Glicopeptide Capture per Proteomica cellulari di superficie

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di arricchire le proteine della membrana cellulare di superficie a bassa abbondanza. Ciò si ottiene denaturando e digerendo prima le proteine di membrana. Il secondo passo consiste nell'ossidare i glicani e catturare i peptidi glicosilati su una superficie di resina.

I non glicopeptidi vengono quindi lavati via dalla resina. La fase finale è il rilascio dei glicopeptidi N-Linked dalla resina per l'analisi lc MS. In definitiva, la sequenza peptidica identificata può essere rimappata sulle proteine per scopi di identificazione e quantificazione.

Oggi vi mostrerò come funziona il ral di cattura dei peptidi Geico. Il vantaggio principale di questa tecnica di sovradosaggio, ad esempio esistenti, come la cattura della glicoproteina, è che la proteina di membrana verrà prima digerita e la cattura del glicopeptide può essere eseguita in un unico vaso. L'applicazione di questa tecnica può estendersi alla scoperta del biomarcatore della malattia.

Poiché la proteina dell'alligatore può essere eliminata nel sangue e in altri fluidi corporei e la glicoproteina circolante nel sangue, che sono specifiche per il processo patologico, possono essere utilizzate come biomarcatori di prognosi e diagnosi. Per prima cosa, preparare quattro millilitri di tampone ipotonico con un cocktail di inibitori della proteasi da uno a 100. Aggiungere un millilitro di tampone ipotonico su un pellet cellulare contenente circa 10-8 cellule e incubare la miscela per 15-30 minuti Su ghiaccio, trasferire le cellule in una fiala da due millilitri e pidacciare le cellule passando il campione da cinque a 10 volte attraverso un ago da siringa.

Quindi utilizzare un emocitometro e la colorazione trian blue. Per verificare l'efficienza della lisi, combinare un millilitro di lisato con tre millilitri di tampone ipotonico rimasto. Centrifugare il tubo a 3000 volte G a quattro gradi Celsius per 15 minuti.

Trasferire il super surnatante in una provetta da ultracentrifuga e conservare il pellet in un congelatore a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Centrifugare la provetta dell'ultracentrifuga a 100.000 volte G a quattro gradi Celsius per due ore. Successivamente, sciogliere la frazione microsomiale in 200 microlitri di tampone di denaturazione, quindi far bollire la soluzione a 100 gradi Celsius per 10 minuti.

Dopo aver raffreddato la soluzione riscaldata a temperatura ambiente, aggiungere una polvere di urea ad altissima purezza per ottenere una concentrazione finale di otto molari e incubare il campione a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere 500 millimolari. I oto Soluzione madre di acetammide al campione per dare una concentrazione finale di 15 millimolare.

Quindi incubare la soluzione al buio per 30 minuti a temperatura ambiente per alchilare i tioli liberi nel campione. Successivamente, aggiungere una soluzione madre DTT molare al campione per ottenere una concentrazione finale di 10 millimolari e incubare la soluzione per altri 10 minuti a temperatura ambiente. Per estinguere l'eccesso di acetammide, diluire la soluzione ottenuta 10 volte con tampone tris da 40 millimolari a PH otto, e successivamente aggiungere tripsina al campione con un rapporto da uno a 20 tra tripsina e quantità totale di proteine.

Ottenere la quantità di proteine totali utilizzando il test di Bradford. Mantenere la reazione di digestione in un forno a 37 gradi Celsius durante la notte per assicurarsi che la reazione sia completata. Al termine, terminare la digestione acidificando la soluzione del campione a pH uno con acido cloridrico 10 millimolare, una condizione che si degrada anche più rapidamente.

Il detersivo si degrada quindi il più rapido a 37 gradi Celsius per un'ora in un'incubatrice. Dopo l'incubazione, rimuovere la precipitazione sviluppata mediante centrifugazione dopo la centrifugazione. Pulire la natina SUP che contiene i peptidi del campione con una cartuccia di estrazione in fase solida C 18 e asciugare il campione ottenuto con l'aspiratore rapido.

Eseguire un'analisi della pagina SDS dei campioni prima e dopo i viaggi e la digestione per confermare l'efficienza della digestione. A questo punto, sciogliere i peptidi puliti in 200 microlitri di tampone di accoppiamento. Dopo aver aggiunto il puriato di sodio alla soluzione peptidica per ottenere una concentrazione finale di 10 millimolari.

Incubare il campione per 30 minuti al buio a temperatura ambiente Al termine dell'incubazione, spegnere il prate in eccesso con solfito di sodio per ottenere una concentrazione finale di 20 millimolari e un pH di cinque dopo l'incubazione per 10 minuti a temperatura ambiente, introdurre 200 microlitri di soluzione di resina derivata dagli idrociti, tampone pre-bilanciato e di accoppiamento nella soluzione peptidica. Incubare la reazione a 37 gradi Celsius per uno o due giorni con rotazione end-to-end per un accoppiamento completo. Al termine, rimuovere i peptidi non legati lavando la resina due volte con un millilitro di acqua deionizzata, un millilitro di cloruro di sodio 1,5 molari, un millilitro di metanolo e un millilitro di aceto nitrile all'80%.

Successivamente, raccogliere il surnatante e i lavaggi per l'analisi dei peptidi non legati. Conservare i campioni in un congelatore a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi. Quindi lavare la resina tre volte con un millilitro di bicarbonato di ammonio 100 millimolare a pH otto.

Infine, aggiungere 300 microlitri di bicarbonato di ammonio nella fiala del campione. Per rilasciare i glicopeptidi N dalla resina. Aggiungere PNG ACE F e incubare il campione a 37 gradi Celsius con una rotazione end-to-end.

Successivamente, raccogliere i peptidi rilasciati mediante centrifugazione, quindi lavare la resina con un millilitro di acetil nitrile all'80%. Unire il lavaggio con quello precedentemente raccolto. Infine asciugare la soluzione ottenuta nella velocità VAC per l'analisi lc MS.

Lo spettro glicopeptidico atipico prelevato dopo il metodo di arricchimento è mostrato qui nel glicopeptide ottenuto. L'n glicano è stato rimosso e il glicano attaccato è stato convertito in acido spartico da P-N-G-A-F. Pertanto, lo spettro può essere facilmente ricercato da qualsiasi motore di ricerca proteomica rispetto ai comuni database di sequenze proteiche.

MS lc atipico. Il risultato dei glicopeptidi n catturati è mostrato qui in cui più di 100 glicoproteine possono essere identificate da una singola corsa di lc MS di una frazione microsomiale cellulare. La selettività dell'arricchimento sia per le glicoproteine che per i glicopeptidi è generalmente superiore al 90%Un'analisi di successo può avere una selettività di arricchimento del 95%utilizzando una colonna SCX e un gradiente a gradini per frazionare ulteriormente. I campioni prima dell'analisi LCMS di solito raddoppiano il numero di identificazioni di glicoproteine.

A volte, quando la quantità dei glicopeptidi ottenuti è bassa, l'impurità accumulata dalle fiale può essere osservata nel campione finale. Questi contaminanti possono essere rimossi da una colonna MCX. Quindi, dopo aver visto questo video, spero che tu abbia una buona comprensione di come utilizzare i nostri metodi di cattura dei glicopeptidi per studiare le proteine di membrana self-service.

Durante il tentativo di questo protocollo, è anche importante mettere da parte dei campioni per ogni passaggio per la risoluzione dei problemi. Il volume del reagente può anche essere ottimizzato per lo studio specifico.