Imaging Plasma membrana Deformazioni Con pTIRFM

L'obiettivo di questa procedura è mostrare come la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale basata sulla polarizzazione sia implementata per lo studio del rimodellamento della membrana durante l'esocitosi regolata. Ciò si ottiene assicurandosi innanzitutto che gli elementi ottici, vale a dire la piastra a quarto d'onda e i cubi polarizzatori, siano posizionati correttamente per generare polarizzazioni di eccitazione p e s discrete. Il secondo passo consiste nel verificare che i fasci p e s siano coline, passino attraverso l'asse ottico del microscopio e illuminino la stessa porzione del campo visivo quando sono in fluorescenza a riflessione interna totale o TIRF.

Successivamente, le cellule da visualizzare vengono colorate con il die di carbo cianuro, die D e stimolate con uno stimolo depolarizzante per innescare l'esocitosi. Il passaggio finale consiste nell'acquisire immagini della fusione di vescicole dense del nucleo mentre si è in TIRF. In definitiva, P-T-I-R-F viene utilizzato per acquisire immagini in tempo reale per monitorare i cambiamenti topologici della membrana che derivano dall'esocitosi delle cellule di cromina.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la pirometria e la capacità di membrana, è che ptro F riporta direttamente una curvatura della membrana e, per estensione, la dilatazione della porta di fusione. La parte più ripida della curva di apprendimento con questa tecnica consiste nell'imparare ad allineare le polarizzazioni di eccitazione p e s, in modo che viaggino in coline attraverso l'asse ottico del microscopio e illuminino la stessa parte del campo di imaging. Un secondo problema che si pone spesso riguarda la colorazione cellulare, vale a dire per quanto tempo esporre le cellule a dd e cosa costituisce una cellula ben colorata rispetto a una scarsamente colorata.

A dimostrare la procedura sarà TA square row, uno studente laureato del nostro laboratorio. Per iniziare ad accendere tutti i componenti del microscopio, i laser e i computer dirigono un raggio dal laser a 488 nanometri al piano focale posteriore della lente con apertura numerica da 1,49. Se il raggio laser è focalizzato sul piano focale posteriore, emergerà, fascicolerà e apparirà come un piccolo punto ben definito sul soffitto direttamente sopra l'obiettivo.

Quindi regolare lo specchio del galvanometro X in modo che il raggio laser venga spostato fuori asse ed emerga dall'obiettivo ad angoli progressivamente più ripidi rispetto alla normale dell'obiettivo. Successivamente, verificare che la riflessione interna totale o TIR sia stata raggiunta. Aggiungere 10 microlitri di microsfere fluorescenti a un millilitro di volume di soluzione salina fisiologica e in una piastra con fondo di vetro dovrebbe essere rilevata solo la fluorescenza delle microsfere sul fondo della capsula più vicina all'interfaccia TIR.

Il rilevamento di microsfere fluttuanti indica che l'angolo tra la luce incidente e la normale oggettiva è insufficiente. Per l'imaging basato sulla polarizzazione, utilizzare il raggio allineato a 488 nanometri come guida e regolare la posizione del raggio laser grezzo a 561 nanometri in modo che viaggi lungo un percorso ottico identico. Il laser a 561 nanometri sarà utilizzato per l'imaging del colorante carbo cianuro.

Una lente divergente e specchi si trovano a valle del laser a 561 nanometri. Utilizzando le manopole di regolazione sugli specchi, regolare il raggio in modo che sia co-allineato con il raggio a 488 nanometri e che il punto sia a fuoco sul soffitto. Quando gli specchi del galvanometro sono in posizione zero, un cubo di polarizzazione riflette la componente verticale del campo elettrico e passa la componente orizzontale.

Viene posizionato a valle del fascio polarizzato ellitticamente su un piccolo stadio di traslazione. Per facilitare il successivo allineamento della polarizzazione, i percorsi dei raggi utilizzano un secondo cubo polarizzatore e specchi per ricombinare i raggi. Un otturatore è posizionato tra il primo cubo di polarizzazione e lo specchio componente verticale.

Un secondo otturatore è posizionato tra lo specchio componente orizzontale e il secondo cubo di polarizzazione. Questi otturatori sono controllati dal software di imaging, consentendo all'utente di selezionare rapidamente tra le polarizzazioni del fascio. Utilizzare un filtro polarizzatore per verificare l'orientamento del campo elettrico in ciascun percorso del raggio.

Un filtro polarizzatore consentirà solo la trasmissione in linea con l'asse del filtro. Verificare che i componenti verticale e orizzontale del raggio laser siano allineati tra loro e con il raggio a 488 nanometri, effettuare le regolazioni necessarie. I tre raggi dovrebbero essere tutti focalizzati sul piano focale posteriore ed emergere fascicolati dall'obiettivo nello stesso punto del soffitto.

Questo punto può essere contrassegnato da una X per facilitare l'allineamento futuro. Quindi posiziona una goccia di olio da immersione sull'obiettivo. Posizionare il piatto contenente microsfere fluorescenti.

Sull'obiettivo, entrare in TIR spostando lo specchio del galvanometro X nel software di spostamento dello specchio in TIR. La componente verticale del fascio è la polarizzazione S e la componente orizzontale del fascio è ora il centro di polarizzazione P, la piastra a quarto d'onda A o qw nel percorso del fascio. Immediatamente a valle dell'apertura laser, osservate ogni campo evanescente polarizzato con un campione di domino a bastoncello, che si prevede sia orientato in modo casuale.

Ruotare la piastra qw in modo che corrisponda all'intensità media dei pixel. Isolare le cellule sane della cromina dalla ghiandola surrenale del gatto come descritto nel protocollo di testo, contare le cellule utilizzando un emocitometro e prepararsi per la trasfezione, le cellule trasfettate con DNA codificano la proteina di interesse utilizzando il sistema di elettroporazione secondo le raccomandazioni del produttore. Le impostazioni che forniscono il miglior equilibrio tra efficienza di trasfezione e tasso di sopravvivenza cellulare.

Per questa preparazione di cellule di cromina bovina sono 1, 100 volt, 40 millisecondi e un impulso dopo la trasfezione delle cellule della piastra delicatamente su piastre trattate con polide luccina e collagene in un millilitro di mezzi di elettrosfilata riscaldati. Metti i piatti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Aggiungere un millilitro di due terreni antibiotici a ciascun piatto Dopo sei ore, cambiare il terreno in terreno normale il giorno successivo.

Le cellule di cromina vengono in genere visualizzate da 48 ore a cinque giorni dopo l'elettroporazione con il sistema di imaging sul software di acquisizione iniziale. Verificare che i laser siano allineati. Controllare il profilo del campo evanescente utilizzando microsfere.

Preparare il sistema di profusione globale e locale. Pulire i serbatoi di soluzione con acqua deionizzata filtrata e riempirli con soluzioni saline basali e fisiologiche stimolanti. Prima dell'imaging, le celle di cromina verificano che la polarizzazione P e l'eccitazione della polarizzazione S illuminino la stessa regione del campo visivo e che le intensità di illuminazione siano approssimativamente equivalenti, come dettagliato nel protocollo di testo.

Procedere ora alla colorazione delle cellule di crominanza bovina con DD.Sciacquare i terreni di coltura dal piatto contenente le cellule di cromina e sostituirli con due millilitri di soluzione salina fisiologica basale. Aggiungere 10 microlitri di DD da 10 millimolari direttamente nel piatto contenente le cellule. Agitare delicatamente il piatto per due-10 secondi prima di rimuovere la soluzione.

Lavare la piastra tre o quattro volte con soluzione salina fisiologica basale per rimuovere eventuali residui di DD, le cellule sono ora colorate e pronte per l'uso. Aggiungere una goccia di olio da immersione all'obiettivo. Posizionare la capsula contenente le cellule di cromina colorate con Dai D sopra l'obiettivo.

Posizionare l'ago per perfusione locale in modo che si trovi a circa 100 micron di distanza dalla cellula. Concentrati sulla membrana cellulare e attiva l'hardware di messa a fuoco automatica immediatamente prima dell'acquisizione dell'immagine di stimolazione cellulare. Iniziare l'acquisizione dell'immagine con le cellule perfuse per 10 secondi con una soluzione basale e poi per 60 secondi con una soluzione depolarizzante di cloruro di potassio da 56 millimolari.

Acquisisci immagini durante la rapida accelerazione tra la polarizzazione P a 561 nanometri e la polarizzazione s a 561 nanometri per monitorare le variazioni delle emissioni p e s di DD e l'eccitazione a 488 nanometri. Per visualizzare la sonda della vescicola trasfettata, l'etichettatura esuberante della membrana delle cellule di cromina si ottiene dopo una breve incubazione con Dai D.In questo esempio, la membrana cellulare viene colorata bene. Una cellula aderente sana mostrerà differenze distinte nelle emissioni di p e s.

L'immagine dell'emissione P mostra un bordo della cella più luminoso rispetto al resto della cella. L'immagine dell'emissione S mostra una fluorescenza approssimativamente uniforme su tutta l'impronta cellulare, calcolata pixel per pixel P su S e p più due s. Le immagini sono sensibili rispettivamente alla curvatura della membrana e alla concentrazione del colorante.

Il CHRO e la cellula mostrati sono stati anche trasfettati con la sinape OIN un fiorino per marcare le vescicole secretorie. Il CHRO e la cellula vengono stimolati con cloruro di potassio per depolarizzare la membrana cellulare e innescare l'esocitosi. Un certo numero di macchie giustamente fluorescenti diventano improvvisamente evidenti quando le dense vescicole del nucleo si fondono.

Per analizzare questo evento di fusione, fotogramma per fotogramma, sono state esaminate le variazioni dell'immagine di sit, un fiorino, po, VS e p più due s. L'intensità fluorescente della fluorescenza di CIT one diminuisce rapidamente man mano che la proteina si diffonde lontano dal sito di fusione. La rientranza che rappresenta il complesso della membrana plasmatica della vescicola fusa diminuisce a un ritmo relativamente più lento.

Questa illustrazione illustra un'interpretazione di queste misurazioni. La deformazione rapida e localizzata della membrana è il risultato dell'afflusso di calcio evocato dallo stimolo, la depolarizzazione della membrana provoca un aumento significativo della fluorescenza G Camp 5G, il che significa un aumento dei livelli di calcio subplasmatico. Viene selezionata una regione di 30 x 20 pixel della cella e le modifiche fotogramma per fotogramma in G camp, 5G, PS e p più due s.

Le intensità dei pixel sono mostrate nelle immagini e nei grafici. Moltiplicato per zero indica il fotogramma prima che sia evidente un cambiamento di PS. Le punte di freccia bianche indicano che la deformazione della membrana è accompagnata da una diminuzione dell'emissione di p più due S.

La proteina citosolica G CAMP 5G è esclusa dall'area dalla vescicola centrale densa fusa. Si noti anche l'improvvisa diminuzione dell'intensità del 5G del campo G a volte zero. L'aumento di lunga durata di POS e la diminuzione di p più due s suggeriscono un poro di fusione che si dilata lentamente come illustrato.

Qui Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire un sistema PTU F e le celle dell'immagine per osservare i cambiamenti topologici della membrana mentre si trovano nel tappeto erboso dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare i cambiamenti nella forma della membrana durante l'esocitosi, l'endocitosi, la citocinesi e la motilità cellulare nelle cellule viventi.