Name: Preparazione di primaria Miogenica precursori cellulari / Culture mioblasti dal basale vertebrati Lignaggi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Impara a isolare e coltivare precursori miogenici da teleostei per studiare la miogenesi in vitro. Questo metodo consente di analizzare la crescita muscolare e i meccanismi di sviluppo in specie non mammifere.

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Gli autori desiderano estendere molte grazie al Drs. Josep Planas e Juan Castillo per le loro competenze professionali per lo sviluppo e l&#39;applicazione di questo protocollo cultura di piccoli pesci e anfibi. Un ringraziamento anche a causa delle innumerevoli persone che hanno instancabilmente assistito con la dissezione e la dissociazione del tessuto muscolare da molti pesci (sia nelle specie e numero), tra cui Matthew ricarica, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily, e Sinibaldo Romero. Questo lavoro è stato sostenuto da University of Alabama a Birmingham Dipartimento di fondi di start-up Biologia, Centro per la Ricerca proteasi NIH di Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS di Grant # R03AR055350, e NDSU Advance AVANTI NSF di Grant # HRD-0.811.239 di PRB. Il sostegno è stato fornito anche dalla UAB Nutrition Obesity Research Center di aggiudicazione # P30DK056336, NIH NIDDK. Suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non necessariamenterappresentano la posizione ufficiale del NIH.

Etica Dichiarazione: Tutti sperimentazione sugli animali vertebrati qui descritti è stato approvato in via preliminare dal Comitato Istituzionale cura degli animali e uso della University of Alabama a Birmingham ed è coerente con le linee guida stabilite dal Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health degli Stati Uniti Dipartimento di Salute e Servizi Umani. 1. Preparazione per la Cultura <ol><li> Preparare il terreno base come segue: 9 mM NaHCO3 (1,51 g per 2 L), 20 mM HEPES (9,53 g per 2 L) in DMEM (13,48 g / L; 26,96 g per 2 L). <ol><li> Determinare il pH e regolare a 7,40 con HCl o NaOH. </li><li> Determinare osmolalità e regolare a ~ 300 mOsm con NaCl (se necessario). </li><li> Filtro sterilizzare con (2) sistemi di sterilizzazione 1 L di vuoto e conservare a 4 ° C al riparo dalla luce per un massimo di 2-3 mesi. NOTA: vedere tabelle 1 e 2 per la completa reagenti, strumenti, consumAbles, e di informazione. </li></ol></li><li> Preparare-L-lisina trattati poli piastre sciogliendo 5 mg di γ-irradiati poli-L-lisina (&gt; 300.000 mw) in 50 ml di acqua ultrapura sterile. Mescolare delicatamente per inversione per 10 minuti a temperatura ambiente, assicurando la piena dissoluzione dei polimeri lisina. </li><li> Pipettare la quantità necessaria di poli-L-lisina soluzione in ogni pozzetto, secondo il tipo di placca (Tabella 3). Lasciare le piastre a stare in cappa a flusso laminare per 5 minuti. </li><li> Quindi, rimuovere poli-L-lisina soluzione e lavare due volte con acqua sterile. Lasciare le piastre di aria secca in cappa a flusso laminare per 20 minuti. </li><li> Ottenere 1 mg di laminina (origine Engelbreth-Holm-Swarm) e sciogliere in 50 ml di terreno base ad una concentrazione finale di 20 mg / ml. Applicare la soluzione laminina alle piastre di coltura cellulare poli-L-lisina trattati a 2 mg / cm 2. (Cfr. tabella 3 per le diverse dimensioni della piastra) </li><li> Agitare delicatamente la soluzione per assicurare full bene la copertura. Sigillare le piastre con nastro adesivo di laboratorio e posto in incubatrice per 24 ore. L&#39;incubatore deve essere impostato a temperatura appropriata per specie utilizzata (vedi Tabella 7), e nessun gas aggiuntivi devono essere aggiunti alla incubatrice. NOTA: laminina deve poter aderire alle piastre per 24 ore prima della semina di cellule. In caso contrario, si provocherebbe un calo di alcuna adesione cellulare. </li><li> Preparare il supporto come descritto nella Tabella 4. Supporto completo sia meglio preparato il giorno di utilizzo. </li><li> In preparazione per l&#39;isolamento dei tessuti, assemblare i seguenti elementi e autoclave: 300-500 bicchiere ml (s); Piatti di vetro Petri; gestisce bisturi; pinze (fine e grossolano); forbici dissezione; e diversi fogli di carta autoclave acqua-repellente. NOTA: Per ogni persona che assiste con il processo di dissezione, (2) maniglie bisturi, (1) pinza (tipo a seconda delle preferenze personali), (1) forbici dissezione, e (5-10), fogli di carta autoclave idrorepellente sonosufficiente. </li><li> Oltre agli elementi sopra autoclave, assemblare etanolo al 70%, un bilanciamento del peso, provette coniche da 50 ml sterili (numero dipende dalla dimensione della cultura), e ghiaccio. </li></ol> 2. Dissezione dei tessuti <ol><li> Prima di iniziare, assicurarsi che uno stock sufficiente di pesce è disponibile. NOTA: L&#39;età del pesce da utilizzare è di importanza critica. Mentre i pesci di due specie diverse possono essere di pesi simili, un pesce più giovane di una specie si possiedono più PPM di un pesce più vecchio di un&#39;altra specie. Come regola generale, i pesci più giovani, soprattutto quando si lavora con salmonidi, sono i migliori. Per danionins, il pesce vecchio di un anno può essere utilizzata in modo ottimale, mentre i salmonidi di età 4-6 mesi o più giovani (fino a 15 g) sono ottimali. </li><li> Per ogni 5 g di tessuto che deve essere sezionato, aliquota di 25 ml di terreno di isolamento in un tubo da 50 ml sterile. </li><li> Pesare, massa record e il numero del tubo (s). Mettere le provette su ghiaccio. </li><li> Euthanize 2-3 pescialla volta per immersione in&gt; 300 mg / L di sodio bicarbonato tamponata tricaine metansolfonato. Consentire movimento dell&#39;opercolo cessare per&gt; 5 minuti e poi immergere pesce in etanolo al 70% (contenuto nei contenitori sterili) per 30 secondi. </li><li> Rimuovere il pesce dal 70% di etanolo e mettere su carta autoclave idrorepellente. Direttamente dietro la opercoli, usare un bisturi per fare un superficiale, poco profonda incisione. Rimuovere le squame e la pelle afferrando la pelle alla incisione di cui sopra e tirare verso la coda del pesce. </li><li> Dopo la rimozione della pelle, asportare il epaxial, fast-glicolisi muscolare &#39;bianco&#39; del pesce da entrambi i lati (evitando il muscolo lento-ossidativo &#39;rosso&#39; si trova vicino alla linea laterale) e il luogo in terreno di isolamento. Scartare il resto del pesce come richiesto dalla istituzione. Cellule Mentre è del tutto possibile PPM cultura provenienti da muscolo rosso, quasi ogni pubblicazione utilizzando teleosteo MPC ha utilizzato isolati dal epaxial m: NOTAyotome. </li><li> Ripetere i passaggi 2,4-2,6 fino ad ottenere una sufficiente quantità di muscolo. Durante la dissezione, assicurarsi che il tessuto muscolare pool rimane sul ghiaccio per mantenere la vitalità cellulare. </li></ol> 3. Dissociazione meccanica <ol><li> Versare un tubo di 25 ml / 5 g di muscoli in una piastra di Petri di vetro. Utilizzando due bisturi manici con allegato # 10 lame bisturi, trita tessuto una consistenza fangosa o purea. Un movimento &quot;avanti e indietro&quot; di tirare le lame di bisturi passato vicenda funziona meglio. NOTA: Mentre omogeneizzatori tessuto possono sembrare del caso, il numero di cellule vitali sarà drasticamente ridotto, se non abolita. </li><li> Usando una pipetta 25 ml sierologica e pipetta sierologica, rimuovere il tessuto impastato e sostituire nel tubo conico originale. </li><li> Ripetere i passaggi 3.1-3.2 finché tutti i tessuti in tutte le provette è stato dissociato meccanicamente. </li><li> Tessuto Centrifugare per 5 minuti a 300 xg e 10 ° C. </li><li> Follcentrifugazione causa, eliminare i ml 25 di media surnatante con una pipetta 25 ml sierologica, aspiratore, o da un attento decantazione. </li><li> Aggiungere 25 ml di mezzo di lavaggio per ogni tessuto tubo, risospendere e recentrifuge come sopra. </li><li> Lavare due volte con mezzo di lavaggio, rimuovendo il supernatante ogni volta. </li></ol> 4. Enzimatica dissociazione <ol><li> Durante la fase 3.4, preparare la soluzione collagenasi unendo 0,22 g di tipo IV collagenasi e 44 ml di terreno di base (o quantità sufficiente a 0.11 g/0.22 ml). </li><li> Mescolare in un becher per 10-15 minuti a 4 ° C. Filtro sterilizzare con una siringa da 50 ml e un filtro a siringa da 0,45 micron. NOTA: Più di un filtro a siringa può essere necessario, a seconda della preparazione collagenasi. Collagenase ottenuto da fornitori diversi Worthington Biochemical pone maggiori difficoltà durante la filtrazione. Collagenase viene utilizzata per dissociare legami peptidici in collagene che costituiscono l&#39;endomisio. Questodigestione rimuoverà la barriera protettiva delle miofibre. </li><li> Per ogni g di tessuto muscolare, risospendere il tessuto in una soluzione di collagenasi allo 0,2%. Per 5 g di tessuto muscolare, aggiungere 10 ml di soluzione di collagenasi e 15 ml di terreno base. </li><li> Aggiungere 10 ml di FPF per ml di collagenasi soluzione a medio / base (ad esempio, 250 ml a 25 ml). Assicurarsi che il tessuto è ben sospeso, in quanto questo influenzerà l&#39;efficienza della digestione enzimatica. </li><li> Incubare il tessuto muscolare in collagenasi per 60 minuti a 18 ° C con dolce dondolio. A seconda del grado di dissociazione meccanica e specie, collagenasi digestione può essere esteso a 90 minuti, anche se questo può influenzare la vitalità cellulare. </li><li> Seguendo tubi digestione collagenasi, centrifuga coniche a 300 xg per 5 minuti a 12 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere tessuto in 25 ml di terreno di lavaggio. </li><li> Recentrifuge a 300 x g per 5 minuti a 126; C. Ripetere con mezzo di lavaggio una seconda volta. </li><li> Dopo tessuto lavaggio due volte, risospendere tessuto muscolare in 25 ml di mezzo di lavaggio e triturare con 10 ml pipetta sierologica finché il tessuto / medio omogenato passa dentro e fuori della pipetta con relativa facilità. 5-10 triturazioni di solito è sufficiente. <ol><li> Ripetere con 5 ml pipetta sierologica e poi una cannula metallica 16 attaccato ad una siringa. </li></ol></li><li> Provette per centrifuga coniche a 300 xg per 5 minuti a 12 ° C. Decantare il surnatante. </li><li> Durante la centrifugazione sopra di 5 minuti, preparare la soluzione tripsina digestione combinando 0,25 g di tripsina con 5 ml di terreno base. </li><li> Agitazione a 4 ° C per 10-15 minuti e filtro sterilizzare con una siringa da 20 ml e 0,45 micron filtro a siringa. </li><li> Recuperare provette coniche e aggiungere 100 ml di soluzione di tripsina e 4,9 ml di mezzo di dissociazione per ogni 1 g di tessuto muscolare di ogni tubo. Per example, aggiungere 500 ml di soluzione di tripsina e 24,5 ml di dissociazione medio per 5 g di tessuto muscolare. NOTA: La tripsina è una serina proteasi che separerà cellule precursori miogenici dalla lamina basale. </li><li> Tessuto Risospendere in tripsina / dissociazione medie dimensioni, ben. Incubare per 20 minuti a 18 ° C. </li><li> Seguendo la prima incubazione tripsina, provette coniche centrifugare a 300 xg per 1 min a 12 ° C. </li><li> Neutralizzare tripsina combinando i surnatanti con terreno di isolamento ad una concentrazione di 1 volume di supernatante in 4 volumi di terreno di isolamento. Conservare a 4 ° C durante la seconda digestione tripsina. </li><li> Per il pellet residuo di tessuto, ripetere i passaggi 4,12-4,15, combinando il supernatante seguente passo 4.15 con il fluido supernatante / isolamento dalla prima digestione tripsina. </li><li> ALTERNATIVA: Le digestioni collagenasi e tripsina possono essere combinati per massimizzare le rese delle cellule. &lt;ol&gt; <li> A tale scopo, triturare la collagenasi digest utilizzando una cannula metallica (6 in lunghezza e 16 gauge funziona meglio) attaccato ad una siringa da 20 ml fino omogenato passa facilmente attraverso la cannula. </li><li> Per l&#39;omogeneizzato, aggiungere 500 ml di soluzione di tripsina (preparato nella fase 4.10) e incubare a 18 ° C per 20 minuti. </li><li> Seguendo le provette di incubazione, centrifugare conici a 300 xg per 1 minuto a 12 ° C. </li><li> Neutralizzare tripsina combinando i surnatanti con terreno di isolamento ad una concentrazione di 1 volume di supernatante in 4 volumi di terreno di isolamento. </li><li> Conservare a 4 ° C durante la seconda digestione tripsina. </li><li> Procedere con il punto 4.18 come con il protocollo standard. </li></ol></li><li> Distribuire la miscela di medio surnatante / isolamento finale in 50 ml provette coniche e centrifugare a 300 xg per 10 minuti a 12 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante facendo attenzione a non disturbare la cellapellets. Pipettare 2 ml di terreno completo in ogni provetta, dissolvendo ogni pellet di cellule. </li><li> Combinare cellule sospese in terreno completo in una provetta conica da 50 ml. </li><li> Risciacquare ogni provetta con 1 ml di terreno completo, combinandosi con il pool di cellule risospese in precedenza. </li><li> Triturare con una cannula metallica e siringa 5-10 volte. </li><li> Filtrare sospensione cellulare attraverso un filtro 100 micron cella, lavando con mezzo completo. </li><li> Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cella 40 pm. </li><li> Aggiungere mezzo completo sufficienti a 50 ml e centrifugare a 300 xg per 10 minuti a 15 ° C. </li></ol> 5. Conteggio, diluizione e semina delle cellule <ol><li> Dopo la centrifugazione finale nel passo 4,25, rimuovere il surnatante da un&#39;attenta decantazione o con una pipetta sierologica. Risospendere il pellet di cellule in 5 ml di terreno completo. </li><li> Con le celle completamente risospese, rimuovere 20 pl; Della sospensione cellulare e posto in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 5 ml di Trypan colorante blu e attendere 5 minuti. Utilizzando un emocitometro, determinare il numero di cellule vitali. </li><li> Su determinazione, diluire celle alla concentrazione necessaria. Teleosteo PPM sono meglio seminati a 150.000-200.000 cellule per cm 2. Per una strategia sei pozzetti placcatura, diluendo cellule a 1,5 x 10 6 - 2,0 x 10 6 per ml supporta proliferazione e differenziazione sufficiente. </li><li> Recupera-L-lisina poli-trattati, piatti laminina rivestite e cellule di semi. (Vedi Tabella 5 per diluizioni specifico targa e volumi di placcatura.) Nota: La tabella 6 illustra numero medio di cellule isolate per grammo di tessuto muscolare isolati da varie specie di teleostei. La trota iridea (O. mykiss) esporre un minor numero di PPM per grammo di tessuto muscolare che fare zebrafish (D. rerio) e verrà quindi richiederà più pesce per isolare da per una corretta semina. </li><li> Sigillare piastre con nastro laboratorio e posto in incubatrice refrigerazione alla temperatura appropriata. PPM di tutte le specie qui elencate (salvo per i topi), possono essere incubate in condizioni atmosferiche normali senza anidride carbonica (CO 2) integrazione. (Vedi Tabella 7). </li><li> ALTERNATIVA: Alcuni laboratori hanno adottato un protocollo che richiede permettendo PPM di aderire al substrato di coltura per 40 minuti. <ol><li> Poi risciacquare piastre con mezzi di lavaggio per rimuovere eventuali cellule debolmente attaccate e non aderenti. Attenzione: Questo passaggio è molto importante per evitare l&#39;adesione &quot;non-specifico&quot; di altre cellule (ad esempio fibroblasti) alla substrati cultura. </li><li> Aggiungi mezzi di comunicazione completi e cellule posto in incubatrice e la cura per come di seguito dettagliato. </li></ol></li></ol>

Non c&#39;è nulla da rivelare.

Il programma miogenico, in qualsiasi specie esaminate, può essere più facilmente studiata attraverso un sistema in vitro. Infatti, sull&#39;isolamento, cellule precursori miogenici (PPM) in pesci o cellule myosatellite (MSC) nei mammiferi facilmente entrare in questo processo altamente regolato che coinvolge la proliferazione, ritiro ciclo cellulare e differenziazione terminale dei mioblasti e la fusione di questi mioblasti in miotubi nascenti. La generale mancanza di ceppi transgenici gene reporter di specie p...

Notevole comprensione della miogenesi mammiferi è stato ottenuto attraverso la ricapitolazione di questo processo in entrambe mouse principale (Mus musculus) culture mioblasti e la linea cellulare derivata da topo ben descritto, C2C12 5. A partire dal 1950 6, queste culture hanno portato a molto progresso nella comprensione del programma murinemyogenic e, per estensione, miogenesi in altri vertebrati. Inoltre, monocellulari tecniche myofiber espianto hanno aumentato fuori comprensione delle interazioni tra le cellule satelliti e fibre muscolari che circondano 7-9. Colture cellulari sono particolarmente interessanti per le indagini di myogenesis a causa del poco tempo da precursore delle cellule differenziate 10, relativa facilità di trasfezione per RNAi 11-14, transgenici 15,16 e iperespressione studi 14,17,18, l&#39;espansione in vitro seguita da trapianto in vivo 18-20, e anche compArison di cellule precursori miogeniche e ai loro agenti di regolazione tutta taxa 21,22. Mentre le differenze dovute all&#39;ambiente artificiale del sistema di coltura sono stati descritti 5,23, questi sistemi in vitro hanno dimostrato di essere indispensabile al nostro dissezione del programma intricato regolamentano la formazione di multinucleate, myofibersfrom terminalmente differenziate mononucleate cellule progenitrici proliferative conosciuti come myosatellite cellule (MSC) tra i mammiferi. Al di fuori della classe Mammalia, tuttavia, la conservazione e / o divergenza di meccanismi che controllano myogenesis sono capiti male, soprattutto a causa della difficoltà di coltura di cellule precursori mioblaste (PPM) e mioblasti da diversi taxa. Infatti, colture primarie di mioblasti sono stati descritti solo in tre uccelli 24-26, un rettile 27, un paio di anfibi 28-30, e alcuni pesci 1,3,4,31-33. Linee cellulari continue miogeniche da vertebrates diversi roditori 34-36 sono ancora più rari, con l&#39;unica linea non-mammiferi miogenico delle cellule essendo derivata da quaglia giapponese (Cortunix japonica), QM7 37. Nonostante i molti tentativi di immortalization, una linea cellulare miogenico teleosteo rimane sfuggente e un protocollo per la trasfezione efficiente di queste cellule è stato pubblicato solo quest&#39;anno 15. Quindi, sono molto necessari protocolli chiari e ben ottimizzato per la coltura PPM primari e mioblasti da una varietà di vertebrati, non solo per espandere ulteriormente la nostra conoscenza dell&#39;evoluzione del programma miogenico, ma di utilizzare il potere della fisiologia comparata a fare progressi in il trattamento di malattie muscolari scheletriche ei disturbi umani. Mentre la letteratura contiene molte segnalazioni di MPC / mioblasti isolamento 38-49, è comune per gli autori per descrivere i protocolli per tali isolamenti in breve, spesso incompleti, formati. Inoltre, i protocolli più istruttivi pronti contro termineVALIDITA sono stati sviluppati per i topi 50-53, e alcuni di questi contare su selezione di anticorpi 54,55 o transgeni fluorescenza 56,57, rendendo questi protocolli inutilizzabile o impraticabili intimi specie di non roditori utilizzati dai biologi muscolari. Con poco conosciuto su piscine, anfibi, rettili e miogenesi, un protocollo dettagliato e approfondito, descritta con una guida audiovisiva e con efficienza dimostrata in specie lontanamente imparentati, sarebbe più utile per il campo. In primo luogo descritto da Powell e colleghi nel 1989 58, il seguente protocollo è stato inizialmente sviluppato per isolare PPM e mioblasti da pesci salmonidi (vale a dire, trota iridea, Oncorhynchus mykiss, e salmone atlantico, Salmo salar) e alcuni ciprinidi più grandi (ad esempio pesci rossi, Carassiusauratusauratus) . Nel 2000, Fauconneau e Paboeuf ottimizzati una cultura mioblasti primario per la trota iridea 59, e minoroptimizations made che il protocollo utilizzabile in diversi pesciolini piccoli del clade Danioninae (zebrafish, Danio rerio, e Danio giganti, Devario Aequipinnatus) 32 a causa dei molti strumenti genetici disponibili per il lavoro zebrafish e quindi i suoi parenti stretti. Pesci teleostei sono organismi interessanti per lo studio a causa della loro strategia di crescita divergente (almeno nella maggior parte delle specie). Grandi salmonidi, come la maggior parte dei pesci, crescono indeterminato, con un potenziale di crescita illimitato da parte di un asintoto alla scadenza, anche in età 60-62. A differenza di zebrafish, grandi danionins come il danio gigante 63 e potenziali di crescita visualizzazione Danio baffuti tipici dei pesci teleostei, rendendo la loro diretta giustapposizione una piattaforma ideale per capire se la scelta del destino cellulare MPC svolge un ruolo nella iperplasia muscolo scheletrico contro l&#39;ipertrofia. Allo stesso modo, abbiamo dimostrato che questo protocollo può essere utilizzato con topi e axolotl, con rendimento relativamente elevato cellulare e viabindici ility. Salamandre urodèle, come l&#39;axolotl messicano (Ambystomamexicanum), possiedono la straordinaria capacità di rigenerare i tessuti, anche di interi arti e code di 64-66. Questa caratteristica rende questi anfibi interessanti modelli di atrofia muscolare scheletrico e l&#39;invecchiamento. Utilizzando il protocollo descritto di seguito, un approccio simile può essere effettuata come è stato fatto in molte specie di pesce, fornendo un contesto comparativo ancora più ampia per tali studi. Come molti biologi veramente apprezzare comparativi, i progressi più significativi nel campo della biologia di base e traslazionale biomedicina possono essere fatte quando i dati vengono analizzati all&#39;interno dello spettro più ampio (qui, l&#39;intera stirpe dei vertebrati).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabella 1. Informazioni dettagliate sui reagenti</td></tr><tr>Azienda di<td>reagenti</td><td>(preferito vs. alternativo)</td><td>Numero di catalogo (preferito v. alternativo)</td><td>Quantità per coltura</td></tr><tr><td>&gamma;-irradiato poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)</td><td>P5899 (ICN19454405)</td><td>5 mg</td></tr><tr><td>DMEM (glucosio alto)</td><td>Sigma-Aldrich (cellgro)</td><td>MT-50-003-PB (D7777)</td><td>2 L</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>BD Biosciences ( Sigma-Aldrich)</td><td>CB-40232 (L2020)</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>di bicarbonato di sodio (NaHCO3)</td><td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>BP328-500 (S5761)</td><td>1,51 g</td></tr><tr><td>HEPES (C8H18N2O4S)</td><td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>BP310-1 (H6147)</td><td>9,53 g</td></tr><tr><td>Antibiotico/Antimicotico</td><td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>SV3007901 (A5955)</td><td>17-20 ml di</td></tr><tr><td>gentamicina solfato</td><td>Lonza (Sigma-Aldrich)</td><td>BW17-519Z (G1397)</td><td>2-3 mL</td></tr><tr><td>Sieri equini donatori</td><td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>SH3007403 (H1270)</td><td>75 mL</td></tr><tr><td>Sieri fetali bovini</td><td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>SH3007103 (F2442)</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Collagenasi (Tipo IV)</td><td>Worthington (Sigma-Aldrich)</td><td>LS004189 (C9891)</td><td>0,44 g</td></tr><tr><td>Tripsina (dal pancreas)</td><td>MP Biomedicali (Sigma-Aldrich)</td><td>ICN15357125 (T5266)</td><td>1 g</td></tr><tr><td colspan="4">Tabella 2. Materiali di consumo, strumenti e attrezzature</td></tr><tr><td>Strumenti di consumo</td><td></td><td>Attrezzature</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari</td><td>Pinze (grossolane)</td><td>Pipettatore</td><td></td>sierologico</tr><tr><td>Sterile Provette coniche da 50 mL</td><td>Pinze (fini)</td><td>Misuratore di</td><td></td>pH</tr><tr><td>Nastro da laboratorio</td><td>Manici per bisturi Incubatore</td><td>di raffreddamento (Echotherm)</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &mu; m Sistemi di sterilizzazione sottovuoto</td><td>Lame per bisturi (#10, #11)</td><td>Cappa</td><td></td>a flusso</tr><tr><td>laminare Autoclave idrorepellente</td><td>Forbici chirurgiche</td> di carta <td>Collettore</td><td></td>a vuoto</tr><tr><td>Pipette sierologiche Piastre</td><td>di Petri in vetro</td><td>Misuratore</td><td></td></tr><tr><td></td> di microosmolalità <td>12-16 G Cannule con Luer Locks</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabella 3. Volumi ottimizzati per il rivestimento di piastre per colture cellulari</td></tr><tr><td>Dimensioni della piastra</td><td>cm^2 per pozzetto</td><td>Poli-L-lisina*</td><td>Laminina**</td></tr><tr><td>6 pozzetti</td><td>9,5</td><td>1,6 mL</td><td>1</td></tr><tr><td>24 pozzetti</td><td>1,9</td><td>0,32</td><td>0,2 48</td></tr><tr><td>pozzetti</td><td>0,95</td><td>0,16</td><td>0,1</td></tr><tr><td>96 pozzetti</td><td>0,32</td><td>0,06</td><td>0,03</td></tr><tr><td>*0,1 mg/mL concentrazione</td><td>** 0,020 mg/mL concentrazione</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabella 4. Terreni per l'isolamento, la dissociazione e la coltura</td></tr><tr><td>Reagente</td><td>Isolamento Lavaggio</td><td></td><td>Dissociazione</td></tr><tr><td>Base Terreno</td><td>419,25 mL</td><td>395,40 mL</td><td>297,00 mL</td></tr><tr><td>Gentamicina solfato**</td><td>0,75 mL</td><td>0,60 mL-Siero</td><td></td></tr> <tr><td>equino donatore</td><td>75,00 mL</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino***</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>* PSF: cocktail di penicillina/streptomicina/fungizone (100x); ** Concentrazione di 50 mg/mL; Caratterizzato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabella 5. Diluizioni e volumi di placcatura consigliati</td></tr><tr><td>Dimensione della piastra</td><td>cm^2 per pozzetto</td> Volume <td>di diluizione della placcatura</td><td></td></tr><tr><td>6 pozzetti</td><td>9,5</td><td>1,5-2,0x10^6 cellule/mL</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>24 pozzetti</td><td>1,9</td><td>1,5-2,0x10^6 cellule/mL</td><td>250 &mu; L</td></tr><tr><td>48 pozzetti</td><td>0,95</td><td>1,5-2,0x10^6 cellule/mL</td><td>150 &mu; L</td></tr><tr><td>96 pozzetti</td><td>0,32</td><td>1,5-2,0x10^6 cellule/mL</td><td>50-100 &mu; L</td></tr><tr><td colspan="4">Tabella 6. Numero medio di cellule per g di tessuto</td></tr><tr><td>Specie</td><td>Media # cellule/g di tessuto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio</td><td>6.400.000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio dangila</td><td>1.783.000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Devario aequipinnatus</td><td>1.797.000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oncorhynchus mykiss</td><td>66.800</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabella 7. Temperature di incubazione consigliate</td></tr><tr><td>Temperatura</td><td></td><td></td><td>della specie</td></tr><tr><td>Danio/ Devario spp.</td><td>26 - 28 gradi C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oncorhynchus/Salmo spp.</td><td>10* - 18 gradi C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambystoma mexicanum</td><td>18&deg; C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>* Temperature più basse favoriscono tassi di proliferazione più bassi.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione di primaria miogenica precursori cellulari / culture mioblasti dal basale vertebrati lignaggi

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

A causa della difficoltà intrinseca e ora coinvolto con lo studio del programma miogenico in vivo, sistemi di coltura primarie derivate da cellule staminali adulte residenti del muscolo scheletrico, le cellule precursori mioblaste (PPM), si sono rivelati indispensabili per la nostra comprensione dello sviluppo dei mammiferi muscolo scheletrico e crescita. Soprattutto tra i taxa basali di vertebrati, tuttavia, i dati sono limitati descrive i meccanismi molecolari che controllano l&#39;auto-rinnovamento, la proliferazione e la differenziazione di PPM. Di particolare interesse sono i potenziali meccanismi che sottendono la capacità dei vertebrati basali a subire notevoli postlarval scheletrico myofiber iperplasia (cioè i pesci teleostei) e piena rigenerazione in seguito alla perdita appendice (cioè urodèle anfibi). Inoltre, l&#39;utilizzo dei mioblasti in coltura potrebbe aiutare nella comprensione della rigenerazione e la ripresa del programma miogenico e le differenze tra loro. Atal fine, si descrive nel dettaglio un protocollo robusto ed efficiente (e le variazioni in esso) per isolare e mantenere PPM e la loro progenie, mioblasti e miotubi immaturi, in coltura cellulare come piattaforma per comprendere l&#39;evoluzione del programma miogenico, a cominciare dal più vertebrati basali. Sfruttando il modello di status organismo del pesce zebra (Danio rerio), si segnala l&#39;applicazione di questo protocollo per piccoli pesci del clade ciprinidi Danioninae. In tandem, questo protocollo può essere utilizzato per realizzare un approccio comparativo più ampio isolando PPM dal axolotl messicano (Ambystomamexicanum) e anche roditori da laboratorio. Questo protocollo è ora ampiamente utilizzato nello studio myogenesis in diverse specie di pesci, tra cui la trota iridea, salmone e orate 1-4.

Ventiquattro ore dopo la semina, le cellule precursori miogeniche (PPM) devono essere visibili attaccato al substrato laminina (vedi figure 1a e 1d). Dopo la semina, le cellule (PPM) adottano una forma mandrino-like, indicativa di questo tipo di cellule (figura 1) e sono MyoD1 + (Figura 2). Nelle specie Danio, PPM sembrano essere più compatto, con piccoli processi bipolari che fanno PPM da Oncorhynchus e Salmo specie. Tuttavia...

La coltura in vitro di sistemi si sono dimostrati indispensabili per la nostra comprensione di myogenesis vertebrati. Tuttavia, resta ancora molto da imparare su nonmammalian sviluppo muscolo scheletrico e la crescita, in particolare in taxa basali. Un protocollo efficiente e robusto per isolare le cellule staminali di questo tessuto, le cellule precursori miogenici (PPM), e mantenendo la loro auto-rinnovo, proliferazione e differenziazione in un ambiente coltura primaria consente l&#39;identificazione di meccanismi di regolazione conservati e divergenti tutta i lignaggi vertebrati.

Preparazione di primaria Miogenica precursori cellulari / Culture mioblasti dal basale vertebrati Lignaggi

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

L'obiettivo generale di questa procedura è coltivare cellule precursori miogeniche da teleostei per indurre la miogenesi in vitro. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando il muscolo epassiale dall'organismo. Il secondo passaggio consiste nel dissociare meccanicamente il tessuto isolato.Successivamente, il tessuto viene dissociato enzimaticamente per disperdere le cellule desiderate. L'ultimo passaggio consiste nell'allestire le cellule precursori miogeniche isolate su un substrato di Laminina. Alla fine, in vitro.La miogenesi viene utilizzata per mostrare gli effetti di vari trattamenti sui cambiamenti nella regolazione e nell'espressione genica, nell'espressione proteica e nelle modifiche del fenotipo cellulare. Questo video mostrerà come allestire un sistema di coltura primaria a partire da cellule precursore miogeniche di teleostei. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale poiché alcuni passaggi di dissociazione potrebbero risultare difficili da apprendere.Una dissociazione corretta ed adeguata è fondamentale per isolare un pellet cellulare adeguato da utilizzare successivamente nella coltura. Per iniziare, preparare tutti i mezzi e le soluzioni necessari per la procedura. Successivamente, assemblare gli ulteriori materiali necessari per l'isolamento del tessuto.Autoclavare preventivamente dove necessario. Assicurarsi di preparare materiali aggiuntivi per ogni persona che assiste nel processo di dissezione. Altri materiali da tenere a portata di mano includono etanolo al 70%, una bilancia sterile, provette coniche da 50 millilitri e ghiaccio per ogni cinque grammi di tessuto da dissezionare.Aliquotare 25 millilitri di mezzo di isolamento in un tubo conico sterile da 50 millilitri. Dopo aver pesato e registrato il numero di massa, mettere i tubi sul ghiaccio. Quando si è pronti, recuperare un pesce da utilizzare nella dissezione del tessuto e immergerlo in etanolo al 70% per 30 secondi prima di posizionarlo su carta autoadesivante repellente all'acqua; utilizzare un bisturi per effettuare un'incisione superficiale e poco profonda, afferrare la pelle all'incisione e tirare verso la coda per rimuovere le squame e la pelle.Successivamente, asportare il muscolo bianco glicolitico a contrazione rapida del pesce da entrambi i lati, evitando il muscolo rosso ossidativo a contrazione lenta situato vicino alla linea laterale. Posizionare il muscolo nel mezzo di isolamento e scartare la parte rimanente del pesce.Continuare a raccogliere il tessuto fino a ottenere una quantità sufficiente di muscolo durante la dissezione; assicurarsi che il tessuto muscolare raccolto rimanga sul ghiaccio per mantenere la vitalità cellulare. Per iniziare, versare un tubo di tessuto muscolare in una capsula di Petri di vetro. Utilizzare due bisturi con un movimento avanti e indietro per tritare il tessuto finché la sospensione tissutale possa essere facilmente rimossa.Con una pipetta da 25 millilitri, riposizionare la poltiglia di tessuto nel suo tubo originale. Ripetere questi passaggi fino a quando tutto il tessuto è stato dissociato meccanicamente. Una volta elaborato tutto il tessuto, centrifugare per cinque minuti, quindi eliminare il soprannatante e lavare il tessuto con mezzo fresco prima di un altro ciclo di centrifugazione.Dopo aver lavato accuratamente, risospendere il tessuto e incubarlo con la soluzione di collagenasi per 60 minuti a 18 °C con movimento lento oscillante. Al termine dell'incubazione, centrifugare i tubi per formare il pellet cellulare. Dopo due lavaggi, risospendere il tessuto nel mezzo di lavaggio.Successivamente, triturare l'omogenato di tessuto finché non passa agevolmente all'interno e all'esterno di una pipetta da 10 millilitri. Ripetere questo procedimento con una pipetta da cinque millilitri e quindi nuovamente con una cannula metallica da 16 gauge collegata a una siringa. Una volta completato accuratamente l'omogenizzato, centrifugare il tessuto e decantare il soprannadante.Risospendere il tessuto in triplice quantità di mezzo di dissociazione e incubare per 20 minuti a 18 gradi Celsius. Successivamente, posizionare i tubi nella centrifuga per una breve centrifugazione. Decantare il soprannatante in quattro volumi uguali di isolamento.Aggiungere il mezzo da conservare a quattro gradi Celsius al pellet rimanente. Ripetere i passaggi di trituratione e dissociazione appena mostrati e combinare il soprannatante risultante con quello raccolto in precedenza.Distribuire la miscela finale in provette coniche da 50 millilitri e centrifugare. Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante avendo cura di non disturbare la cellula. Con una pipetta, aggiungere due millilitri di mezzo completo in ciascuna provetta.Per sciogliere, unire le cellule risospese in un unico tubo conico da 50 millilitri. Risciacquare ogni tubo con un millilitro di mezzo completo. Aggiungere il risciacquo al pool delle cellule risospese.Triturare il tessuto con una cannula metallica e una siringa da cinque a dieci volte. Dopo aver filtrato la sospensione cellulare, aggiungere una quantità sufficiente di mezzo completo per raggiungere un volume di 50 millilitri e centrifugare. Recuperare le cellule, rimuovere il soprannatante e aggiungere cinque millilitri di mezzo completo.Dopo la risospensione, prelevare un piccolo campione per determinare il numero di cellule vitali. Utilizzando un emocitometro. Rimuovere la soluzione di laminina da piastre trattate con poli-L-lisina.Dopo aver diluito le cellule alla concentrazione necessaria, seminatele sulle piastre preparate e sigillatele. Posizionate le piastre sigillate in un incubatore refrigerato impostato alla temperatura appropriata. 24 ore dopo la semina, le cellule precursori miogeniche o MPC dovrebbero essere visibilmente attaccate al substrato di laminina, mentre inizialmente appaiono più compatte.Gli MPC del pesce zebra assumono morfologie simili a quelle della trota iridea. Durante quattro giorni di coltura, i miotubi dovrebbero formarsi entro sei o nove giorni di coltura. In coltura, si è dimostrato che gli MPC e i mioblasti esprimono MyoD1.Mentre i mioblasti si differenziano in tubuli miotubulari, inizieranno a esprimere la miogenina. Questi dati mostrano la proliferazione cellulare durante la coltura mediante incorporazione di BRDU. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare e coltivare.Cellule precursori miogeniche provenienti da diverse specie di pesci dopo il loro sviluppo iniziale in cellule Monets. Questa tecnica ha aperto nuove strade ai ricercatori nel campo della biologia muscolare, permettendo di esplorare nuovi approcci nella biologia muscolare e in altri organismi, inclusi teleostei come i danios, così come altri anfibi o organismi simili agli anfibi come Axel.Lots.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Il micro-dissezionato tecnica espianti è un metodo robusto e affidabile per isolare proliferativa delle cellule del muscolo scheletrico da giovani, adulte o embrionali muscoli come fonte di cellule staminali del muscolo scheletrico. Unicamente, queste cellule sono state derivate clonazione per la produzione di muscolo scheletrico linee di cellule staminali utilizzate per trapianto in vivo.

Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

Tessuto muscolare Engineered ha un grande potenziale nel campo della medicina rigenerativa, come modello di malattia e anche come una fonte alternativa per la carne. Qui si descrive la progettazione di un costrutto muscolare, in questo caso da cellule progenitrici mioblasti di topo, e la stimolazione da impulsi elettrici.

Ingegneria tessuti muscolo scheletrico di cellule murine progenitrici mioblasti e di applicazione di stimolazione elettrica

L'isolamento e la coltura di una popolazione pura di cellule satelliti quiescenti, una popolazione di cellule staminali muscolari, è essenziale per la comprensione del muscolo biologia delle cellule staminali e rigenerazione, nonché trapianto di cellule staminali per terapie in distrofia muscolare e altre malattie degenerative.

Isolamento, Cultura e trapianto di cellule muscolari satellite

Questo protocollo descrive le tecniche per l'isolamento di cellule vive e la coltura primaria di linee cellulari miogeniche e fibroblastiche da tessuto muscolare o cutaneo.  Viene anche descritta una tecnica per l'immortalizzazione di queste linee cellulari.  Nel complesso, questi protocolli forniscono uno strumento affidabile per generare e conservare cellule derivate da pazienti per applicazioni a valle.

Isolamento e Immortalizzazione di paziente derivati ​​da linee cellulari provenienti da Muscle Biopsia per la malattia Modeling

Qui, descriviamo le impostazioni per monitorare in parallelo la bioluminescenza circadiana e l'attività secretoria delle cellule insulari umane e dei miotubi primari. Per questo, abbiamo impiegato la somministrazione genica lentivirale di un reporter di clock con nucleo di luciferasi, seguita dalla sincronizzazione in vitro e dalla raccolta del terreno di deflusso mediante perifusione cellulare continua.

Misura parallela di circadiano Clock espressione genica e la secrezione dell&#39;ormone in colture cellulari primarie umane

Questo protocollo descrive un metodo affidabile, riproducibile e semplice di isolamento e la coltura di cellule progenitrici dei mioblasti dal muscolo scheletrico di adulti e persone anziane. I muscoli usati qui sono i muscoli della gamba e del piede. Questo approccio consente l'isolamento di una popolazione arricchita di mioblasti primari per studi funzionali.

Preparazione e la cultura di cellule miogeniche Precursore / mioblasti primari dal muscolo scheletrico di adulti e esseri umani invecchiati

Qui descriviamo una metodologia per ottenere una popolazione pura di mioblasti umani dal tessuto muscolare adulto. Queste cellule sono utilizzate per studiare la differenziazione muscolare scheletrica in vitro e, in particolare, per studiare le proteine ​​coinvolte nella segnalazione Ca 2+ .

Isolamento dei mioblasti umani, valutazione della differenziazione myogenica e misurazione dell&#39;entrata del calcio a livello di deposito

Differenziazione del muscolo scheletrico è un processo altamente dinamico, che in particolare si basa sul posizionamento nucleare. Qui, descriviamo un metodo per tracciare i movimenti di nuclei da formazione immagine di tensione delle cellule durante la formazione di differenziazione e miotubi dei mioblasti ed effettuare una caratterizzazione quantitativa delle dinamiche di nuclei di estrazione di informazioni da inseguimento automatico.

Sfruttando Live Imaging ai Nuclei di pista durante il differenziamento dei mioblasti e Fusion

I mioblasti stanno proliferando cellule precursori che si differenziano per formare miotubi polinucleati e infine mitole muscolari scheletriche. Qui, presentiamo un protocollo per un isolamento efficiente e la cultura dei mioblasti primari dai muscoli scheletrici dei topi giovani adulti. Il metodo consente studi molecolari, genetici e metabolici delle cellule muscolari in coltura.

Isolamento e differenziazione dei mioblasti primari dagli esopanti muscolari scheletrici del topo

Il muscolo scheletrico comprende più tipi di cellule, comprese le cellule staminali residenti, ognuna con un contributo speciale all'omeostasi e alla rigenerazione muscolare. Qui vengono descritte la coltura 2D di cellule staminali muscolari e la nicchia delle cellule muscolari in un ambiente ex vivo che conserva molte delle caratteristiche fisiologiche, in vivo e ambientali.

Coltura di massa non frazionata di muscolo scheletrico di topo per ricapitolare la quiescenza di nicchie e cellule staminali

Questo protocollo fornisce un metodo standardizzato per isolare e arricchire mioblasti primari da muscoli scheletrici di topo adulti e neonati attraverso dissociazione tissutale, filtrazione sequenziale, preplaccatura e condizioni di coltura definite, consentendo l'istituzione e il mantenimento di colture mioblastiche derivate da cellule satellitari per applicazioni sperimentali a valle.

Isolamento delle cellule satelliti muscolari scheletrici per studi in vitro sulla miogenesi

Impara a isolare e coltivare precursori miogenici da teleostei per studiare la miogenesi in vitro. Questo metodo consente di analizzare la crescita muscolare e i meccanismi di sviluppo in specie non mammifere.

Preparazione di primaria Miogenica precursori cellulari / Culture mioblasti dal basale vertebrati Lignaggi

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