione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> .

Leucociti assunzioni al fegato avviene nei canali specializzati delle sinusoidi epatici che sono rivestite da cellule endoteliali sinusoidali epatiche uniche. Fase microscopio a contrasto di reclutamento dei leucociti attraverso l&#39;endotelio sinusoidale epatico umano in condizioni di shear stress fisiologico può facilitare la delucidazione dei meccanismi molecolari che sono alla base di questo processo.

Un flusso di Adesione saggio per studiare Leucocyte reclutamento a epatici umani sinusoidali Endotelio in condizioni di stress Shear

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare i meccanismi di reclutamento dei leucociti attraverso le cellule endoteliali umane del fegato in presenza di livelli fisiologici di stress di taglio. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto uno strato monocellulare confluito di cellule endoteliali sinusoidali epatiche umane in una microcapsula, che successivamente viene stimolato con citochine infiammatorie. Il secondo passaggio consiste nell'isolare i linfociti dal sangue periferico.Successivamente, la microvetrina viene collegata a un sistema di saggio in flusso e perfusa con linfociti in presenza di uno stress di taglio fisiologicamente rilevante. L'ultimo passaggio consiste nell'osservare le interazioni dei linfociti in condizioni di flusso mediante un microscopio a contrasto di fase. Infine, l'analisi off-line delle immagini a contrasto di fase acquisite durante il saggio in flusso viene utilizzata per confrontare l'effetto di diversi inibitori sul reclutamento dei linfociti attraverso le cellule endoteliali epatiche.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'epatologia, ad esempio quali combinazioni di proteine di adesione e recettori per chemochine sono importanti per il reclutamento di diverse popolazioni di cellule immunitarie attraverso l'endotelio sinusoidale e all'interno del parenchima epatico. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie epatiche infiammatorie croniche, la maggior parte delle quali è determinata dal reclutamento di linfociti nel tessuto epatico. Comprendere i meccanismi molecolari potrebbe portare allo sviluppo di nuove terapie antinfiammatorie.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul reclutamento di cellule infiammatorie nel fegato umano, può essere applicato anche ad altri tipi cellulari, come le cellule endoteliali, isolate dalla vena ombelicale o da altri letti vascolari. Per iniziare, preparare una soluzione lavorativa di 200 microgrammi per millilitro di collagene di coda di ratto, tipo uno, diluendola da una soluzione madre in PBS sterile.Quindi iniettare 30 microlitri di collagene diluito in ogni canale di una microcamera a sei canali e incubare per due ore a 37 gradi Celsius. Successivamente, preparare il terreno completo aggiungendo al terreno basale per endoteli umani L-glutammina, penicillina e streptomicina, siero umano inattivato termicamente, fattore di crescita dell'endotelio vascolare umano e fattore di crescita epatocita. Poi, utilizzando tripsina-EDTA, raccogliere le cellule endoteliali sinusoidali epatiche umane coltivate da un matraccio T75 confluenti, centrifugare le cellule, lavarle in PBS e quindi risospendere a 3 × 10⁶ cellule per millilitro nel terreno completo.Successivamente, lavare la microcamera tre volte con PBS, quindi aggiungere 30 microlitri di sospensione cellulare in ogni canale della microcamera rivestita di collagene. Lasciare le cellule aderire per un'ora in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con un'atmosfera al 5% CO2. Dopo che le cellule hanno aderito, riempire i pozzetti su entrambi i lati di ogni canale con mezzo completo e riposizionarli nell'incubatore per 24 ore.Dopo 24 ore, utilizzare un microscopio a contrasto di fase invertito per verificare che la crescita cellulare abbia raggiunto l'80% di confluenza. Successivamente, preparare le citochine per la stimolazione cellulare aggiungendo 10 nanogrammi per millilitro di TNF-alfa e 10 nanogrammi per millilitro di interferone-gamma a un millilitro di terreno completo. Quindi, 24 ore prima di eseguire il saggio di adesione, sostituire il terreno di crescita cellulare con 0,1 millilitri di terreno supplementato con citochine per stimolare le cellule, purificare la frazione mononucleata dal sangue intero mediante centrifugazione su gradiente di densità su un mezzo di separazione cellulare appropriato, come linfociti leggeri, per 25 minuti a 800 volte la forza di gravità.Quindi trasferire la frazione mononucleata in un nuovo tubo e portare a volume con PBS contenente BSA allo 0,1% volume per volume; centrifugare il tubo per 10 minuti a 125 ×g per esaurire la soluzione dalle piastrine. Successivamente, lavare il pellet con PBS contenente BSA allo 0,1% volume per volume e quindi centrifugare per 10 minuti a 800 ×g. Risospendere il pellet in 10 millilitri di RPMI contenente BSA allo 0,1% volume per volume, posizionare le cellule in una fiala da coltura tessutale trattata T75 e incubare per un'ora per consentire l'adesione dei monociti nella frazione.Successivamente, rimuovere con attenzione il sopranatante arricchito di linfociti e centrifugare le cellule a 800 × g per 10 minuti. Quindi pret trattare i linfociti isolati risospendendoli in soluzione RPMI contenente BSA allo 0,1% volume su volume e 200 nanogrammi per millilitro di anticorpi bloccanti la funzione specifica della tossina della pertosse o inibitori molecolari di piccole dimensioni dei recettori per chemochine. Incubare i linfociti nella soluzione inibitoria per 30 minuti a 37 °C, quindi centrifugare le cellule e lavarle in PBS con BSA allo 0,1% volume su volume.Successivamente, centrifugare nuovamente le cellule e risospendere in mezzo per citofluorimetria a una concentrazione di uno per 10 alla sesta cellule per millilitro. Preriscaldare una camera ambientale trasparente a controllo termostatico a 37 gradi Celsius. La camera deve essere dotata di porte per l'inserimento di tubi di silicone e di un collegamento elettrico per una valvola solenoide.Riempire una siringa di vetro da 50 millilitri con blocco erogatore con 10 millilitri di acqua distillata sterile. Quindi collegare un tratto di tubo in silicone lungo 25 centimetri al raccordo della siringa e inserire la siringa in una pompa per siringa. Regolare la velocità di aspirazione della pompa seguendo le istruzioni del produttore della microcamera per mantenere uno sforzo di taglio di 0,05 pascal o 0,5 dine per centimetro quadrato.Scartare gli stantuffi di due siringhe da cinque millilitri e collegare i cilindri ai due porti di ingresso di una valvola solenoide elettronica utilizzando un centimetro di tubo in silicone. Successivamente, collegare 12 centimetri di tubo in silicone al porto di uscita della valvola. Inserire tampone di lavaggio acellulare in entrambe le valvole delle siringhe e sciacquare la valvola solenoide elettronica.Assicurarsi che il tampone fluisca da un serbatoio attraverso la valvola e nel tubo di silicone di uscita. Successivamente, ruotare l'interruttore della valvola sull'altro serbatoio e verificare che il tampone continui a fluire. Rimuovere tutte le bolle d'aria dal sistema.Quindi sostituire il buffer di lavaggio in uno dei barilotti con la sospensione di linfociti contenente un milione di cellule per millilitro. Collegare il tubo di silicone della pompa per siringa a un'estremità di un canale microscopico scelto utilizzando un adattatore per microscopio. Successivamente, collegare il tubo di silicone dalla valvola di uscita all'estremità opposta dello stesso canale microscopico, sempre mediante un adattatore per microscopio.Successivamente, fissare la microvetrina sul portapreparati del microscopio con clip o nastro adesivo per evitarne lo spostamento. Impostare il microscopio sull'obiettivo 10 x con l'impostazione di fase appropriata prima di iniziare la perfusione. Assicurarsi che una telecamera sia correttamente collegata al microscopio e pronta a trasmettere le immagini a un monitor per la registrazione.Assicurarsi che il monostrato endoteliale sia a fuoco; utilizzando una pompa per siringa, perfondere lo strato endoteliale con una soluzione tampone priva di cellule per due minuti, avviando il ritiro della pompa per siringa al fine di rimuovere eventuali detriti o anticorpi bloccanti non legati. Successivamente, commutare la valvola per consentire un'infusione bolus di soluzione di linfociti per cinque minuti a una parete costante. Stress di taglio di 0,05 pascal durante gli ultimi due minuti dell'infusione bolus di linfociti.Registri 10 campi casuali lungo la lunghezza del vetrino microfluidico per 10 secondi. Ogni spostamento tra le registrazioni deve essere effettuato in direzione opposta al flusso. Per evitare di registrare due volte lo stesso linfocita rotolante dopo il bolo di linfociti, riportare la valvola alla posizione iniziale e proseguire con un bolo di cinque minuti di tampone di lavaggio privo di cellule.Registrare un secondo passaggio di 10 campi selezionati casualmente per cinque secondi ciascuno. Durante gli ultimi due minuti di questo bolo, il movimento di rotolamento dei linfociti può essere facilmente visualizzato mediante questa tecnica di saggio di flusso. Le cellule in rotolamento sono identificate dalla ridotta velocità sulla superficie endoteliale rispetto alle cellule in flusso.In questo saggio di flusso, meno del 10% dei linfociti aderenti ha mostrato un rotolamento persistente sulle cellule endoteliali stimolate, confermando che il saggio di flusso riflette l'ambiente dei sinusoidi epatici. La registrazione ottenuta dal bolo di tampone di lavaggio viene utilizzata per valutare l'adesione totale dei linfociti.Le cellule aderenti ferme sono definite come cellule stazionarie o con forma alterata e comportamento di strisciamento lento. Qui vengono mostrati campi rappresentativi provenienti da un vetrino di controllo e da un vetrino pretrattato con molecola di adesione intercellulare, un anticorpo bloccante. L'estensione dell'adesione dei linfociti in ciascuna condizione è espressa come numero di cellule aderenti per millimetro quadrato per milione di cellule perfuse.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la microscopia confocale, per rispondere a ulteriori domande, ad esempio sull'esatta sede della migrazione transendoteliale o sui cambiamenti del citoscheletro che avvengono durante il reclutamento sotto stress di taglio dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori che studiano l'infiammazione nel fegato o in altri organi, permettendo di esplorare come popolazioni specifiche di cellule endoteliali d'organo regolino il processo di reclutamento dei leucociti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come valutare il reclutamento dei linfociti attraverso le cellule endoteliali umane del fegato e di come enumerare le cellule immunitarie in diverse fasi della cascata di adesione.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo rapporto fornisce una rappresentazione visiva di piatti paralleli analisi del flusso della camera per lo studio delle interazioni tra leucociti endoteliale sotto fisiologiche sollecitazioni di taglio. Questo metodo è particolarmente utile per indagare il ruolo di endoteliale (E)-selectina e leucociti E-selectina ligandi che leucociti innescare rotolamento sulla superficie delle cellule endoteliali.

Analisi di fisiologica E-selectina-mediata rotolamento dei leucociti sull&#39;endotelio microvascolari

Questo è un metodo per visualizzare l'adesione dei leucociti all'endotelio in raccolte serbatoi in pressione. La tecnica consente di studiare l'adesione vascolare in condizioni di flusso di taglio con differenti pressioni intraluminali fino a 200 mmHg così imitare-zione le condizioni fisiopatologiche di alta pressione sanguigna.

Imaging adesione dei leucociti all&#39;endotelio vascolare ad alta pressione intraluminale

Camere di flusso Microfluidic incisi da fotolitografia e fabbricati da PDMS sono applicate per sondare gli esiti funzionali associati alla disfunzione CE e l'infiammazione. In un esperimento rappresentativo, la capacità di sforzo di taglio differenziale di modulare l'adesione cellulare monocitica di citochina attivato CE monostrati è dimostrata.

On-Chip Fenotipizzazione Endothelial infiammatoria

Questo video mostra un test basato sul flusso laminare per caratterizzare l'interazione tra leucociti e partner cellulari come le cellule endoteliali. Questo metodo fornisce informazioni dinamiche sull'adesione, la deadesione e la trasmigrazione dei leucociti quando perfusi su uno strato intatto e confluente di cellule vascolari.

Un test basato sul flusso laminare per studiare le interazioni tra leucociti e cellule endoteliali

Le camere di flusso utilizzate negli esperimenti di adesione sono tipicamente costituite da percorsi di flusso lineari e richiedono più esperimenti a diverse velocità di flusso per generare una mappa di adesione a taglio.  SynVivo-SMN consente la generazione di mappe di adesione al taglio utilizzando un singolo esperimento che utilizza volumi di microlitri, con conseguente notevole risparmio di tempo e materiali di consumo.

Generazione di Shear Adesione mappa usando SynVivo reti microvascolari sintetico

È riportato un metodo di quantificazione neutrofili. Questo metodo crea un ambiente di flusso dinamico simile a quello riscontrato in un vaso sanguigno. Permette la ricerca di neutrofili adesione a entrambi le molecole purificate di adesione (ligando) o substrato di cellule endoteliali (HUVEC) in un contesto simile all'ambiente in vivo con lo stress puro.

Umano camera di flusso neutrofili saggio

Qui, presentiamo un protocollo che permette al ricercatore di valutare dinamiche reclutamento di leucociti ex vivo collegando una camera rivestita con molecole di adesione endoteliali derivate al sistema circolatorio di un topo. Questo metodo offre notevoli vantaggi, in quanto permette di valutazione leucociti in condizioni biologiche relative.

Valutare interazioni leucociti-endotelio in condizioni di flusso in un Ex Vivo Assay Autoperfused Microflow Camera

Questo test di adesione flusso fornisce un semplice, modello alto impatto di cellule epiteliali interazioni delle cellule T. Una pompa siringa viene usato per generare forze di taglio, e la microscopia confocale cattura immagini per la quantificazione. L'obiettivo di questi studi è quello di quantificare in modo efficace l'adesione delle cellule T con condizioni di flusso.

Saggio di adesione Sotto Shear stress per lo studio di linfociti T-Adhesion Molecule Interazioni

Leucociti avidamente interagiscono con le cellule vascolari e le piastrine dopo lesione di parete del vaso o durante l'infiammazione. Qui, descriviamo un semplice test a flusso laminare per caratterizzare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulari.

Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti

Qui, presentiamo un protocollo integrato che misura sottopopolazione del monocito traffico sotto flusso in vitro mediante uso di specifici marcatori di superficie e microscopia a fluorescenza confocale. Questo protocollo consente di esplorare reclutamento sequenziale passaggi anche per quanto riguarda il profilo di altri sottotipi del leucocita utilizzando altri specifici marcatori di superficie.

Studio simultaneo del reclutamento di sottopopolazioni monocito sotto flusso In Vitro

Questo protocollo dettagliato fornisce una descrizione dettagliata della messa a punto sperimentale e analisi dei dati per la valutazione delle risposte infiammatorie in hiPSC-ECs e l'analisi di adesione del leucocita sotto flusso fisiologico.

Saggio di microfluidic per la valutazione di adesione del leucocita alle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-ECs)

Scopri un saggio di adesione in flusso per studiare il reclutamento dei leucociti sull'endotelio sinusoidale epatico umano in condizioni di stress da taglio fisiologico. Questo metodo aiuta a identificare le interazioni molecolari chiave.

Un flusso di Adesione saggio per studiare Leucocyte reclutamento a epatici umani sinusoidali Endotelio in condizioni di stress Shear (Video) | JoVE Journal

Un flusso di Adesione saggio per studiare Leucocyte reclutamento a epatici umani sinusoidali Endotelio in condizioni di stress Shear

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