Impostazione di un semplice foglio microscopio ottico per In Toto Imaging di C. elegans Sviluppo
5 maggio 2014
Questo protocollo descrive la configurazione di un microscopio foglio leggero e la sua applicazione per l'imaging in vivo di C. elegans embrioni.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare lo sviluppo di C Allergan utilizzando la microscopia a foglio di luce a fluorescenza. Ciò si ottiene impostando prima il microscopio basato su foglio di luce composto da un microscopio verticale e un piccolo set di elementi optomeccanici per generare un foglio di luce. Il secondo passo della procedura consiste nel montare l'embrione.
Gli ultimi passaggi consistono nell'adattare il foglio luminoso sull'embrione e registrarne lo sviluppo. I risultati possono mostrare la dinamica delle proteine marcate in fluorescenza durante lo sviluppo di CL egan attraverso l'analisi di video 3D e time lapse. I principali vantaggi della microscopia lightship rispetto ad altri metodi esistenti, come la microscopia confocale, è che consente un imaging più rapido con una minore fototossicità.
In terzo luogo, questo metodo può fornire informazioni sulla tenuta rispetto allo sviluppo. Può essere applicato anche ad altri sistemi come il roil o il pesce zebra. La dimostrazione della procedura sarà chiara.
Shales, un ingegnere del mio laboratorio e Pauline Linac, un ingegnere del laboratorio di furgoni. Questa sezione descrive l'assembly di configurazione e può essere lasciato assemblato per tutti gli esperimenti. Una volta che i laser, i filtri, il telescopio e il periscopio sono stati posizionati sul tavolo ottico, fissare la lente cilindrica per generare il foglio di luce.
Un obiettivo diverso viene regolato per la messa a fuoco. Il punto focale dell'obiettivo di illuminazione deve coincidere con il punto focale dell'oggetto dell'obiettivo di rilevamento. A questo punto, proiettare il raggio sulla parete o sullo schermo e spostare l'obiettivo di illuminazione lungo l'asse del fascio fino a quando i contorni della proiezione non sono nitidi.
Includere un filtro di emissione a quattro linee e una fotocamera E-M-C-C-D nella configurazione del microscopio. Fissare la seconda fase di traslazione manuale alla prima in modo perpendicolare. Avvitare il gruppo al tavolino del microscopio esistente.
Dopo aver rimosso l'obiettivo di illuminazione della lente cilindrica impostato, posizionare il gruppo sul microscopio e riposizionare il set di illuminazione sui tavolini. Fissare il supporto qve all'intersezione perpendicolare del percorso di illuminazione e del percorso di rilevamento. Ora, controlla il foglio luminoso.
Riempi un bicchiere vete con una soluzione di fluoresceina e posizionalo nel supporto sui palchi. Il foglio luminoso dovrebbe essere visibile. Deve essere orizzontale e centrato rispetto alla lente dell'obiettivo di rilevamento.
Quindi, rimuovere la lente cilindrica. Ottimizza il foglio di luce con la traslazione 3D dell'obiettivo di illuminazione e acquisisci un'immagine per misurare lo spessore del foglio di luce. Questo dipende dall'apertura dell'obiettivo.
Quindi assicurati di sostituire la lente cilindrica. Per prima cosa, tagliate un pezzo di vetro spesso un millimetro, 10 millimetri per 20 millimetri. Usa un pennarello a diamante.
Successivamente, aggiungere 20 microlitri di poli-L lisina su un lato e, una volta asciutto, giustapporlo a un secondo vetrino. In posizione fissa, aggiungere una goccia di agar agar al 5% e lisciarla con il peso di un terzo vetrino posto sulla parte superiore. Dopo che l'agar si è asciugato, rimuovere il terzo vetrino e tagliare il tampone di agar a tre millimetri dal bordo dei due vetrini rimanenti sopra il vetrino senza poli L lisina.
Quindi rimuovere il carrello fisso, lasciando una sporgenza di agar. Rivestire l'agar con 20 microlitri di poli-L lisina e lasciarlo asciugare. Ora metti i vermi GR in un vetro d'orologio riempito con terreno M nove sotto un microscopio da dissezione.
Tagliare i vermi con un bisturi all'altezza della vulva, rilasciando così le uova. Quindi identifica gli embrioni che si trovano nello stadio di interesse e raccoglili con una pipetta micro capillare. Trasferire gli embrioni sulla sporgenza dell'agar del vetrino preparato proprio accanto al bordo del vetrino, non sul bordo dell'agar.
Quindi allineare gli embrioni con una micropipetta capillare rimuovendo il liquido. Per aspirazione, gli embrioni si attaccheranno alla poliolisina. È molto importante posizionare bene gli embrioni per ottenere una buona registrazione, e questo richiede un capillare con la giusta aptura.
Se troppo piccolo, sarà difficile rilasciare gli embrioni. Se troppo grande, sarà difficile controllare strettamente il flusso fuoriuscito e allineare gli embrioni, coprire il vetrino con un terreno M nine in una capsula di Petri e confermare che gli embrioni siano ancora attaccati all'agar utilizzando l'ingrandimento. Ora, fissare il vetrino preparato con gli embrioni al supporto del campione che si inserisce in un vete.
Il supporto è un aggeggio fatto internamente che è progettato per adattarsi a un vete. Quindi, fissa il veterinario a un tavolino elettrico Pizo e, sotto l'illuminazione a campo chiaro, individua un embrione. Avviare ora il pacchetto software che controlla l'ottica acustica sintonizzabile.
Filtra la telecamera e il palco. Questo software è stato scritto internamente, ma è possibile utilizzare anche il freeware di Micromanager. Innanzitutto, seleziona la linea laser.
Quindi, regolare il tavolino lungo l'asse x fino a quando il foglio di luce non è al massimo della luminosità. Quindi regolare le altre due dimensioni, Y e Z fino a quando il segnale al rumore è al suo meglio. Potrebbe essere necessario ripetere questa operazione per ogni embrione.
Questa chiave per ottimizzare il rapporto segnale/rapporto per ottenere una buona registrazione che traduce il di uno stadio libero, il supporto dell'obiettivo e l'eliminazione quando ho solo relazione per ottenere una simulazione ous dell'embrione e il miglior contrasto. Ora acquisisci immagini time lapse imposta l'esposizione alla potenza del laser, il guadagno di tempo e l'intervallo di imaging in base al livello di fluorescenza dell'embrione e alla velocità del processo biologico analizzato. Per Zack.
L'imaging ha impostato la distanza tra le fette e le loro posizioni iniziale e finale in c elgan esprimendo un costrutto istonico GFP. L'imaging time-lapse di due ore è stato realizzato con 20 pile di fette scattate ogni 37 secondi. Le divisioni cellulari erano chiaramente visibili in un ceppo che esprimeva la tubulina fusa con GFP e il suo calcolo fuso con la ciliegia Le registrazioni sono state effettuate per 16 minuti ogni 105 secondi.
I rendering 3D vengono visualizzati in tre punti temporali. I fusi mitotici e i cromosomi condensati sono chiaramente visibili e facilmente rintracciabili attraverso le divisioni cellulari. In un terzo ceppo, la lipoproteina APO, vit due, fusa a GFP, è stata sottoposta a imaging con marcatura mCherry della membrana cellulare.
Nell'arco di 13 minuti, sono state scattate 10 pile di fette ogni 27 secondi. Le particelle di lipoproteine in rapido movimento erano facili da seguire. Qui utilizziamo il foglio leggero formato con metodi più complessi per produrre.
Il foglio luminoso potrebbe essere implementato per migliorare ulteriormente la risoluzione spaziale.
Panoramica
Questo protocollo descrive l'allestimento di un microscopio a foglio luminoso e la sua applicazione per l'immagine in vivo di embrioni di C. elegans. Il metodo consente un'acquisizione più rapida con una fototossicità inferiore rispetto alla microscopia confocale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biophysica
- Microscopia
Sfondo
- La microscopia a foglio luminoso offre un approccio unico all'immagine di campioni biologici.
- Questa tecnica è particolarmente utile per l'osservazione di embrioni vivi.
- Minimizza il danno fototossico consentendo al contempo un'acquisizione rapida delle immagini.
- Le applicazioni si estendono a vari organismi modello oltre il C. elegans.
Scopo dello studio
- Visualizzare lo sviluppo degli embrioni di C. elegans mediante microscopia a foglio luminoso a fluorescenza.
- Analizzare la dinamica delle proteine marcate con fluorescenza durante lo sviluppo.
- Dimostrare i vantaggi della microscopia a foglio luminoso rispetto ai metodi tradizionali.
Metodi Utilizzati
- Configurazione di un microscopio a foglio luminoso con elementi optomeccanici.
- Montaggio di embrioni su vetrini preparati con cuscinetti di agar.
- Ottimizzazione dell'allineamento del foglio luminoso per l'acquisizione di immagini.
- Acquisizione di immagini in lapse temporale di embrioni per catturare i processi di sviluppo.
Risultati principali
- Imaging riuscita delle divisioni cellulari e della dinamica delle proteine negli embrioni di C. elegans.
- Sono state ottenute ricostruzioni 3D dei fusi mitotici e dei cromosomi.
- Dimostrata la capacità di tracciare proteine in rapido movimento.
- Fornite informazioni sui processi di sviluppo dell'organismo.
Conclusioni
- La microscopia a foglio luminoso è uno strumento potente per l'immagine in vivo.
- Questo metodo migliora la comprensione dello sviluppo embrionale.
- Può essere adattato per l'uso con altri organismi modello.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La microscopia a foglio luminoso consente l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione e a bassa fototossicità dello sviluppo di organismi interi, supportando la validazione degli obiettivi nella fase iniziale della scoperta fornendo dati fenotipici quantitativi e dinamici. Questo approccio riduce l'incertezza biologica nei modelli preclinici permettendo il monitoraggio longitudinale di processi cellulari e della dinamica proteica in sistemi viventi. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nell'identificazione dei composti promettenti fornendo risultati di imaging riproducibili e scalabili, compatibili con flussi di lavoro di screening ad alto contenuto informativo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione, con risoluzione subcellulare, della dinamica delle proteine e delle divisioni cellulari negli embrioni in via di sviluppo.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico fornendo letture quantitative e riproducibili dei fenotipi dello sviluppo in condizioni di bassa fototossicità.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio progettuale generando set di dati longitudinali e multiparametrici che correlano perturbazioni molecolari con esiti dello sviluppo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce immagini in 3D con risoluzione subcellulare e acquisizione temporale standardizzata, consentendo una valutazione affidabile degli effetti dei composti in contesti di organismo intero.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità del saggio attraverso un allineamento e una stabilizzazione precisi del foglio luminoso, riducendo al minimo la variabilità nelle sessioni di imaging longitudinale.
- Scalabilità: Compatibile con camere di osservazione multipozzetto e controllo automatizzato del palchetto, supporta campagne di screening a medio rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica consentendo una valutazione fenotipica coerente tra diversi sistemi modello mediante protocolli di imaging standardizzati.
- De-risking meccanicistico: Permette l'osservazione diretta degli effetti dell'interazione con il target sui processi di sviluppo, riducendo l'ambiguità negli studi sul meccanismo d'azione.
- Avanzamento basato sul rischio: Fornisce soglie quantitative per decisioni di avanzamento o interruzione basate su metriche di tossicità dello sviluppo e normalizzazione fenotipica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino all'ottimizzazione del composto attivo, offrendo una modalità di imaging non distruttiva e quantitativa per lo screening fenotipico e studi meccanicistici in modelli di organismo intero.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante il monitoraggio in tempo reale di proteine etichettate con fluorescenza e di strutture cellulari durante l'embriogenesi.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio grazie a protocolli standardizzati di preparazione dei vetrini, caratterizzazione della luce a lamina e montaggio degli embrioni, che assicurano coerenza nell'acquisizione delle immagini.
- Analisi: Produce letture quantitative in 3D e con time-lapse (ad esempio, dinamica del fuso mitotico, traffico delle proteine) che permettono confronti oggettivi tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica fornendo letture fenotipiche rilevanti per le malattie nel modello C. elegans, un organismo validato per percorsi dello sviluppo conservati.
- Riutilizzo aziendale: Progettato come sistema modulare assemblato a sinistra su un tavolo ottico, consente un uso ripetuto in diversi progetti con minima ricalibrazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica attraverso l'osservazione diretta e longitudinale della dinamica proteica e del comportamento cellulare.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità grazie a procedure standardizzate di allineamento optomeccanico, preparazione dei vetrini e montaggio degli embrioni.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo un rilevamento precoce della tossicità dello sviluppo, riducendo l'abbandono in fasi avanzate dovuto a rischi biologici non identificati.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta rispetto al rischio fornendo punteggi fenotipici quantitativi basati sull'imaging, che informano le decisioni di avanzamento tra diverse classi di bersagli.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'allineamento ottico, nella microscopia a fluorescenza e nella preparazione dei campioni per l'acquisizione in tempo reale.
- Necessita di un tavolo ottico stabile, sorgenti laser, obiettivi, piattaforme traslazionali e una camera EM-CCD o sCMOS per la rilevazione.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la preparazione dei vetrini, lo stadio degli embrioni e i parametri di acquisizione, al fine di garantire la riproducibilità tra diversi utenti e sedi.
- Le considerazioni per l'adattamento includono le dimensioni dell'embrione, la trasparenza ottica e la compatibilità del mezzo di montaggio quando si estende ad altri sistemi modello (ad esempio, zebrafish, Drosophila).
- I limiti pratici includono l'efficienza dell'immobilizzazione degli embrioni e l'uniformità del foglio luminoso su ampi campi visivi, aspetti che potrebbero richiedere un'ottimizzazione per sessioni di acquisizione più lunghe.
