Extracellulare Wire Tetrode registrazione in Brain di Liberamente Walking Insetti

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare l'attività neurale complessa nel cervello e coordinarla con i comportamenti registrati in video di insetti in movimento libero. Questo risultato si ottiene innanzitutto fabbricando un elettrodo flessibile a partire da un filo estremamente sottile, affilandone la punta, testandola e rivestendola con un materiale che ne contrassegni la posizione e stabilizzi il filo all'interno di un tubo di polietilene. Il secondo passaggio consiste nell'inserire l'elettrodo nel cervello, stabilizzarlo con acetato e cera e fissare un anello di protezione contro le sollecitazioni meccaniche sulla testa.

In seguito, l'attività neurale viene registrata insieme alla videoregistrazione del comportamento locomotorio. Sincronizzare il video con la registrazione mediante un impulso di sincronizzazione inviato a un LED e all'amplificatore. L'ultimo passaggio consiste nel depositare rame utilizzando una corrente elettrica continua e intensificare la colorazione mediante il metodo di Tims per visualizzare il sito di registrazione.

Infine, le tecniche di sorting extracellulare multi-unità ad alta densità identificano le unità neurali, mentre l'analisi del video registrato contemporaneamente ai comportamenti consente una correlazione dettagliata tra attività neurale e comportamento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette di utilizzare procedure esistenti per registrare attività neurali extracellulari ad alta densità dal cervello di un insetto mentre esegue un comportamento complesso. Successivamente, ciò consente di identificare la posizione nel cervello in cui si trovavano i Tet roads, e tutto ciò può essere fatto a un costo relativamente contenuto.

Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande fondamentali in neuropatologia correlando i tempi e l'intensità dell'attività neurale in specifiche aree cerebrali al comportamento di un animale in movimento libero. Questo metodo può fornire informazioni sul controllo sensorimotorio, ma può essere applicato anche a qualsiasi comportamento che richieda un insetto in movimento libero, come l'apprendimento dell'orientamento o la navigazione. Generalmente, le persone nuove a questa procedura incontrano difficoltà perché l'inserimento degli elettrodi di registrazione è complesso, e il loro posizionamento e stabilizzazione per la registrazione richiedono tecniche microchirurgiche molto precise.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Le procedure di fabbricazione e impianto dei Tero sono difficili da apprendere perché vengono eseguite con materiali molto piccoli e fragili, ed è necessario prestare la massima attenzione per non danneggiare il tessuto cerebrale. Per preparare i fili Tet Road, posizionare due fili tirati all'interno di un dispositivo motorizzato per avvolgimento rotante.

Avvolgere il tero in una direzione per due minuti a 60 rotazioni al minuto, quindi svolgerlo nella direzione opposta per 30 secondi. Successivamente, utilizzare una pistola termica per fondere i fili insieme, facendo attenzione a non toccare i fili con la pistola. Eseguire tre passate verticali in alto e in basso provenienti da direzioni alternate, con ogni passata che richiede circa 10 secondi.

Quindi aggiungere un tubo di supporto realizzato con un pezzo di tubo in polietilene lungo 30 centimetri. Inserire il tetra lentamente nel tubo di supporto in modo che non si pieghi. Una volta che l'estremità fusa appare all'altra estremità del tubo, tirarla attraverso in modo da ottenere una lunghezza uguale di filo su entrambe le estremità del tubo guida.

Ora afferrare con la pinza l'estremità libera di ciascun filo utilizzando la base della fiamma di un becco Bunsen. Rimuovere con attenzione l'isolante dagli ultimi due o tre millimetri di ciascun filo. Riscaldare il filo finché diventa incandescente, senza farlo arricciare.

Successivamente, utilizzare una pinza per collegare il tero a un adattatore femmina IC maschio che si adatti al dispositivo di registrazione. Inserire l'estremità senza isolante di ciascun filo in una presa diversa dell'adattatore. Aggiungere un perno in ottone per aiutare a mantenere i fili in posizione.

Quindi utilizzare un saldatore a punta fine per riempire il connettore con la saldatura fusa. Successivamente, verificare il corretto collegamento elettrico utilizzando un impedenziometro come descritto nel protocollo testuale allegato. Utilizzando un adattatore inutilizzato separato, creare un piccolo stampo di carta con dei fori nella parte inferiore.

Per i perni della cerniera, trasferire l'adattatore di lavoro nella scatola con il lato della cerniera rivolto verso il basso e i perni che sporgono dalla scatola. Dopo aver sigillato la scatola come descritto nel protocollo testuale, mescolare rapidamente. Preparare l'epossidico bicomponente e versarlo nella scatola.

Per fissare l'adattatore e tutti i fili, attaccare l'estremità più vicina del tubo guida a un lato della scatola con cera dentale, lasciando però il tubo aperto in modo che il tero possa essere tirato liberamente da entrambe le estremità. Dopo che l'epossidico si è indurito e l'assemblaggio dell'attrezzatura è asciutto, il passo successivo è affilare il tero. Iniziare tagliando la punta del tero con una lama affilata di bisturi.

Successivamente, lucidare il tero utilizzando un piccolo utensile rotante montato verticalmente con dischi abrasivi a grana media e fine. Impostare l'utensile rotante su una velocità moderata, tenendo il fascio vicino alla sua estremità. Con una pinzetta, inclinare l'estremità del set di fili ad un angolo di 45 gradi rispetto al disco abrasivo.

È fondamentale che il senso di rotazione dei dischi abrasivi sia orientato lontano dall'angolo ridotto delle estremità dei fili. In caso contrario, potrebbe verificarsi una separazione dei fili. Toccare delicatamente il fascio con il disco abrasivo a grana media per uno o due secondi, quindi toccare il disco abrasivo a grana fine per altri uno o due secondi.

Ripetere questa operazione altre tre volte, ruotando assialmente il fascio di 90 gradi ogni volta. Al termine, utilizzare un microscopio stereoscopico per verificare che l'estremità del fascio presenti una punta affusolata con piccole quantità di isolante rimosse dall'estremità di ciascun filo e che non vi siano sfilacciature, dopo aver ricontrollato le impedenze sia tra i singoli fili sia tra ciascun filo e la piastra di massa.

Il tero collegando la sua punta a una soluzione satura di solfato di rame. Placcia il primo filo con una corrente di 2,5 microampere. Utilizzando un isolatore di stimolo, inietta la corrente per un secondo. Pausa per un secondo e ripeti questo processo tre volte.

Quindi piastrare i restanti tre fili nello stesso modo. Successivamente, verificare nuovamente l'impedenza. Montare l'adattatore sullo stadio della testa di un sistema di registrazione multicanale.

Collegare un perno per insetti piegato a un micro manipolatore e fissare l'estremità del filo tero al perno per insetti con cera dentale dopo aver anestetizzato e fissato una blatta come descritto nel protocollo testuale; utilizzare una lametta per tagliare una piccola finestra tra l'occhio della cellula O dopo aver rimosso la cuticola. Usare la pinzetta per rimuovere i tessuti connettivi e il grasso al fine di esporre il cervello. Successivamente, posizionare la soluzione salina per blatta nella capsula cranica per coprire il tessuto cerebrale ed estrarre il cervello dalla guaina.

Utilizzare una pinzetta fine per afferrare delicatamente la guaina posta sulla sommità del cervello e un'altra pinzetta fine per strappare la guaina nell'area in cui è stato impiantato il filo. Successivamente, utilizzare un ago per insetti per aprire un piccolo foro nella capsula cefalica anteriore rispetto al cervello. Inserire una treccia composta da 3 fili di rame isolati del diametro di 56 micron nel foro.

Per fungere da elettrodo di riferimento a massa, abbassare con il micromanipolatore la punta del tetro fino alla superficie del cervello e posizionarla vicino alla regione di interesse. Posizionare con attenzione due piccoli pezzi di foglio di acetato sottile di due per un millimetro, leggermente più grandi del foro nella capsula cranica, rispettivamente anteriormente e posteriormente al tede.

Abbassare lentamente il tede di 150-250 micron sotto la superficie del cervello, monitorando contemporaneamente la qualità della registrazione. Cercare potenziali extracellulari spontanei di dimensioni moderate o grandi per individuare sia un'area di interesse sia la viabilità generale del tessuto neurale. Quando si è soddisfatti della posizione del tetrodo, avvicinare il più possibile i due pezzi di foglio di acetato al tetrodo senza toccarlo.

È molto importante essere estremamente accurati durante la dissezione e l'innesto, per evitare di strappare i fili. Utilizzando una piccola spatola ottenuta appiattendo la punta di un ago ipodermico, riscaldare la spatola con un becco di Bunsen ad alcol. Successivamente, immergere la spatola nella cera dentale in modo che vi sia cera liquida sulla punta della spatola.

Toccare con attenzione la cera liquida su un'estremità del foglio di acetato più lontana dal tero, permettendo alla cera liquida di sigillare lo spazio tra il foglio di acetato e la cuticola della testa. Continuare a riscaldare nuovamente la spatola e a far cadere una piccola quantità di cera liquida sul foglio di acetato. Procedere gradualmente verso il tero e infine fissare il tero con una piccola quantità di cera dentale.

Evitare di far entrare la cera calda nella cavità e sul cervello. Successivamente, fissare l'elettrodo di riferimento con la cera in modo analogo. Ora riscaldare la cera che collega il tero al micromanipolatore per staccare il tero da quest'ultimo.

Quindi, fare un cappio con il tero nella cera sulla testa per creare un punto di scarico della tensione e coprire il cappio di scarico con la cera. A questo punto, rimuovere con attenzione i vincoli e trasferire il preparato in una capsula di Petri posta su ghiaccio. Fissare il preparato con il lato dorsale rivolto verso l'alto utilizzando perni a sella di grandi dimensioni. Mediante una pistola per colla, applicare un bastoncino di legno in modo che si estenda dal pro noum sull'addome.

Successivamente, fissare la punta del tubo tero all'estremità posteriore della bacchetta con cera dentale. Poi ancorare il tero e l'elettrodo di riferimento all'estremità anteriore della bacchetta con cera dentale. Quindi estrarre il tero dall'estremità del connettore del tubo il più possibile, senza tirare con forza.

Fissarla all'adattatore con della cera per eliminare la possibilità che l'animale possa danneggiare la porzione esposta del tero. Dopo aver rimosso tutti i vincoli, fissare l'elettrodo di riferimento al tubo del tero utilizzando cera dentale. Stabilire registrazioni neurali e video di buona qualità, come indicato nel protocollo testuale, prima di iniziare gli esperimenti comportamentali; per gli esperimenti di camminata, permettere alla blatta di esplorare un'arena in plexiglass; per gli esperimenti di arrampicata.

Utilizzare un'arena lunga e stretta con un ostacolo a ripiano da superare attraverso la scalata o il passaggio al di sotto, oppure un blocco in plexiglass da scalare per l'animale. Durante la registrazione, generare un impulso TTL dal computer mediante un comando MATLAB personalizzato. L'impulso TTL genera un timestamp per il sistema di registrazione e accende o spegne la luce LED per le prove di stimolazione.

Impulsi di corrente tra i fili di registrazione possono essere utilizzati per evocare un comportamento una volta che l'esperimento ha superato i cinque secondi di corrente continua di cinque microampere, applicata attraverso una delle punte dei fili e l'elettrodo di riferimento per depositare rame nel cervello. Per indicare la posizione della punta del filo, vengono mostrati qui i tracciati grezzi di tensione provenienti da singoli elettrodi all'interno di un singolo fascio di fili. Si noti la differenza nei tracciati di tensione tra i diversi elettrodi.

Tre unità sono state classificate utilizzando le MLU. Qui viene riportata una vista tridimensionale dell'energia dell'onda registrata su tre dei quattro elettrodi. Ognuno rappresenta un singolo evento di soglia, codificato a colori in base al cluster a cui è stato assegnato.

Questa istantanea è tratta da un video di una prova di arrampicata; sopra ogni fotogramma sono mostrati la velocità normalizzata, l'altezza della blatta e la frequenza di scarica istantanea di due unità ordinate dal primo fotogramma fino a quello corrente. Il tempo zero indica l'inizio dell'arrampicata; la frequenza di scarica è stata normalizzata da zero a uno, mentre velocità e altezza sono state normalizzate da zero a 0,5 per motivi di visualizzazione. Le marcature sotto ogni fotogramma indicano gli impulsi delle due unità ordinate entro un secondo dal fotogramma corrente. La linea arancione indica l'intervallo di tempo coperto da ogni fotogramma, mentre il rettangolo blu indica il doppio della larghezza del kernel utilizzato per calcolare la frequenza di scarica istantanea del fotogramma corrente.

Questo tracciato è stato registrato nel corpo a forma di ventaglio destro. La frequenza di scarica dell'unità uno uno è aumentata durante la scalata e l'aumento della frequenza di scarica ha preceduto l'aumento della velocità. L'unità uno due era silente prima della scalata, ma ha iniziato a scaricare dopo l'inizio della scalata.

In questa istantanea del test di esplorazione dell'arena, la linea ovale rossa indica la forma della blatta in quel fotogramma e la linea tratteggiata rossa indica la posizione del centro di massa della blatta nei 10 fotogrammi precedenti. Qui vengono mostrate la velocità di svolta e di camminata in avanti, nonché la frequenza di scarica istantanea dell'unità due uno. I picchi dell'unità due, uno entro quattro secondi dal fotogramma corrente sono mostrati sotto il fotogramma.

Come in precedenza, la linea arancione indica l'intervallo di tempo coperto da ogni fotogramma e il rettangolo blu indica il doppio della larghezza del kernel utilizzato per calcolare la frequenza di scarica istantanea per il fotogramma corrente. Questa registrazione è stata effettuata nella parte centrale del corpo a ventaglio. La posizione della blatta e l'orientamento del suo corpo in ciascun fotogramma sono stati estratti mediante software di tracciamento, come descritto nel protocollo del testo, e utilizzati per calcolare la velocità in avanti e la velocità di direzione, nonché la frequenza di scarica istantanea.

La frequenza di scarica dell'unità due uno è aumentata quando la blatta ha iniziato a camminare ed era correlata alla velocità di cammino. Per molte unità del complesso centrale, l'aumento della frequenza di scarica era limitato a specifici stati di locomozione. Ad esempio, l'unità due uno era sintonizzata sulla camminata in avanti indipendentemente dalla velocità di svolta.

La traiettoria della blatta ricavata dal video è mostrata qui. Il grande punto nero indica il punto di partenza della blatta, e ogni piccolo punto nero indica la posizione della blatta in ciascun fotogramma. La traiettoria è stata codificata con colori per mostrare la frequenza di scarica istantanea dell'unità due, con una scala che va dal blu, indicante una bassa frequenza di scarica, al rosso, indicante un'elevata frequenza di scarica.

In questa mappa della frequenza di scarica dell'unità due uno, l'asse X rappresenta la velocità di rotazione, mentre l'asse Y rappresenta la velocità di camminata in avanti. Una velocità di rotazione positiva indica una rotazione verso destra, mentre una velocità di rotazione negativa indica una rotazione verso sinistra. La posizione dell'elettrodo è determinata dai depositi di rame visibili dopo la procedura istologica, come descritto nel testo.

In alternativa, l'elettrodo può essere ricoperto con un colorante fluorescente e localizzato mediante microscopia confocale. Questa è una serie complessa di tecniche che, anche quando sono state padroneggiate, richiedono un tempo totale di molte ore; è preferibile suddividere le fasi in sottoinsiemi, produrre e testare diversi teros, prima di iniziare un esperimento di impianto.

È importante ricordare di pretestare un tero per verificarne l'impedenza corretta tra i fili e quella individuale, e di prestare la massima attenzione durante l'implantazione e il fissaggio delle soglie nel cervello. Metodi come il tracciamento automatizzato in tempo reale possono essere integrati per semplificare la procedura di analisi. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre e impiantare i tero al fine di coordinare l'attività fisiologica con i complessi comportamenti di un insetto in movimento libero.