Name: Un test per Lateral Rigenerazione Line in Zebrafish adulti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-08T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Scopri un test quantitativo per la rigenerazione della linea laterale in zebrafish adulti usando Gentamicina e microscopia confocale. Questo metodo consente di analizzare la ricrescita dei neuromasti e delle cellule ciliari.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Tutte le procedure vengono eseguite seguendo le linee guida descritte in &quot;Principi di cura degli animali da laboratorio&quot; (National Institutes of pubblicazione della Sanità n. 85-23, riveduta 1985) e il protocollo di animali Rosalind Franklin dell&#39;Università Institutional Animal Care ed uso commissione ha approvato 08-19. 1. Gentamicina-induzione di capelli necrosi cellulare <ol><li> Preparare gentamicina solfato in soluzione fisiologica ad una concentrazione finale di 0,004% (4,32 mM). </li><li> Mettere pesci adulti (D. rerio, 4-6 mesi di età) in un recipiente contenente il 0,004% (4.32 mM) soluzione gentamicina. Ogni contenitore può essere utilizzato, ma si usa un contenitore pesce da un sistema acquatico Pharmacal che è in larga 7, 6 in alto, e 7 a lungo. Mettere il recipiente con il pesce in un incubatore a 28 ° C per 24 ore. Impostare il volume totale del fluido nel serbatoio ad un livello sufficiente a mantenere il pesce in uno Stato idoneo per il periodo di 24 ore. Nota: L&#39;aerazione del fluido gentamicina non è necessario se viene utilizzato un volume sufficiente per il numero di pesci in trattamento. </li></ol> 2. Colorazione vitale delle cellule ciliate <ol><li> Preparare una concentrazione 0,08% (in soluzione fisiologica) del colorante vitale fluorescente [4-4-diethylaminostyryl)-N-metilpiridinio ioduro (485 nm di eccitazione e 603 nm λ λ emissione in metanolo) a partire da una soluzione madre di lavoro di 15 mg / ml in etanolo. </li><li> Per determinare se il trattamento è stato efficace gentamicina un sottoinsieme di controllo e gentamicina pesci trattati sono macchiati immediatamente posizionando pesce nel pozzetto di una piastra di coltura 6 pozzetti contenenti il ​​colorante vitale. Utilizzare un numero sufficiente di pesci (e piastre di coltura come richiesto per la significatività statistica da raggiungere. Basato sulla velocità dell&#39;esaminatore del conteggio neuromast, mettere il pesce nei piatti in modo sfalsato nel tempo in modo che i pesci non sono macchiati per oltre 75 min come descritto al punto 2.3. </li><li> Posizionare le piastre dal punto 2.2 in un cassetto panchina dal microscopio a fluorescenza peressere utilizzato per l&#39;esame di neuromasti macchiati. Spegnere le luci della stanza per evitare tempra del colorante vitale nel periodo colorazione 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Preparare sia dye wash-out e serbatoi d&#39;acqua anestetici. Dye acqua wash-out è l&#39;acqua del pesce normale e per l&#39;acqua anestetico, aggiungere sufficienti 2-fenossietanolo in modo che una diluizione 1:1000 in acqua il pesce normale è raggiunto. </li><li> Disporre il pesce in acqua i pesci normali eccesso di sciacquare eccesso di colorante vitale e passare al punto 3.1 per osservazione di colorante vitale macchiato di pesce. </li><li> Per esaminare la rigenerazione di neuromasti, trasferire pesce gentamicina trattati che sono stati lavati in acqua pesce normale tra un incubatore per 8-16 ore a 28 ° C. </li><li> In tempi diversi tra 8-16 h, pesce vengono rimossi dal termostato, lavate e colorate come indicato nei passaggi 2.1-2.4. Passare al punto 3.1 per osservazione di colorante vitale macchiato di pesce. </li></ol> 3. Anestetizzante Fish and Counting fluorescente di neuromasti <ol><li&gt; Asciugare ogni pesce su un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso e poi metterlo su un foglio di carta inumidito filtro che è centrata sul coperchio di una piastra di Petri di plastica. </li><li> Mettere il coperchio sul palco di uno stereo microscopio a fluorescenza per ottenere un&#39;immagine digitale del colorante vitale neuromasti macchiati dei punti del corpo metà. </li><li> Utilizzare una fotocamera digitale posto sulla stereo microscopio a fluorescenza impostato un ingrandimento di 2X per acquisire immagini per la successiva analisi quantitativa. Nota: L&#39;impostazione di ingrandimento del microscopio stereo può dipendere dalla marca di microscopio utilizzato, ma l&#39;impostazione dovrebbe consentire una facile visualizzazione e il conteggio dei singoli neuromasti all&#39;interno della metà dei punti del corpo. </li><li> Determinare la quantità di rigenerazione contando il numero di neuromasti visibili nei quattro punti designati sul lato più in basso ventrale del pesce appena prossimale verso destra pinna pettorale (vedi Figura 1). Per l&#39;analisi statistica utilizzare un test adeguato, come ANOVA or T-test di Student. Gli esperimenti dovrebbero utilizzare un minimo di 5 pesci al punto di tempo e di tutti gli esperimenti devono essere ripetute un minimo di 3x. </li><li> Sulla base della curva rigenerazione neuromast (vedere Figura 3), contare neuromasti tra 8-16 hr alberino gentamicina wash-out di essere all&#39;interno della fase lineare della curva di rigenerazione. Nota: L&#39;uso della fase di tempo lineare permette per una corretta analisi quantitativa tra il controllo e gruppi sperimentali. </li></ol> 4. Conteggio fluorescente delle cellule ciliate individuale per ottenere una maggiore risoluzione delle analisi quantitativa se l&#39;analisi Neuromast non è statisticamente significativo <ol><li> Se l&#39;analisi quantitativa a livello di neuromasti non è significativo, analisi a livello della cellula capelli individuo può essere utilizzato anche per ottenere un grado di risoluzione più elevata. Selezionare il pesce in un punto particolare tempo di post gentamicina wash-out (punto nel tempo in base agli studi neuromast precedenti), colorante vitale stain il pesce come descritto nel protocollo 2, e quindi eutanasia il pesce con 2-fenossietanolo a una diluizione 1:500 per 1-5 min. </li><li> Nella luce soffusa per evitare tempra, fare quattro incisioni in modo che un preparato lembo cutaneo quadrata è composto come segue. Effettuare un&#39;incisione lungo le costole superiori del pesce fino a quando non è allineato con le pinne anali, quindi fare un&#39;incisione attraverso la pancia, e, infine, fare due incisioni verticali su ciascun lato di queste incisioni così si crea il lembo cutaneo piazza. Nota: Questa preparazione pelle integrare i punti del corpo metà utilizzati negli esperimenti neuromast. </li><li> Porre il campione di pelle su un vetrino e poi posto un coperchio circolare vetro scivolare sul campione di pelle asportati per aiutare ancoraggio e appiattire il tessuto per il successivo immagini digitali. </li><li> Utilizzando i campioni di pelle dal punto 4.3, di ottenere immagini digitali delle cellule ciliate all&#39;interno di ogni neuromast dei punti del corpo metà. Prendete le immagini ad un ingrandimento di almeno 60X e poi contare il ce capellills all&#39;interno dei singoli neuromasti di analisi quantitativa comparativa del controllo e gruppi sperimentali (vedi Figura 4). </li></ol>

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Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di ricerca della Iacocca Family Foundation, del National Institutes of Health Grant DK092721 (to R.V.I.) e dei fondi di avviamento della Rosalind Franklin University. Non sono stati segnalati potenziali conflitti di interesse rilevanti per questo articolo. G.C.P., S.M.M. e N.D. hanno ricercato i dati. M.P.S. Jr. e RI hanno supervisionato il progetto, hanno contribuito alla discussione dei dati e hanno supervisionato la scrittura e l'editing del manoscritto.

Basato sulla vasta letteratura che è stato stabilito per l&#39;analisi della linea laterale (LL) rigenerazione embrionale e larvale zebrafish 8,24,25, l&#39;obiettivo del nostro studio è stato quello di sviluppare un test quantitativo per la linea rigenerazione laterale in zebrafish che potrebbe essere applicato a modelli di malattia che sono meglio studiati nei pesci adulti. Abbiamo scoperto che alcuni punti critici sono importanti quando si applicano le procedure sviluppate per embrionale pesce / larvale ai...

Il sistema (LL) linea laterale è un organo mechanosensory trovato in entrambi i pesci e anfibi che è responsabile per l&#39;udito, l&#39;equilibrio, rheotaxis e comportamenti di mediazione, come la scuola e il predatore evasione 1-5. Si compone di gruppi di cellule capelli circondate da cellule di supporto, entrambi i quali sono disposti in strutture chiamate neuromasti 6. Questi neuromasti sono tipicamente organizzati in linee verticali (chiamato punti) lungo l&#39;asse longitudinale del corpo e la coda con alcuni punti orizzontali osservati nella testa del pesce. Nell&#39;adulto, neuromasti sono significativamente più numerosi nei punti rispetto ai pesci embrionale o larvale 6. Studi biomedici in zebrafish si sono concentrati sugli effetti del trattamento antibiotico, trauma indotta dal rumore, infezione cronica, ecc. su cellule ciliate 7,8 nel tentativo di capire meglio i loro effetti sugli esseri umani. Diversamente dalla maggior parte dei vertebrati, TEleosts, come il pesce zebra (Danio rerio), hanno la capacità di rigenerare le cellule dei capelli perduti. Zebrafish sono particolarmente utili perché del loro tempo rapido sviluppo e ad alta capacità rigenerativa. Ad oggi, tuttavia, studi sullo sviluppo di zebrafish linea laterale e / o rigenerazione sono principalmente utilizzati il pesce stadio embrionale e larvale causa del numero ridotto di neuromasti linea laterale che agevola conteggio e analisi 6,9,10. Tuttavia, come molti modelli di zebrafish di malattie neurologiche e non neurologiche 11-16 sono studiate nei pesci adulti e non le larve, ci siamo concentrati sullo sviluppo di un test rigenerativa linea laterale in zebrafish adulto con gentamicina (un aminoglicoside precedentemente utilizzato in larve di zebrafish e più recentemente utilizzato con pesci adulti 17) in modo che un saggio era disponibile che potrebbe essere applicato a modelli di malattia di zebrafish adulto attuali. Mentre in precedenza pubblicati procedure di Van Trump et al. 17 ha stabilito le condizioni per l&#39;ablazione delle cellule dei capelli nel pesce adulto, che non hanno stabilito una curva standard per la rigenerazione neuromast che è necessario per il confronto quantitativo tra controllo e gruppi sperimentali come quando si utilizzano linee di zebrafish transgenici o stati di malattia farmacologicamente indotti in zebrafish 18. Abbiamo quindi seguito le procedure di Van Trump et al. 17 per l&#39;ablazione delle cellule dei capelli, ma costruito sul loro lavoro per stabilire una curva standard di rigenerazione neuromast per consentire ai ricercatori di utilizzare i nostri dati quando si confrontano controllo e gruppi sperimentali come ad esempio con modelli di malattia di zebrafish adulto . Il dosaggio è stato inoltre progettato per consentire estensione dell&#39;analisi alla cella capelli individuo quando è richiesto un livello di risoluzione.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di gentamicina solfato (50 mg/ml)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>2 Fenossietanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1126</td><td></td></tr><tr><td>4-4-Dietilamminostril-N-metilpiridinio ioduro (4-Di-2-Asp) in metanolo</td><td>Aldrich</td><td>D-3418</td><td>485 nm eccitazione &lambda; e 603 nm emissione &lambda;</td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti</td><td>Piastre di</td> Petri Mid Sci <td>TP92006</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per micropozzetti con fondo in vetro</td><td>Matek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>dissezione&nbsp; Microscopio</td><td>Nikon</td><td>TMZ-1500</td><td>Qualsiasi microscopio da dissezione va bene.</td></tr><tr><td>Fotocamera per l'imaging</td><td>Nikon</td><td>Q imaging</td><td>Qualsiasi fotocamera è adatta.</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>NIH Image</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>Qualsiasi software di imaging è adatto.</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Olympus</td><td>FV10i</td><td>Qualsiasi microscopio fluorescente ad alta risoluzione è adatto</td></tr><tr><td>Sistema acquatico</td><td>KG Aquatics ZFS Rack System</td><td></td><td>Qualsiasi sistema acquatico può essere utilizzato</td></tr></tbody></table>

un test per lateral rigenerazione line in zebrafish adulti

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Data l&#39;importanza clinica dell&#39;udito e disturbi dell&#39;equilibrio nell&#39;uomo, organismi modello come zebrafish sono stati utilizzati per studiare lo sviluppo linea laterale e rigenerazione. Il zebrafish è particolarmente attraente per tali studi a causa del suo tempo di sviluppo rapido e la sua elevata capacità rigenerativa. Ad oggi, gli studi di zebrafish della linea di rigenerazione laterali sono principalmente utilizzati pesci delle fasi embrionali e larvali a causa del numero inferiore di neuromasti in queste fasi. Ciò ha reso analisi quantitativa della linea rigenerazione e / o sviluppo più semplice negli stadi precoci di sviluppo laterale. Poiché molti modelli di zebrafish di malattie neurologiche e non neurologiche sono studiate nei pesci adulti e non nell&#39;embrione / larve, ci siamo concentrati sullo sviluppo di un laterale dosaggio linea rigenerativa quantitativa in zebrafish adulto in modo che un test era disponibile che potrebbe essere applicato a corrente modelli di malattia di zebrafish adulto. Basandosi su studi precedenti di Van Trump et al. 17 che descrive le procedure per l&#39;ablazione delle cellule ciliate adulto messicano pesci ciechi grotta e zebrafish (Danio rerio), il nostro test è stato progettato per permettere il confronto quantitativo fra controllo e gruppi sperimentali. Ciò è stato realizzato attraverso lo sviluppo di una curva standard neuromast rigenerativa basata sulla percentuale di ricomparsa neuromast su un periodo di tempo di 24 ore seguente gentamicina indotta necrosi delle cellule ciliate in una regione definita della linea laterale. Il dosaggio è stato inoltre progettato per consentire estensione dell&#39;analisi a livello di cella capelli individuo quando è richiesto un livello di risoluzione.

Ottimizzazione delle procedure per quantificare la rigenerazione neuromast della linea laterale in zebrafish adulto. Le neuromasti di zebrafish larvale sono facilmente quantificabili; Tuttavia, la linea laterale del zebrafish adulto ha un numero molto maggiore di neuromasti per punto effettuare analisi quantitative più difficile 6,17,19,20. Come si vede nella Figura 1A, la testa ha un numero significativamente maggiore di neuromasti rispetto sia a...

Poiché molti modelli di zebrafish di malattie neurologiche e non neurologiche sono studiate nei pesci adulti piuttosto che l&#39;embrione / larve, abbiamo sviluppato una linea laterale rigenerativo dosaggio quantitativo che può essere applicato a modelli di malattia di zebrafish adulto. Il saggio coinvolto risoluzione al neuromast 1) e 2) livelli di cellule singolo capello.

Un test per Lateral Rigenerazione Line in Zebrafish adulti

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare un saggio quantitativo di rigenerazione della linea laterale applicabile a un modello di malattia nel pesce zebra adulto. Questo risultato si ottiene innanzitutto ablato la linea laterale dei pesci zebra adulti trattandoli per 24 ore con gentamicina. Successivamente, la gentamicina viene rimossa mediante lavaggio e i pesci vengono lasciati rigenerare i neuromasti per diversi periodi di tempo in acqua fresca.I pesci vengono quindi colorati con un colorante vitale per visualizzare il recupero della linea laterale in determinati momenti temporali. Per confermare che il farmaco è stato efficace nell'ablare i neuromasti, alcuni pesci devono essere colorati immediatamente dopo il lavaggio del Gentamicina. Successivamente, i neuromasti delle linee laterali sui pesci o su preparati di pelle vengono contati utilizzando immagini ottenute con un microscopio a fluorescenza o confocale.Infine, i gruppi sperimentali vengono confrontati quantitativamente con il gruppo di controllo utilizzando una curva standard di neuromast rigenerativo. In ultima analisi, la microscopia fluorescente e confocale viene utilizzata per monitorare la rigenerazione

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Dopo la sezione spinale, zebrafish adulto ha recupero funzionale da sei settimane post-infortunio. Per usufruire di trasparenza larvale e recupero più veloce, vi presentiamo un metodo per sezionare il midollo spinale larvale. Dopo la resezione, osserviamo il recupero sensoriale che inizia a 2 giorni dopo l'infortunio, e il movimento C-bend per tre giorni post-infortunio.

Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish

Per far luce sui meccanismi cellulari e molecolari della neurogenesi e della rigenerazione adulta del pesce zebra, abbiamo sviluppato un protocollo per la chirurgia invasiva che causa lesioni meccaniche nel telencefalo adulto del pesce zebra e il successivo monitoraggio dei cambiamenti nell'emisfero pugnalato mediante immunoistochimica o ibridazione in situ.

Stab Ferita Lesione del Zebrafish adulti Telencefalo: Un metodo per Indagare vertebrati cervello neurogenesi e rigenerazione

Presentiamo un protocollo per catturare la dinamica della rigenerazione della pinna caudale larvale del pesce zebra su una scala dell'intero tessuto utilizzando la stereomicroscopia basata sul campo chiaro. Questa tecnica consente di catturare le dinamiche di rigenerazione con la risoluzione di una singola cella. Questa metodologia può essere adattata a qualsiasi stereomicroscopio dotato di una telecamera CCD e di un software time-lapse.

Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

Qui descriviamo il flusso di lavoro per l'utilizzo del sistema TetON per ottenere l'espressione genica tessuto-specifica nella pinna caudale del pesce zebra adulto che si rigenera.

L&#39;utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

L'ablazione laser è una tecnologia ampiamente applicabile per lo studio della rigenerazione nei sistemi biologici. Il protocollo presentato descrive l'uso di un microscopio confocale a scansione laser standard per l'ablazione laser e la successiva imaging time-lapse di cellule interneuromast rigeneranti nella linea laterale zebrafish.

Saggio di ablazione e rigenerazione laser a base di microscopio confocale nelle cellule interneuromast zebrafish

La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata dalle cellule staminali muscolari residenti nei tessuti, che sono compromesse in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, e questo si traduce nell'incapacità del muscolo di rigenerarsi. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish di malattia muscolare.

Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare

Capace di recupero funzionale dopo lesioni del midollo spinale, il pesce zebra adulto è un sistema modello premier per chiarire i meccanismi innati di rigenerazione neurale. Qui, descriviamo la resistenza al nuoto e i saggi di comportamento del nuoto come letture funzionali della rigenerazione del midollo spinale.

Valutazione della resistenza al nuoto e del comportamento di nuoto nel pesce zebra adulto

Il presente protocollo descrive un metodo per indurre lesioni tessuto-specifiche e altamente riproducibili nelle larve di zebrafish utilizzando un sistema di lesione laser combinato con una piattaforma microfluidica automatizzata per la manipolazione delle larve.

Lesioni indotte da laser semi-automatizzate controllate per lo studio della rigenerazione del midollo spinale nelle larve di zebrafish

Questo protocollo descrive la raccolta e la visualizzazione delle squame elasmoidi del pesce zebra durante la rigenerazione in vivo . Inoltre, viene presentata la coltura ex vivo di queste scaglie fino a 7 giorni dopo la raccolta.

Rigenerazione delle squame di zebrafish in toto e cultura delle squame ex vivo

Qui vi mostriamo come fare retro-orbitale iniezione in zebrafish adulti.

Retro-orbitale iniezione in Zebrafish adulti

Scopri un test quantitativo per la rigenerazione della linea laterale in zebrafish adulti usando Gentamicina e microscopia confocale. Questo metodo consente di analizzare la ricrescita dei neuromasti e delle cellule ciliari.

Un test per Lateral Rigenerazione Line in Zebrafish adulti

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