Spettroscopia Laser-Induced Breakdown: un nuovo approccio per la mappatura di nanoparticelle e la quantificazione in Tissue Organ

L'obiettivo generale di questa procedura è offrire un metodo semplice e robusto per mappare e quantificare elementi organici e inorganici in tessuti biologici mediante strumentazione da banco pienamente compatibile con la microscopia ottica convenzionale. Questo risultato si ottiene focalizzando un impulso laser sul campione di interesse per indurre la rottura e la scintilla del materiale. Il plasma emette radiazioni che vengono successivamente analizzate da uno spettrometro.

Il secondo passaggio consiste nella selezione e identificazione delle righe spettrali corrispondenti agli elementi di interesse e nella scansione della superficie del campione. Successivamente, eseguire misure di calibrazione per determinare le concentrazioni degli elementi. L'ultimo passaggio prevede la costruzione della mappatura elementare del tessuto campione a partire da tutti gli spettri registrati, utilizzando una scala di intensità relativa o di concentrazione.

Infine, la spettroscopia di rottura indotta da laser viene utilizzata per mostrare la distribuzione tissutale di vari elementi senza alcuna etichettatura, rispetto ad altri metodi esistenti come la microfluorescenza a raggi X o le tecniche basate su spettrometria di massa. La spettroscopia di rottura indotta da laser, o LIBS, è semplice da implementare, funziona a pressione atmosferica ed è compatibile con la maggior parte dei sistemi di microscopia ottica.

Inoltre, consente di raggiungere livelli di sensibilità nell'ordine delle parti per milione (PPM) con una risoluzione nell'ordine del micrometro. Questo metodo può aiutare a rispondere a una domanda fondamentale nella nanotecnologia applicata agli studi biologici, come ad esempio la distribuzione all'interno di un campione di tessuto di nanoparticelle contenenti elementi metallici, senza la necessità di etichettare le nanoparticelle. La tecnica può essere estesa alla patologia grazie al suo basso limite di rilevamento nel rilevare elementi metallici anomali come rame, ferro e alluminio che possono essere presenti in diversi organi del corpo, in particolare nel cervello. Questo metodo può fornire informazioni dettagliate sul rilevamento e l'identificazione delle nanoparticelle.

È inoltre applicabile ad altri sistemi, come il rilevamento di elementi inorganici nella TCU o la distribuzione di elementi eterogenei. Gli scienziati che dovranno condurre tali esperimenti dovranno impegnarsi con le impostazioni di acquisizione per ottenere un segnale il più intenso possibile senza danneggiare eccessivamente i campioni. Iniziare l'esperimento preparando le preparazioni campione da studiare per questo protocollo.

Ottenere organi da topi con tumore, a cui è stata iniettata una soluzione di nanoparticelle di gadolinio, per preparare vetrini. Posizionare fette degli organi dello spessore di 100 micrometri su un vetrino di quarzo o in una piastra di Petri. Conservare sempre i vetrini a meno 80 gradi Celsius.

Successivamente, preparare i campioni per la calibrazione. Etichettare diversi vial con concentrazioni crescenti, partendo da zero nanomolare fino a cinque millimolari. Per ogni vial, preparare 100 microlitri di una miscela acquosa di gadolinio alla concentrazione appropriata.

Una volta completata questa operazione, preparare un vetrino. Misurare cinque microlitri dalla prima provetta e depositarli lungo il vetrino in quarzo o la piastra di Petri. Assicurarsi di identificare la goccia per un uso successivo.

Spostarsi di tre millimetri lungo la circonferenza e depositare cinque microlitri della concentrazione successiva sul vetrino. Ripetere l'operazione per ciascuna delle soluzioni rimanenti. Lasciare asciugare il contenuto del vetrino per 20 minuti a temperatura ambiente.

Questa configurazione LIP utilizza un laser a neodimio-itrnio, granato di alluminio, che produce un fascio con lunghezza d'onda di 1064 nanometri. Utilizzare una parte del fascio per sincronizzare il sistema spettrometrico. Indirizzare l'altra parte attraverso un attenuatore controllato da computer, impiegato per regolare e stabilizzare l'energia dell'impulso laser durante l'intero esperimento.

Successivamente, indirizzare il fascio sulla zona del campione. Focalizzare il fascio sullo stadio di traslazione controllato via software, che sosterrà il porta-campione, e utilizzare una telecamera CCD per monitorare il montaggio della superficie del campione.

Un altro per monitorare il plasma della plasm. Analizzare la luce proveniente dalla rottura del campione in uno spettrometro a prisma con una telecamera ICCD mantenuta a meno 26 gradi Celsius. Per la misurazione, iniziare a stabilizzare il laser e raffreddare la telecamera a meno 26 gradi Celsius.

10 minuti prima dell'esperimento. Quando pronto, utilizzare l'attenuatore per bloccare l'energia dell'impulso a cinque millijoule. Successivamente, recuperare un vetrino campione da analizzare e prepararsi a montarlo sullo stadio del campione.

Fissare il campione sul supporto per campioni motorizzato. Una volta completato ciò, tornare al computer. Per posizionare il campione, spostare la piastra in modo che una parte del campione si trovi nel fascio del laser.

Regolare il fuoco del laser a circa 100 micrometri al di sotto della superficie del campione. Una volta effettuato ciò, il laser forma crateri di 50 micrometri o inferiori. Utilizzare il computer per impostare il valore della fenditura di ingresso dello spettrometro a 40 micrometri e i parametri ICCD per la misurazione di mappatura.

Regolare la posizione del supporto per puntare una regione del campione. Acquisire un'immagine panoramica ad alta risoluzione del campione utilizzando una sorgente luminosa a spettro ampio. Successivamente, utilizzare un software e l'immagine acquisita per definire la regione di scansione e la risoluzione del libs.

Qui la griglia è di 100 per 100 con 100 micrometri tra i punti. Avviare l'acquisizione automatica dei dati in ciascun punto della griglia. Viene misurato un spettro e registrato su file.

Quando le misurazioni sono completate in circa 30 minuti, acquisire una seconda immagine della sezione campione, quindi consolidare tutti gli spettri in un unico file di dati per un uso successivo. Successivamente, rimuovere la lametta del campione e prepararsi a montare i campioni di calibrazione. Fissare la lametta di quarzo con i campioni di calibrazione sulla fase di traslazione nuovamente al computer.

Posizionare il centro del primo campione di calibrazione sul percorso del laser. Mantenere i parametri dell'esperimento e registrare uno spettro. Eseguire la stessa procedura per ciascuno dei campioni con diverse concentrazioni di gadolinio.

Questi sono esempi di spettri registrati con singolo impulso da diverse regioni del tessuto renale. Lo spettro blu è stato registrato nella regione centrale del rene. Lo spettro rosso corrisponde alla membrana renale e lo spettro verde riguarda la zona periferica.

Le nanoparticelle a base di gadolinio iniettate sono composte da una matrice di polisilano con ioni di gadolinio chelati da ligandi doca sulle loro superfici. Nell'intervallo spettrale compreso tra 286 nanometri e 320 nanometri, è possibile rilevare gadolinio, calcio, ferro, silicio e alluminio. Si noti come le intensità varino nelle diverse regioni del campione, suggerendo una notevole eterogeneità nelle concentrazioni di questi elementi. La mappatura tissutale di gadolinio, silicio e ferro in una sezione di rene di topo è stata eseguita utilizzando i dati ottenuti da libs con una risoluzione di circa 100 micrometri.

L'intensità della scala è espressa in un'unità arbitraria. Questa è un'immagine in luce naturale. A scopo di confronto, risultati simili sono stati ottenuti con campioni tumorali.

Come in questa mappa del gadolinio e del tessuto tumorale SQ 20 B, una scala di colori falsi è stata sovrapposta all'immagine in luce naturale. In questo esperimento, i nanoparticelle sono state somministrate direttamente nel tumore. Dopo un'ora, il tumore è stato asportato e preparato per l'analisi.

Si noti che circa la metà del volume del tumore contiene alcune particelle sui master. Questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora per campioni di un centimetro quadrato con una risoluzione di 100 micrometri, se eseguita correttamente. Quando si eseguono analisi mediante lips, è importante ricordare che le misurazioni vengono effettuate a partire dal plasma indotto dal laser ed è fondamentale controllare tutti i parametri durante l'intero esperimento seguendo la procedura.

Possono essere eseguiti altri metodi, come l'immunohistochimica su sezioni adiacenti, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio riguardo al tipo di cellula coinvolta nel processo di interesse dopo il suo sviluppo. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della nanotecnologia applicata alla biologia e alla medicina per esplorare la distribuzione di composti contenenti elementi metallici nei tessuti biologici. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come utilizzare le tecniche lips per mappare multi-elementi nei tessuti biologici.