Impostazione di un semplice foglio microscopio ottico per In Toto Imaging di C. elegans Sviluppo
May 5th, 2014
Questo protocollo descrive la configurazione di un microscopio foglio leggero e la sua applicazione per l'imaging in vivo di C. elegans embrioni.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare lo sviluppo di C Allergan utilizzando la microscopia a foglio di luce a fluorescenza. Ciò si ottiene impostando prima il microscopio basato su foglio di luce composto da un microscopio verticale e un piccolo set di elementi optomeccanici per generare un foglio di luce. Il secondo passo della procedura consiste nel montare l'embrione.
Gli ultimi passaggi consistono nell'adattare il foglio luminoso sull'embrione e registrarne lo sviluppo. I risultati possono mostrare la dinamica delle proteine marcate in fluorescenza durante lo sviluppo di CL egan attraverso l'analisi di video 3D e time lapse. I principali vantaggi della microscopia lightship rispetto ad altri metodi esistenti, come la microscopia confocale, è che consente un imaging più rapido con una minore fototossicità.
In terzo luogo, questo metodo può fornire informazioni sulla tenuta rispetto allo sviluppo. Può essere applicato anche ad altri sistemi come il roil o il pesce zebra. La dimostrazione della procedura sarà chiara.
Shales, un ingegnere del mio laboratorio e Pauline Linac, un ingegnere del laboratorio di furgoni. Questa sezione descrive l'assembly di configurazione e può essere lasciato assemblato per tutti gli esperimenti. Una volta che i laser, i filtri, il telescopio e il periscopio sono stati posizionati sul tavolo ottico, fissare la lente cilindrica per generare il foglio di luce.
Un obiettivo diverso viene regolato per la messa a fuoco. Il punto focale dell'obiettivo di illuminazione deve coincidere con il punto focale dell'oggetto dell'obiettivo di rilevamento. A questo punto, proiettare il raggio sulla parete o sullo schermo e spostare l'obiettivo di illuminazione lungo l'asse del fascio fino a quando i contorni della proiezione non sono nitidi.
Includere un filtro di emissione a quattro linee e una fotocamera E-M-C-C-D nella configurazione del microscopio. Fissare la seconda fase di traslazione manuale alla prima in modo perpendicolare. Avvitare il gruppo al tavolino del microscopio esistente.
Dopo aver rimosso l'obiettivo di illuminazione della lente cilindrica impostato, posizionare il gruppo sul microscopio e riposizionare il set di illuminazione sui tavolini. Fissare il supporto qve all'intersezione perpendicolare del percorso di illuminazione e del percorso di rilevamento. Ora, controlla il foglio luminoso.
Riempi un bicchiere vete con una soluzione di fluoresceina e posizionalo nel supporto sui palchi. Il foglio luminoso dovrebbe essere visibile. Deve essere orizzontale e centrato rispetto alla lente dell'obiettivo di rilevamento.
Quindi, rimuovere la lente cilindrica. Ottimizza il foglio di luce con la traslazione 3D dell'obiettivo di illuminazione e acquisisci un'immagine per misurare lo spessore del foglio di luce. Questo dipende dall'apertura dell'obiettivo.
Quindi assicurati di sostituire la lente cilindrica. Per prima cosa, tagliate un pezzo di vetro spesso un millimetro, 10 millimetri per 20 millimetri. Usa un pennarello a diamante.
Successivamente, aggiungere 20 microlitri di poli-L lisina su un lato e, una volta asciutto, giustapporlo a un secondo vetrino. In posizione fissa, aggiungere una goccia di agar agar al 5% e lisciarla con il peso di un terzo vetrino posto sulla parte superiore. Dopo che l'agar si è asciugato, rimuovere il terzo vetrino e tagliare il tampone di agar a tre millimetri dal bordo dei due vetrini rimanenti sopra il vetrino senza poli L lisina.
Quindi rimuovere il carrello fisso, lasciando una sporgenza di agar. Rivestire l'agar con 20 microlitri di poli-L lisina e lasciarlo asciugare. Ora metti i vermi GR in un vetro d'orologio riempito con terreno M nove sotto un microscopio da dissezione.
Tagliare i vermi con un bisturi all'altezza della vulva, rilasciando così le uova. Quindi identifica gli embrioni che si trovano nello stadio di interesse e raccoglili con una pipetta micro capillare. Trasferire gli embrioni sulla sporgenza dell'agar del vetrino preparato proprio accanto al bordo del vetrino, non sul bordo dell'agar.
Quindi allineare gli embrioni con una micropipetta capillare rimuovendo il liquido. Per aspirazione, gli embrioni si attaccheranno alla poliolisina. È molto importante posizionare bene gli embrioni per ottenere una buona registrazione, e questo richiede un capillare con la giusta aptura.
Se troppo piccolo, sarà difficile rilasciare gli embrioni. Se troppo grande, sarà difficile controllare strettamente il flusso fuoriuscito e allineare gli embrioni, coprire il vetrino con un terreno M nine in una capsula di Petri e confermare che gli embrioni siano ancora attaccati all'agar utilizzando l'ingrandimento. Ora, fissare il vetrino preparato con gli embrioni al supporto del campione che si inserisce in un vete.
Il supporto è un aggeggio fatto internamente che è progettato per adattarsi a un vete. Quindi, fissa il veterinario a un tavolino elettrico Pizo e, sotto l'illuminazione a campo chiaro, individua un embrione. Avviare ora il pacchetto software che controlla l'ottica acustica sintonizzabile.
Filtra la telecamera e il palco. Questo software è stato scritto internamente, ma è possibile utilizzare anche il freeware di Micromanager. Innanzitutto, seleziona la linea laser.
Quindi, regolare il tavolino lungo l'asse x fino a quando il foglio di luce non è al massimo della luminosità. Quindi regolare le altre due dimensioni, Y e Z fino a quando il segnale al rumore è al suo meglio. Potrebbe essere necessario ripetere questa operazione per ogni embrione.
Questa chiave per ottimizzare il rapporto segnale/rapporto per ottenere una buona registrazione che traduce il di uno stadio libero, il supporto dell'obiettivo e l'eliminazione quando ho solo relazione per ottenere una simulazione ous dell'embrione e il miglior contrasto. Ora acquisisci immagini time lapse imposta l'esposizione alla potenza del laser, il guadagno di tempo e l'intervallo di imaging in base al livello di fluorescenza dell'embrione e alla velocità del processo biologico analizzato. Per Zack.
L'imaging ha impostato la distanza tra le fette e le loro posizioni iniziale e finale in c elgan esprimendo un costrutto istonico GFP. L'imaging time-lapse di due ore è stato realizzato con 20 pile di fette scattate ogni 37 secondi. Le divisioni cellulari erano chiaramente visibili in un ceppo che esprimeva la tubulina fusa con GFP e il suo calcolo fuso con la ciliegia Le registrazioni sono state effettuate per 16 minuti ogni 105 secondi.
I rendering 3D vengono visualizzati in tre punti temporali. I fusi mitotici e i cromosomi condensati sono chiaramente visibili e facilmente rintracciabili attraverso le divisioni cellulari. In un terzo ceppo, la lipoproteina APO, vit due, fusa a GFP, è stata sottoposta a imaging con marcatura mCherry della membrana cellulare.
Nell'arco di 13 minuti, sono state scattate 10 pile di fette ogni 27 secondi. Le particelle di lipoproteine in rapido movimento erano facili da seguire. Qui utilizziamo il foglio leggero formato con metodi più complessi per produrre.
Il foglio luminoso potrebbe essere implementato per migliorare ulteriormente la risoluzione spaziale.
Panoramica
Questo protocollo descrive la configurazione di un microscopio a foglio di luce e la sua implementazione per l'imaging in vivo di embrioni di C. elegans. Il metodo permette un'imaging più rapido con una fototossicità inferiore rispetto alla microscopia confocale.
Componenti principali dello studio
Area di Scienza
- Neuroscienza
- Biofisica
- Microscopia
Contesto
- La microscopia a foglio di luce fornisce un approccio unico per l'imaging di campioni biologici.
- Questa tecnica è particolarmente utile per l'osservazione di embrioni vivi.
- Minimizza il fotodanno consentendo al contempo un'imaging rapido.
- Le applicazioni si estendono a vari organismi modello oltre C. elegans.
Obiettivo dello studio
- Visualizzare lo sviluppo degli embrioni di C. elegans utilizzando la microscopia a foglio di luce fluorescente.
- Analizzare le dinamiche delle proteine marcate fluorescentemente durante lo sviluppo.
- Dimostrare i vantaggi della microscopia a foglio di luce rispetto ai metodi tradizionali.
Metodi utilizzati
- Configurazione di un microscopio a foglio di luce con elementi optomeccanici.
- Montaggio degli embrioni su vetrini preparati con cuscinetti di agar.
- Ottimizzazione dell'allineamento del foglio di luce per l'imaging.
- Imaging time-lapse degli embrioni per catturare i processi di sviluppo.
Risultati principali
- Imaging riuscito di divisioni cellulari e dinamiche proteiche negli embrioni di C. elegans.
- Ottenuti rendering 3D di fusi mitotici e cromosomi.
- Dimostrato la capacità di tracciare proteine in rapido movimento.
- Fornito intuizioni sui processi di sviluppo dell'organismo.
Conclusioni
- La microscopia a foglio di luce è uno strumento potente per l'imaging in vivo.
- Questo metodo migliora la comprensione dello sviluppo embrionale.
- Può essere adattato per l'uso con altri organismi modello.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Light sheet microscopy enables high-resolution, low-phototoxicity imaging of whole-organism development, supporting target validation in early discovery by providing quantitative, dynamic phenotypic data. This approach reduces biological uncertainty in preclinical models by allowing longitudinal tracking of cellular processes and protein dynamics in live systems. The method enhances predictive confidence in lead identification by delivering reproducible, scalable imaging outputs compatible with high-content screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through subcellular-resolution visualization of protein dynamics and cell divisions in developing embryos.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing reproducible, quantitative readouts of developmental phenotypes under low-phototoxic conditions.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating longitudinal, multi-parameter datasets that correlate molecular perturbations with developmental outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, 3D time-lapse imaging with subcellular resolution, enabling reliable compound effect assessment in whole-organism contexts.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through precise light sheet alignment and stabilization, minimizing variability in longitudinal imaging sessions.
- Scalability: Compatible with multi-well observation chambers and automated stage control, supporting medium-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling consistent phenotypic assessment across model systems using standardized imaging protocols.
- Mechanistic De-risking: Allows direct observation of target engagement effects on developmental processes, reducing ambiguity in mechanism-of-action studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative thresholds for go/no-go decisions based on developmental toxicity and phenotypic normalization metrics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead optimization, offering a non-destructive, quantitative imaging modality for phenotypic screening and mechanistic studies in whole-organism models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time tracking of fluorescently labeled proteins and cellular structures during embryogenesis.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation, light sheet characterization, and embryo mounting protocols that ensure imaging consistency.
- Analytics: Generates quantitative 3D and time-lapse readouts (e.g., mitotic spindle dynamics, protein trafficking) that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing disease-relevant phenotypic readouts in C. elegans, a validated model for conserved developmental pathways.
- Enterprise Reuse: Designed as a modular, left-assembled system on an optical table, enabling repeated use across projects with minimal recalibration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, longitudinal observation of protein dynamics and cellular behavior.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized opto-mechanical alignment, slide preparation, and embryo mounting procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of developmental toxicity, reducing late-stage attrition due to unidentified biological risks.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative, imaging-based phenotypic scores that inform advancement decisions across target classes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, fluorescence microscopy, and sample preparation for live imaging.
- Needs stable optical table, laser sources, objectives, translation stages, and EM-CCD or sCMOS camera for detection.
- Demands cross-team standardization of slide preparation, embryo staging, and imaging parameters to ensure reproducibility across users and sites.
- Adaptation considerations include embryo size, optical clearing, and mounting medium compatibility when extending to other model systems (e.g., zebrafish, Drosophila).
- Practical limitations include embryo immobilization efficiency and light sheet uniformity over large fields of view, which may require optimization for longer imaging sessions.
