Preparazione di primaria Miogenica precursori cellulari / Culture mioblasti dal basale vertebrati Lignaggi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di coltivare cellule precursori miogeniche da teleostei per sottoporle a miogenesi in vitro. Ciò si ottiene sezionando prima il muscolo epaxale dall'organismo. Il secondo passo consiste nel dissociare meccanicamente il tessuto isolato.

Successivamente, il tessuto viene dissociato enzimaticamente per disperdere le cellule desiderate. Il passaggio finale consiste nel placcare le cellule precursori miogeniche isolate sulla lamina nel substrato. In ultima analisi, in vitro.

La miogenesi viene utilizzata per mostrare gli effetti di vari trattamenti sui cambiamenti nella regolazione e nell'espressione genica, nell'espressione proteica e nei cambiamenti del fenotipo cellulare. Questo video dimostrerà come impostare un sistema di coltura primaria da cellule precursori miogeniche teleostei. La dimostrazione visiva di questa tecnica è indispensabile in quanto alcune delle fasi di dissociazione possono essere difficili da imparare.

Una dissociazione corretta e adeguata è fondamentale per isolare un pellet cellulare adeguato per la coltura successiva. Per iniziare, prepara tutti i terreni e le soluzioni necessarie per la procedura. Successivamente, assembla gli elementi aggiuntivi necessari per l'isolamento dei tessuti.

Autoclave preventiva ove necessario. Assicurati di preparare materiali aggiuntivi per ogni persona che assiste al processo di dissezione. Altri articoli da avere a portata di mano includono etanolo al 70%, una bilancia sterile, provette coniche da 50 millilitri e ghiaccio per ogni cinque grammi di tessuto da sezionare.

Aliquotare 25 millilitri di terreno isolante in una provetta conica sterile da 50 millilitri. Dopo aver pesato e registrato il numero di massa, i tubi e posizionarli sul ghiaccio. Quando è pronto, recuperare un pesce da utilizzare nella dissezione dei tessuti e immergerlo in etanolo al 70% per 30 secondi prima di posizionarlo su carta autoclave idrorepellente direttamente dietro l'erla utilizza il bisturi per praticare un'incisione superficiale poco profonda, afferrare la pelle in corrispondenza dell'incisione e tirare verso la coda per rimuovere le squame e la pelle.

Quindi, asportare il muscolo bianco glicolitico veloce axel del pesce da entrambi i lati. Evitare il muscolo rosso ossidativo lento situato vicino alla linea laterale. Mettere il muscolo in isolamento, medio e scartare il resto del pesce.

Continuare a raccogliere il tessuto fino a ottenere una quantità sufficiente di muscolo durante la dissezione, assicurarsi che il tessuto muscolare accumulato rimanga sul ghiaccio per mantenere la vitalità cellulare. Per iniziare, versare un tubo di tessuto muscolare in una capsula di Petri di vetro. Usa due bisturi con un movimento avanti e indietro per tritare il tessuto fino a quando l'impasto di tessuto può essere facilmente rimosso.

Con una pipetta da 25 millilitri, riposizionare l'impasto di tessuto nella provetta originale. Ripetere questi passaggi fino a quando tutto il tessuto non è stato dissociato meccanicamente. Quando tutto il tessuto è stato processato, centrifugare per cinque minuti, scartare il surnatante e lavare il tessuto con terreno fresco prima di un altro ciclo di centrifugazione.

Una volta lavato accuratamente, sospendere il tessuto e incubarlo con una soluzione di collagenasi per 60 minuti a 18 gradi Celsius con un leggero dondolio. Al termine dell'incubazione centrifugare le provette per pellettare le cellule. Dopo aver lavato due volte, risus, sospendere il fazzoletto nel mezzo di lavaggio.

Quindi, triturare l'omogeneizzato di tessuto fino a farlo entrare e uscire da una pipetta da 10 millilitri con relativa facilità. Ripetere questo processo con una pipetta da cinque millilitri e poi di nuovo con una cannula metallica calibro 16 attaccata a una siringa. Una volta accuratamente omogeneizzato, pellettare il tessuto e decantare il surnatante.

Risospendere il tessuto in viaggi in mezzo di dissociazione e incubare per 20 minuti a 18 gradi Celsius. Successivamente, posizionare le provette nella centrifuga per una breve centrifuga dopo la centrifugazione. Decantare il surnatante in quattro volumi uguali di isolamento.

Il fluido deve essere conservato a quattro gradi Celsius rispetto al pellet rimanente. Ripetere i viaggi e le fasi di dissociazione appena dimostrate e combinare il surnatante risultante. Con quello raccolto in precedenza.

Erogare la miscela finale in provette coniche da 50 millilitri e centrifugare. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante facendo attenzione a non disturbare la cellula. Pipettare in pellet due millilitri di terreno completo in ciascuna provetta.

Per sciogliere, combinare le cellule risospese in un tubo conico da 50 millilitri. Sciacquare ogni tubo con un millilitro di terreno completo. Aggiunta del risciacquo al pool di cellule risospese.

Tritrare il tessuto con una cannula metallica e una siringa da cinque a 10 volte. Dopo aver filtrato la sospensione cellulare, aggiungere una quantità sufficiente di terreno completo pari a 50 millilitri e centrifugare. Recuperare le cellule, rimuovere il surnatante e aggiungere cinque millilitri di terreno completo.

Una volta risospeso, rimuovere un piccolo campione per determinare il numero di cellule vitali. Utilizzando un emocitometro. Rimuovere la soluzione di laminina dalle piastre trattate con poli L lisina.

Dopo aver diluito le cellule alla concentrazione necessaria, piastrle sulle piastre preparate e sigillarle. Posizionare le piastre sigillate in un'incubatrice refrigerante impostata alla temperatura appropriata. 24 ore dopo la semina le cellule precursori miogeniche o MPC devono essere visibilmente attaccate al substrato di laminina, mentre originariamente appaiono più compatte.

Gli MPC del pesce zebra adottano morfologie simili alla trota iridea. Nell'arco di quattro giorni di coltura, i miotubi dovrebbero formarsi entro sei-nove giorni di coltura. In coltura, è dimostrato che le MPC e i mioblasti esprimono myo D one.

Man mano che i mioblasti si differenziano in miotubi, inizieranno a esprimere la miogenina. Questi dati mostrano la proliferazione cellulare durante la coltura utilizzando BRDU in incorporazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e cultura.

Cellule precursori miogeniche di una varietà di specie ittiche Dopo il suo sviluppo iniziale in cellule Monets. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori e alla biologia muscolare per esplorare nuove strade nella biologia muscolare e in altri organismi e altri telio come i danios, così come altri anfibi o anfibi come Axel.Lots.