Un flusso di Adesione saggio per studiare Leucocyte reclutamento a epatici umani sinusoidali Endotelio in condizioni di stress Shear

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare i meccanismi di reclutamento dei leucociti attraverso le cellule endoteliali del fegato umano in presenza di livelli fisiologici di puro stress. Ciò si ottiene preparando prima un monostrato confluente di cellule endoteliali sinusoidali epatiche umane in un micro vetrino, che viene successivamente stimolato con citochine infiammatorie. Il secondo passo consiste nell'isolare i linfociti dal sangue periferico.

Successivamente, il microvetrino viene collegato a un sistema di analisi del flusso e perfuso con i linfociti in presenza di stress puro fisiologicamente rilevante. Il passaggio finale consiste nel visualizzare le interazioni dei linfociti in condizioni di flusso con un microscopio a contrasto di fase. In definitiva, l'analisi offline delle immagini a contrasto di fase acquisite durante il saggio a flusso viene utilizzata per confrontare l'effetto di vari inibitori sul reclutamento dei linfociti nelle cellule endoteliali epatiche.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epatologia, come ad esempio quali combinazioni di proteine di adesione e recettori delle chemochine sono importanti per il reclutamento di diverse popolazioni di cellule immunitarie nell'endotelio sinusoidale e nel parenchima epatico. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della malattia epatica infiammatoria cronica, la maggior parte delle quali è guidata dal reclutamento dei linfociti nel tessuto epatico. Comprendere i meccanismi molecolari potrebbe portare a nuove terapie antinfiammatorie.

Anche se questo metodo può fornire informazioni sul reclutamento di cellule infiammatorie nel fegato umano. Può essere applicato anche ad altri tipi di cellule come le cellule endoteliali, isolate dalla vena ombelicale o da altri letti vascolari. Per iniziare, preparare una soluzione di lavoro di 200 microgrammi per millilitro di collagene di coda di ratto, tipo uno, diluendola da una soluzione madre in PBS sterile.

Quindi iniettare 30 microlitri di collagene diluito in ciascun canale di un microvetrino a sei canali e incubare per due ore a 37 gradi Celsius. Successivamente, preparare terreni completi integrando i terreni basali endoteliali umani con L-glutammina, penicillina e streptomicina ab inattivati termicamente, siero umano, fattore di crescita dell'endotelio vascolare e fattore di crescita degli epatociti. Quindi, utilizzando la tripsina EDTA, raccogliere cellule endoteliali sinusoidali umane epatiche coltivate da un pallone confluente T 75, pellettare le cellule lavandole in PBS e quindi risospenderle a tre volte 10 delle sesti cellule per millilitro in terreno completo.

Successivamente, lavare il micro vetrino tre volte con PBS e quindi aggiungere 30 microlitri di sospensione cellulare in ciascun canale del micro vetrino rivestito di collagene. Lasciare le cellule ad aderire per un'ora in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con un'atmosfera al 5% di CO2. Dopo che le cellule hanno aderito, riempire le porte su entrambi i lati di ciascun canale con un mezzo completo e rimetterle nell'incubatore per 24 ore.

Dopo 24 ore, utilizzare un microscopio a contrasto di fase invertito per valutare che la crescita cellulare abbia raggiunto l'80% di fluenza. Successivamente, preparare le citochine per la stimolazione cellulare aggiungendo 10 nanogrammi per millilitro di TNF alfa e 10 nanogrammi per millilitro, interferone gamma a un millilitro di terreno completo. Quindi, 24 ore prima di eseguire il test di aderenza, ha sostituito il terreno di coltura cellulare con 0,1 millilitri di terreno integrato con citochine per stimolare le cellule, purificare la frazione mononucleata dal sangue intero mediante centrifugazione in gradiente di densità su un'appropriata separazione cellulare, mezzi di centrifugazione come la luce linfografica per 25 minuti a 800 volte la gravità.

Quindi trasferire la frazione mononucleata in una nuova provetta e rabboccarla con PBS contenente lo 0,1% di volume per volume BSA: centrifugare la provetta per 10 minuti a 125 volte la gravità per esaurire la soluzione di piastrine. Successivamente, lavare il pellet con PBS contenente lo 0,1% di volume per volume di BSA, quindi centrifugare per 10 minuti a 800 volte la gravità. Resus sospendere il pellet in 10 millilitri di RPMI contenente lo 0,1% in volume per volume BSA, porre le cellule in un pallone T 75 trattato con coltura tissutale e incubare per un'ora per consentire l'adesione dei monociti nella frazione.

Quindi, rimuovere con cura il surnatante arricchito di linfociti e pellettare le cellule a 800 volte la gravità per 10 minuti. Quindi pretrattare i linfociti isolati mediante resus, sospendendoli in una soluzione RPMI contenente lo 0,1% in volume per volume di BSA e 200 nanogrammi per millilitro di anticorpi che bloccano la funzione specifica della tossina della pertosse o inibitori di piccole molecole dei recettori delle chemochine. Incubare i linfociti nella soluzione inibitrice per 30 minuti a 37 gradi Celsius, quindi pellettare le cellule e lavarle in PBS con lo 0,1% di volume per volume di BSA.

Quindi pellettare nuovamente le celle e poi risospenderle nel mezzo di flusso a una concentrazione di una volta 10 per la sesta cella per millilitro. Preriscaldare una camera climatica trasparente controllata termostaticamente a 37 gradi Celsius. La camera deve contenere porte per l'inserimento di tubi in silicone e un'alimentazione elettronica per un'elettrovalvola.

Riempire una siringa di vetro da 50 millilitri con un blocco dell'esca con 10 millilitri di acqua distillata sterile. Quindi collegare un tubo in silicone di 25 centimetri alla porta della siringa e inserire la siringa in una pompa a siringa. Regolare la velocità di estrazione della pompa secondo le istruzioni del produttore del micro vetrino per mantenere uno stress puro di 0,05 pascal o 0,5 dines per centimetro quadrato.

Scartare gli stantuffi da due siringhe da cinque millilitri e collegare i cilindri alle due porte di afflusso di un'elettrovalvola elettronica utilizzando un centimetro di tubo in silicone. Quindi collegare 12 centimetri di tubo in silicone alla valvola di deflusso. Inserire il tampone di lavaggio privo di cellule in entrambe le valvole a siringa e lavare l'elettrovalvola elettronica.

Assicurarsi che il tampone scorra da un cilindro attraverso la valvola e nel tubo in silicone di deflusso. Quindi, ruotare l'interruttore della valvola sull'altro cilindro e assicurarsi che il tampone continui a scorrere. Rimuovere tutte le bolle dal sistema.

Quindi sostituire il tampone di lavaggio in uno dei fusti con la sospensione linfocitaria contenente da 10 a 60 cellule per millilitro. Collegare il tubo in silicone della pompa a siringa a una porta di un canale di scorrimento micro scelto utilizzando un adattatore di scorrimento micros. Quindi collegare il tubo in silicone dalla valvola di deflusso alla porta opposta sullo stesso canale di micro scorrimento, anch'esso con un adattatore di micro scorrimento.

Quindi, fissare il micro vetrino sul tavolino del microscopio con clip o nastro adesivo per evitare che si muova. Impostare il microscopio sull'obiettivo 10 x con l'impostazione di fase appropriata prima di iniziare la perfusione. Assicurarsi che una fotocamera sia collegata correttamente al microscopio e pronta a trasmettere le immagini a un monitor per la registrazione.

Assicurarsi che il monostrato endoteliale sia a fuoco utilizzando una pompa a siringa, perfondere lo strato endoteliale con un tampone di lavaggio privo di cellule per due minuti iniziando a estrarre la pompa a siringa per rimuovere eventuali detriti o anticorpi bloccanti non legati. Quindi cambiare la valvola per consentire un bolo di cinque minuti di soluzione linfocitaria a una parete costante. Stress puro 0,05 pascal durante gli ultimi due minuti del bolo linfocitario.

Registra 10 campi casuali lungo la lunghezza del diapositiva micros per 10 secondi. Ogni movimento tra le registrazioni deve essere effettuato contro la direzione del flusso. Per evitare di registrare la stessa cellula rotante due volte Dopo il bolo dei linfociti, riportare la valvola nella posizione iniziale per seguire con un bolo di cinque minuti di tampone di lavaggio privo di cellule.

Registra un secondo passaggio di 10 campi selezionati casualmente per cinque secondi ciascuno. Durante gli ultimi due minuti di questo bolo, il movimento di rotolamento dei linfociti può essere facilmente visualizzato utilizzando questa tecnica di saggio a flusso. Le cellule rotanti sono identificate dalla velocità ridotta sulla superficie endoteliale rispetto alle cellule che scorrono .

In questo saggio di flusso. Meno del 10% dei linfociti aderenti si è rotolato in modo persistente sulle cellule endoteliali stimolate, il che conferma che il test di flusso riflette l'ambiente dei sinusoidi epatici. La registrazione del bolo del tampone di lavaggio viene utilizzata per valutare l'aderenza totale dei linfociti.

Le cellule ad aderenza ferma sono definite come cellule stazionarie o che cambiano forma con un lento comportamento di gattonamento. Qui sono mostrati i campi rappresentativi di un vetrino di controllo e di un vetrino pretrattato con una molecola di adesione intercellulare, un anticorpo bloccante. L'entità dell'aderenza linfocitaria in ciascuna condizione è espressa come cellule di aderenza per millimetro quadrato per milione di cellule perfuse.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la microscopia confocale per rispondere a domande aggiuntive come l'esatta radice della migrazione transendoteliale o i cambiamenti citoscheletrici che avvengono durante il reclutamento sotto stress puro dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori che studiano l'infiammazione nel fegato o in altri organi per esplorare come le popolazioni di cellule endoteliali specifiche per organo governano il processo di reclutamento dei leucociti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare il reclutamento dei linfociti attraverso le cellule endoteliali del fegato umano ed enumerare le cellule immunitarie nelle diverse fasi della cascata di adesione.