Identificazione di geni novelli associati con alginato di produzione in

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare nuovi geni associati alla produzione dell'esopolisaccaride alginato in Pseudomonas aeruginosa mediante mutagenesi mediata da transposone mini-Himar1. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando due culture separate, incubate per tutta la notte, del ceppo donatore, E. coli Lambda pir portatore del plasmide PAC, e delle cellule riceventi, Pseudomonas aeruginosa PAO1. Successivamente, il plasmide PAC viene coniugato mediante co-coltura di E. coli Lambda pir con Pseudomonas aeruginosa.

I coniuganti PAO1 e trans sono selezionati su agar per l'isolamento di Pseudomonas, quindi le colonie mucoidi vengono identificate e isolate su piastre PIA. Infine, la posizione e l'orientamento del transposone mini-he-mar1 nel sito di inserzione vengono identificati all'interno del genoma di Pseudomonas aeruginosa PAO1. In definitiva, l'uso della mutagenesi mediata dal transposone mini-he-R1 identifica e caratterizza i geni associati alla produzione di alginato in Pseudomonas aeruginosa.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della microbiologia e della genetica batterica, come l'identificazione di loci genetici coinvolti nella regolazione di diverse funzioni cellulari, dimostrando che la procedura verrà eseguita con i versati. Uno studente laureato del mio laboratorio, Il mini he R uno vettore plasmidico Mariner transpose on P fac contiene ripetizioni invertite di 227 paia di basi con siti di inserzione TA che delimitano il cassette di resistenza alla gentamicina A CC uno con il suo promotore dipendente da Sigma 70 a monte di un sito di clonaggio multiplo. Il vettore PFAC contiene inoltre geni che codificano per la transposasi he R uno altamente attiva, la beta-lattamasi e l'operone di trasferimento TRA.

I siti di inserzione TA permettono un'integrazione efficiente nel genoma di ceppi di pseudomonas aerogen. L'accuratezza nell'identificazione e nella selezione di mutanti OID è fondamentale per il successo complessivo nella determinazione dei loci genici coinvolti nella regolazione dell'alginato. Per preparare i ceppi batterici, iniziare inoculando e coli SM 10 Lambda peer P fac in cinque millilitri di lb, integrati con 15 microgrammi per millilitro di Gentamycin, e collocare in un incubatore agitato durante la notte a 37 gradi Celsius nello stesso giorno.

Incolli la ceppa posa PO uno in cinque millilitri di LB e incubi in agitazione durante la notte a 42 gradi Celsius; il giorno seguente, misuri la DO a 600 nm delle colture notturne e mescoli quantità uguali di PAO uno ed E. coli P fac, in modo che il volume finale sia compreso tra un millilitro e 1,4 millilitri. Centrifughi la miscela a 6.000 × g per cinque minuti.

Nel frattempo, far asciugare le piastre LB per la coniugazione lasciandole aperte in un incubatore a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti. Rimuovere tutto il soprannatante tranne 50 microlitri dalla miscela cellulare. Quindi Resus.

Sospendere il pellet cellulare nei rimanenti 50 microlitri di supernatante e pipettare su una piastra LB asciutta. Posizionare con attenzione la piastra in un punto compatto sotto cappa per farla asciugare. Non permettere alle cellule di diffondersi sulla piastra.

Questo ridurrà notevolmente l'efficienza della coniugazione. Una volta che la goccia è asciutta, capovolgere la piastra di LB e incubare a 37 gradi Celsius per quattro-sei ore, mentre il campione cellulare è in incubazione. Preparare ampie piastre di agar per l'isolamento di pseudomonas o piastre PIA con 300 microgrammi per millilitro di gentamicina.

Dopo l'incubazione, utilizzare un'ansa di inoculazione sterile per raccogliere questa singola goccia di cellule in una provetta per microcentrifuga contenente un millilitro di lb; vortexare o pipettare per mescolare accuratamente prima di distribuire le cellule uniformemente sulle grandi piastre PIA. Incubare le piastre tutta la notte a 37 gradi Celsius. Rimuovere le piastre dall'incubatore ed esaminarle alla ricerca di colonie OID.

Isolare una singola colonia moid e fare una semina per isolamento su piastre piccole con PIA e 300 microgrammi per millilitro di Gentamicina. Il giorno successivo, isolare una singola colonia moid e ripetere la semina. Ripetere l'isolamento da singola colonia altre due volte per determinare la stabilità dell'isolato moid dopo l'isolamento iniziale.

Passo: inoculare 4,5 millilitri di LB con una singola colonia OID e incubare in agitazione durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, etichettare tre provette da microcentrifuga per ciascun mutante OID. Preparare due aliquote da 1,25 millilitri di coltura notturna per l'estrazione del DNA genomico e l'identificazione del sito di inserzione del trasposone.

Inoltre, archiviare ogni mutante OID pipettando un millilitro di coltura da incubata tutta la notte in una provetta criogenica opportunamente etichettata contenente un volume uguale di latte scremato al 10%. Conservare a meno 86 gradi Celsius. Dopo aver estratto il DNA genomico dal mutante MOID.

Utilizzando un metodo a scelta e determinandone la concentrazione, digerire un totale di due microgrammi con un microlitro dell'endonucleasi di restrizione S one in un volume totale di 50 microlitri, in incubazione tutta la notte a 37 gradi Celsius. Una volta che il DNA digerito è stato purificato, mediante un metodo a scelta, in un volume totale di 25 microlitri, preparare una reazione di ligazione utilizzando circa 11 microlitri di DNA e incubare il campione per almeno 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, inattivare il campione a 70 gradi Celsius per 15 minuti ed eseguire l'IPCR sul prodotto di ligazione utilizzando i seguenti primer diretto e inverso e le seguenti condizioni di termociclaggio.

Quindi verificare l'amplificazione su un gel AROS prima di utilizzare infine i primer GM three out e GM five out per il sequenziamento della reazione. Nella figura sono mostrati esempi di isolati MOID e non MOID. Sulla base del protocollo illustrato in questo video, ogni coniugazione dovrebbe produrre una banca di circa 20.000 mutanti su 15-20 piastre grandi a causa della sovraproduzione di alginato.

La colonia moid deve essere di colore chiaro o bianco e avere un aspetto cremoso o viscoso. Se la mutagenesi e l'amplificazione del DNA hanno avuto successo, dovrebbe essere presente un singolo amplicone della dimensione appropriata, come illustrato in questa figura. È assente l'amplicone IPCR in PAO uno.

Tuttavia, rileviamo un singolo amplicone di circa 1.400 paia di basi e di circa 1000 paia di basi rispettivamente in PA, O uno VE due e PA O uno VE 13. La dimensione di questi ampliconi corrisponde all'inserzione del trasposone mariner HE R uno nella regione del promotore di PA 4 0 3 3 in PA oh uno VE due e internamente in PA 5 4 84 in PA oh uno VE 13 PA oh uno di DNA genomico. Il DNA genomico sottoposto a restrizione, digestione e ligazione può essere utilizzato come controllo negativo.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro giorni, se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di incubare i ceppi batterici alla temperatura appropriata prima della coniugazione biparentale.