Name: Elettrofisiologici Registrazione da Drosophila Labellar Taste Sensilla (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Impara a registrare risposte elettrofisiologiche dai sensilla gustativi labellari di Drosophila. Questo metodo permette di misurare i potenziali d'azione dei neuroni gustativi durante la stimolazione con composti chimici.

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Questo lavoro è stato supportato da un predoctoral 1F31DC012985 sovvenzione NRSA (a RD) e da sovvenzioni NIH per JC Vorremmo ringraziare il Dott. Linnea Weiss per gli utili commenti sul manoscritto, il dottor Ryan Joseph di aiuto per la compilazione figure, e il dottor Frederic Marion-Poll per utili consigli tecnici. Vorremmo inoltre ringraziare gli utili commenti di quattro utenti.

Il seguente protocollo è conforme a tutte le direttive cura degli animali della Yale University. 1. Reagenti agricole per la preparazione <ol><li> Registrazione installazione attrezzature (Figura 1A). <ol><li fo:keep-together.within-page="always"> Scegliere una sala per l&#39;installazione impianto che è libero di ampie variazioni di temperatura o umidità e anche isolata da fonti di rumore elettrico e meccanico, come i frigoriferi e centrifughe. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51355/51355fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51355/51355fig1.jpg" /> Figura 1. (A) Presentazione di installazione impianto di registrazione. Stereomicroscopio (a) è montato sulla piattaforma anti-vibrazione (b) portaelettrodo. Riferimento (c) è montato sulla piattaforma opposta headstage (d), tramite micromanipolatori. Un tubo di plastica scarico (e) fornire flusso di aria umidificata diretto alla preparazione mosca è montato anche su tegli piattaforma. Headstage è collegato all&#39;amplificatore (f), che è collegato al sistema di acquisizione digitale (DAS) (g), che è collegato ad un PC (h). (B) Configurazione degli elettrodi e del tubo di scarico:. Elettrodo di riferimento a sinistra, elettrodo di registrazione a destra, e il flusso d&#39;aria tubo di scarico diretto in preparazione fly <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> </li><li> Mount stereomicroscopio al centro del tavolo anti-vibrazione o piattaforma. </li><li> Attaccare micromanipolatori per la preparazione elettrodo di riferimento / insetto e headstage / elettrodo di registrazione rispettivamente a sinistra ea destra del microscopio, utilizzando supporti magnetici. </li><li> Mount presa tubo di plastica in una terza micromanipolatore al retro del microscopio, orientato in modo tale che l&#39;apertura del tubo è puntato verso la posizione di mosca prep (vedere Figura 1B). </li><li> Utilizzando tubi di plastica flessibile, apresa tachimetro tubo di plastica ad una beuta da vuoto parzialmente riempito con acqua. Collegare una piccola pompa acquario a bolla d&#39;aria attraverso l&#39;acqua nel pallone, generando un flusso d&#39;aria umidificata attraverso il tubo plastico scarico verso la mosca. </li><li> Mount fibra ottica sorgente luminosa dal tavolo vibrazione, orientando le uscite per illuminare la preparazione riflettono la luce con un foglio di carta bianca della carta direttamente sotto la preparazione. Accertarsi che la sorgente di luce non poggia sul tavolo. Nota: il vantaggio di riflettere la sorgente di luce su un disco di carta è duplice: migliora il contrasto, rendendo sensilla più facile da visualizzare, e impedisce il riscaldamento del preparato che deriverebbe dalla luce diretta. </li><li> Inserire tastePROBE amplificatore nel sistema di acquisizione digitale (DAS), e la DAS in un personal computer, secondo il manuale fornitore. Collegare piede grilletto pedale e organizzare in area di lavoro. Nota: prese a muro elettricamente isolate per l&#39;amplificatore e DAS sono altamente auspicabilegrado. </li><li> Elettricamente a terra microscopio, micromanipolatori, e la sorgente luminosa per il collegamento di componenti metallici per tavolo con morsetti a coccodrillo e lunghezze di filo elettrico isolato e nastro isolante. Elettricamente a terra piattaforma di metallo collegandosi alla costruzione di terra o DAS, che viene messa a terra tramite spina di alimentazione. </li><li> Installare il software appropriato di acquisizione per la DAS di scelta sul personal computer. Nota: Assicurarsi che i driver di acquisizione digitali sono compatibili con il sistema operativo del PC. </li><li> Configurare l&#39;amplificazione software (10-100x), il filtraggio del segnale (tipicamente un filtro passa-banda Bessel impostato da 100 Hz-3, 000 Hz), e frequenza di campionamento (almeno 10 KHz). Nota: ampiezze di segnale dai neuroni gustative sono tipicamente nel range 0,5-2 mV, per cui la scala di visualizzazione è impostato per facilitare la loro visualizzazione. Nota: Il filtro 100 Hz consente di escludere il rumore elettrico estraneo, tuttavia, cambia la forma delle punte e può fare advanced picco ordinamento more impegnativo. In alternativa, un filtro 1 Hz può essere utilizzato. </li><li> Facoltativamente, una gabbia di Faraday può essere impostato intorno all&#39;intera tavola vibrante. Tuttavia, piccoli fogli di alluminio sono in genere sufficienti per ridurre il rumore generato dall&#39;ambiente esterno o investigatore. </li></ol></li><li fo:keep-together.within-page="always"> Glass elettrodi Preparazione <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51355/51355fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51355/51355fig2.jpg" /> Elettrodi Figura 2. Riferimento e di registrazione. Fotografie sotto l&#39;ingrandimento di capillari di vetro tirato in elettrodo di riferimento, con (A) e senza (B) punta rotta, e elettrodi di registrazione (C). Barra bianca rappresenta 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <ol><li> Tirare il riferimentoelettrodo da un capillare di vetro usando una pipetta strumento estrattore. Nota: Le impostazioni esatte del programma pipetta estrattore possono variare da strumento a strumento. Provare a raggiungere un lungo cono graduale. La dimensione dei pori sulla punta non è fondamentale perché la punta sarà rotto prima preparazione fly (Figure 2A e 2B), tuttavia, assicurarsi che il diametro della lunghezza conica dell&#39;elettrodo è né troppo sottile, che non consente una sufficiente immobilizzazione del labello, né troppo grande, che potrebbe danneggiare i neuroni gustative o rottura delle ghiandole salivari. </li><li> Estrarre l&#39;elettrodo registrazione da un capillare di vetro borosilicato con filamento con uno strumento pipetta estrattore. Cercare di ottenere un cono che è minore di quella dell&#39;elettrodo di riferimento, e un diametro dei pori di circa 10-15 micron (Figura 2C) 28. </li></ol></li><li> Soluzioni sapida preparazione <ol><li> Utilizzare soluzione Ringer Beadle-Ephrussizione (B &amp; E) come elettrolita elettrodo di riferimento. Per fare un litro di B &amp; E, sciogliere 7,5 g di NaCl, 0,35 g di KCl, e 0,279 g di CaCl 2 ∙ 2H 2 O in un litro di acqua ultrapura. Conservare aliquote inferiori a -20 ° C. </li><li> Utilizzare 30 mM soluzione tricholine citrato (TCC) come elettrolita elettrodo di registrazione e solvente per soluzioni sapida 25, se le risposte GRN amaro o zucchero sono da misurare. In alternativa, 1-3 mM soluzione di cloruro di potassio può essere utilizzata se le risposte della cellula acqua devono essere misurate. </li><li> Per rendere le soluzioni sapida, pesare la quantità appropriata di sapida in polvere e aggiungere al TCC per fare uno stock concentrazione iniziale. Usare questo per fare diluizioni seriali di questo stock iniziale per produrre la concentrazione desiderata per il test. Nota: Se tastants non facilmente si dissolvono in acqua, un altro solvente, come etanolo, può essere usato per fare magazzino concentrazione iniziale. Una soluzione di controllo adeguato di TCC e solvente senza sapidadovrebbe essere utilizzato in questo caso. </li><li> Il negozio di aliquote lungo termine a -20 ° C. Memorizzare un aliquota di lavoro di una soluzione sapida a 4 ° C per la registrazione all&#39;uso fino a una settimana, a seconda delle proprietà chimiche del sapida. </li></ol></li></ol> 2. Drosophila Preparazione <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51355/51355fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51355/51355fig3.jpg" /> Figura 3. Preparazione di volare per la registrazione. (A) Posizione di inserimento dell&#39;elettrodo di riferimento nel torace dorsale di volare. La freccia bianca indica l&#39;elettrodo di riferimento. (B) la posizione intermedia di elettrodo di riferimento: avanzare attraverso il collo e la testa, non proboscide ancora esteso. (C, D) volare con elettrodo di riferimento in posizione finale con la punta di elettrodo all&#39;interno labello, e proboscidecompletamente esteso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <ol><li> Raccogliere le mosche appena eclosed per la registrazione da culture fly ben curati, cresciute sotto-e temperatura condizioni di umidità controllata, e invecchiare 5-10 giorni in flaconi di coltura fresco prima di registrare. </li><li> Raffreddare piastra microscopio su ghiaccio per 15-30 minuti prima di preparare mosca. </li><li> Backfill elettrodo di riferimento vetro con B &amp; E soluzione con un lungo, plastica sottile ago di 0,5 mm di diametro, ad esempio un ago spinale e siringa da 1 ml e delicatamente toccare eventuali bolle. Rompere piccola quantità di punta fuori con pinze e usare un&#39;azione capillare per tirare fuori tutte le bolle rimanenti con un fazzoletto, osservando sotto microscopio da dissezione. </li><li> Presentazione B &amp; E-riempita elettrodo di riferimento sul filo del porta elettrodi di riferimento, facendo attenzione a non introdurre bolle d&#39;aria. </li><li> Aspirare volare in una punta di pipetta P200, utilizzando fly aspiratore incorporatodalla tubazione, maglia e puntale; 29 posto nel secchiello del ghiaccio e freddo per 30-60 sec. </li><li> Rimuovere la piastra microscopio da ghiaccio, eliminare ogni residuo di umidità, e la posizione sotto il microscopio. Battere delicatamente volare fuori punta della pipetta sulla piastra microscopio. Nota: la mosca dovrebbe essere sufficientemente immobilizzato per manipolare facilmente. </li><li> Sotto basso ingrandimento, rimuovere delicatamente le zampe anteriori, con un paio di pinze, mentre si tiene la stalla torace con l&#39;altra coppia di pinze. Posizionare la mosca sul suo lato ventrale, lato dorsale verso l&#39;alto. Nota: essere sempre attenti a non toccare il labello con le pinze in qualsiasi momento durante il processo di preparazione per minimizzare i danni meccanici. </li><li> Tenendo la mosca in posizione con un paio di pinze, inserire l&#39;elettrodo di riferimento alla linea mediana della dorsale posteriore del torace. Un angolo suggerito di entrata è di circa quarantacinque gradi, in direzione della testa (Figura 3A). </li><li> Fissare l&#39;elettrodo di riferimentoe supporto con plastilina in modo che la mosca è visibile sotto il microscopio ad alto ingrandimento. Manovra e l&#39;angolo l&#39;elettrodo di vetro attraverso il collo e la testa, facendo scorrere la mosca nei confronti del titolare elettrodo di riferimento utilizzando due paia di pinze. Nota: Lavorate in fretta, ma senza problemi, è più facile per completare questo passaggio, mentre la mosca è ancora immobilizzata dal freddo (Figura 3B). </li><li> Estendere delicatamente la proboscide con una coppia di pinze, facendo scorrere la mosca ulteriormente l&#39;elettrodo di riferimento vetro, finché la punta dell&#39;elettrodo è all&#39;interno del labello e la proboscide è completamente estesa (figure 3C e 3D). Nota: Fare attenzione a non forare qualsiasi parte del tessuto proboscide o distendere il bordo del labello con l&#39;elettrodo di riferimento, in quanto ciò potrebbe danneggiare il volo e / o sapore neuroni e compromettere la qualità di registrazione. </li></ol> 3. Registrazione da Labellar Sensilla <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51355/51355fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51355/51355fig4.jpg" /> Figura 4. Registrazione da mosca. (A) labello di preparazione volare sulla sinistra con elettrodo di registrazione in linea di contatto a destra, in alto ingrandimento. (B) elettrodo di registrazione e single sensillum sul labello in contatto, in alto ingrandimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <ol><li> Mettere sempre a terra toccando la superficie metallica del tavolo anti-vibrazione o piattaforma prima di toccare qualsiasi apparecchiatura durante il processo di registrazione! Nota: E &#39;estremamente importante non fornire una carica elettrostatica al headstage come che possono danneggiare i circuiti. </li><li> Sicuro titolare elettrodo di riferimento al micromanipolatore montato sulla tavola un&#39;aria di Recording rig. Posizione un lobo del labello in campo microscopio di vista, in alto ingrandimento (in genere almeno 140X), in linea con il flusso di aria umidificata. </li><li> Accendere il flusso di aria umidificata, computer, DAS, e l&#39;amplificatore. Software di acquisizione Apri. </li><li> Sciacquare e riempire elettrodo di registrazione vetro con sapida desideri. <ol><li> Risciacquare elettrodo di registrazione di vetro con acqua ultrapura utilizzando una siringa e tubo di plastica da 28 a tirare piccole quantità di acqua attraverso il tubo almeno dieci volte. </li><li> Sciacquare elettrodo di registrazione con sapida almeno cinque volte. Riempire elettrodo di registrazione di circa un terzo a pieno a metà con sapida e togliere dal tubo. Se ci sono bolle d&#39;aria, toccare per rilasciare o semplicemente riempire l&#39;elettrodo. </li><li> Infilare elettrodo sul filo di argento headstage rapidamente ed uniformemente in modo da non introdurre bolle d&#39;aria. </li></ol></li><li> Stimolare singolo sensillum con elettrodo di registrazione sapida-riempita. <ol><li> Utilizzare il micromanipupressione della bombola per portare l&#39;elettrodo di registrazione allineato sensillum di interesse. </li><li> Premere il pedale per avviare la modalità di acquisizione dell&#39;amplificatore. </li><li> Avanzare l&#39;elettrodo di registrazione con la manopola di regolazione fine della micromanipolatore attenzione fino a quando non entra in contatto con la punta di sensillum e la registrazione comincia. </li><li> Rimuovere l&#39;elettrodo dopo 1-2 sec. </li><li> Ripetere passo 3.5 con altri sensilli, se lo si desidera. Nota: Attendere almeno 1 minuto tra presentazioni alla stessa sensillum. Se la registrazione con un singolo sapida per un periodo prolungato di tempo, la soluzione sapida potrebbe seccarsi e la soluzione nella punta può diventare più concentrato. Questo può essere risolto contattando delicatamente la punta dell&#39;elettrodo di vetro con carta liscia per rimuovere una piccola quantità di liquido per capillarità. </li></ol></li><li> Per registrare le risposte a un altro sapida, risciacquare e elettrodo di registrazione del carico con il nuovo sapida e ripetere il punto 3.4. Nota: accuratamente sciacquare l&#39;elettrodo tra tastants è absolutely fondamentale per evitare la contaminazione incrociata. </li><li> Salvare i file di dati periodicamente con informazioni di identificazione, come data, genotipo, e tastants. Nota: E &#39;importante tenere una copia scritta della sapida e dell&#39;identità sensillum di ogni presentazione durante la sessione di registrazione per l&#39;analisi dei dati. </li></ol>

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<li>Wieczorek, H., Wolff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+labellar+sugar+receptor+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A.+Neuroethol+Sens.+Neural+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The labellar sugar receptor of Drosophila.</a> J. Comp. Physiol. A. Neuroethol Sens. Neural Behav. Physiol. 164, 825-834 (1989).</li>
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<li>Benton, R., Dahanukar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recording+from+Drosophila+taste+sensilla%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recording from Drosophila taste sensilla.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2011, 839-850 (2011).</li>
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<li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+individual+firing+frequencies+of+two+neurons+recorded+with+a+single+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode.</a> Chem Senses. 28, 671-679 (2003).</li>
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<li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+coding+of+bitter+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Peripheral coding of bitter taste in Drosophila.</a> Journal of neurobiology. 56, 139-152 (2003).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Sensilla Labellar variano nella facilità della registrazione a causa delle differenze nella morfologia e l&#39;organizzazione anatomica. A volte un sensillum non risponde ad alcuna tastants, anche uno che è noto per suscitare una risposta positiva. La frequenza con cui ciò si verifica varia a seconda del tipo di sensillum. L sensilla sono più costantemente reattivo e sono relativamente facili da accedere a causa della loro lunghezza. In generale, S sensilli sono sempre reattivo, ma la loro corta lunghezza e la posizione...

Il senso del gusto permette un insetto per rilevare una vasta gamma di prodotti chimici solubili e svolge un ruolo importante nella accettazione di una sostanza nutriente, o il rifiuto di uno nocivi o tossici. Gusto è anche pensato di svolgere un ruolo nella selezione del partner, attraverso il rilevamento di feromoni 1-5. Queste funzioni importanti e diverse hanno reso il sistema del gusto insetto bersaglio irresistibile di indagine come i sistemi sensoriali traducono stimoli ambientali in output comportamentali rilevanti. L&#39;unità principale del sistema di gusto Drosophila melanogaster sono i capelli gusto, o sensillum. Le molecole entrano nel sensillum attraverso un poro al suo 2,6 punta. Sensilli si trovano sul labello, le gambe, il margine dell&#39;ala, e la faringe 6. Sul labello, il numero e la posizione dei sensilli è stereotipati. Ci sono tre classi morfologiche dei sensilli basati sulla lunghezza: lungo (L), intermedio (I), e brevi (S<html> ) Sensilli 7,8. Ogni sensillum contiene o due (I-type) o quattro (L e S-type) neuroni recettori gustativi (GRN) 9. Diversi GRN rispondono a diverse categorie di stimoli gusto: amaro, zucchero, sale e osmolarità 7,10 ed esprimono diversi sottoinsiemi di recettori gustativi 8,11-13. Solo io e S-type sensilla contengo amaro-reattiva GRN 8,10. Il progetto GRN al ganglio subesophageal (SOG) e la loro attivazione da molecole sapide viene trasmesso al sistema nervoso centrale superiore per la decodifica, causando una risposta comportamentale 6. Il numero relativamente piccolo di neuroni e la riconducibilità di analisi molecolare e comportamentale rendono il sistema gusto Drosophila un ottimo modello per lo studio di sistemi gustativi in generale. La relativa facilità con cui il sistema può essere manipolato tramite mutazione genetica o il sistema di espressione GAL4-UAS serve anche come uno strumento prezioso 14,15. ONTENUTO &quot;&gt; Poiché questi sensilla sporgono dalla superficie del labello, fanno ottimi bersagli per elettrofisiologia. lo sparo della GRN può essere monitorato tramite registrazione extracellulare. Storicamente, il metodo di registrazione parete laterale, che utilizza un elettrodo di vetro inserita nel sensillum per registrare l&#39;attività neuronale, 26 è stato utilizzato. Tuttavia, questo metodo è tecnicamente difficile da eseguire, ed è difficile da registrare per lungo da ciascun preparato. Procedimento punta-registrazione, che misura la risposta dei neuroni con un elettrodo che offre allo stesso tempo una sapida, da allora è diventato il metodo di scelta 9,16. Esso è stato utilizzato per studiare il sistema del gusto di Drosophila melanogaster 8,10,17,18 così come un certo numero di altre specie di insetti 19-23. Ha stato notevolmente facilitato dallo sviluppo dell&#39;amplificatore tastePROBE, che ha superato uno dei principali inconvenienti del metodo punta-registrazione compensandola grande differenza di potenziale tra l&#39;elettrodo di riferimento e l&#39;sensillum insetto, permettendo ai potenziali d&#39;azione GRN da registrare senza eccessivo amplificazione o filtraggio 24. Un altro importante sviluppo è stato l&#39;uso di tricholine citrato come elettrolita registrazione 25. TCC sopprime le risposte dal GRN osmolarità sensibile e non stimola il GRN sensibili al sale, rendendo risposte generate dal tastants amaro e zucchero molto più facile da analizzare 25. Qui si descrive come la registrazione punta di Drosophila labellar sensilli è attualmente eseguita in laboratorio Carlson. Questo protocollo spiegherà come stabilire un impianto adatto elettrofisiologia, come preparare al volo, e come eseguire le registrazioni di gusto. Presentiamo anche alcuni dati rappresentativi ottenuti dalla registrazione da sottoinsiemi di Drosophila sensilli, nonché alcuni problemi comuni e le possibili soluzioni che si possono incontrare quando si usa questatecnica.

<table><tbody><tr><td>Microscopio stereo zoom</td><td>Olympus</td><td>SZX12 DFPLFL1,6x PF oculari: WHN10x-H/22</td><td>in grado di ingrandimento ~150X con supporto da tavolo a lunga distanza di lavoro</td></tr><tr><td>Sistemi cinetici</td><td>da tavolo antivibranti</td><td>Micromanipolatori BenchMate2210</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>NMN-21</td><td></td></tr><tr><td>Supporti magnetici</td><td>ENCO</td><td>Modello #625-0930</td><td></td></tr><tr><td>Riferimento Porta elettrodo</td><td>Harvard Apparatus</td><td>ESP/W-F10N</td><td>Può essere montato su pipetta sierologica da 5 ml per una gamma estesa</td></tr><tr><td>Silver Wire</td><td>World Precision Instruments</td><td>AGW1510</td><td>0,3-0,5 mm di diametro</td></tr> Supporto per <tr><td>storta generico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo</td><td></td><td></td> in plastica <td>di uscita generico, diametro 1 cm</td></tr><tr><td>Tubo flessibile in plastica</td><td>Nalgene</td><td>8000-0060</td><td>VI grado 1/4 di diametro interno&nbsp;</td></tr><tr>Pallone <td></td><td></td><td>conico da 500 ml</td><td>generico, con braccio laterale</td></tr><tr><td>Pompa per acquario</td><td>Giardini acquatici</td><td>Pompa ad aria 2000</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa in fibra ottica</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Industries Fiber-Lite 2100</td><td></td></tr><tr><td>White Card/Paper</td><td>Whatman</td><td>1001-110</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione digitale</td><td>Syntech</td><td>IDAC-4</td><td>Alternativa: National Instruments NI-6251 &nbsp;</td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Syntech</td><td>DTP-1</td><td>Tasteprobe Tasteprobe</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Syntech</td><td>DTP-1</td><td>Tasteprobe</td></tr><tr><td>Clip a coccodrillo</td><td>Grainger</td><td>1XWN7</td><td>Qualsiasi marca va bene</td></tr><tr><td>Cavo</td><td></td><td></td> elettrico isolato <td></td></tr><tr><td>Connettore in oro generico Pin World</td><td>Precision Instruments</td><td>5482</td><td></td></tr><tr><td>Personal Computer</td><td>Dell</td><td>Vostro</td><td>Verifica la compatibilità con il sistema di acquisizione digitale e il software</td></tr><tr><td>Software di acquisizione Syntech</td><td></td><td>Autospike</td><td>Autospike funziona con IDAC-4; in alternativa, utilizzare LabView con NI-6251</td></tr><tr><td>Foglio di alluminio e/o gabbia</td><td></td><td></td> di Faraday <td>Schermatura dal rumore elettromagnetico Capillari</td></tr> in <tr><td>vetro borosilicato</td> World <td>Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per pipette</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Modello P-87 Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone</td> Soluzione per perline ed ephrussi Ringer Vedere la ricetta nella sezione del protocollo Citrato di tricolina, 65%&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>T0252-100G</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Olympus</td><td>VMZ 1x-4x</td><td>in grado di ingrandire 10-40X</td></tr><tr><td>Secchiello</td><td></td><td></td> per il ghiaccio <td>Punte</td></tr><tr><td></td><td></td> per<td>pipette generiche p200</td><td></td></tr><tr><td>Ago spinale</td> generico <td>Terumo</td><td>SN * 2590</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td></td> Aspiratore di mosche 301025 <td></td><td>Beckton-Dickenson</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Assemblato da puntali per pipette P1000, tubi di plastica flessibili e rete</td></tr><tr><td>Modellazione Clay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Generic Pincipe</td><td>Fine Science Tools By Dumont</td><td>11252-00</td><td>#5SF (punte super-fini)</td></tr><tr><td>Siringa da 10 ml</td><td>Beckton-Dickinson</td><td>301029</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in plastica</td><td>Tygon</td><td>R-3603</td><td></td></tr></tbody></table>

elettrofisiologici registrazione da<em&gt; drosophila</em&gt; labellar taste sensilla

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

La risposta gusto periferico degli insetti può essere potentemente indagato con tecniche elettrofisiologiche. Il metodo qui descritto consente al ricercatore di misurare le risposte gustative direttamente e quantitativamente, riflettendo l&#39;input sensoriale che il sistema nervoso dell&#39;insetto riceve da stimoli di sapore nel suo ambiente. Questo protocollo descrive tutti i passaggi chiave nello svolgimento di questa tecnica. I passaggi critici nel montaggio di un impianto di elettrofisiologia, come la scelta delle attrezzature necessarie e di un ambiente adatto per la registrazione, sono delineati. Abbiamo anche descritto come prepararsi per la registrazione facendo opportuni elettrodi di riferimento e di registrazione, e le soluzioni sapida. Descriviamo in dettaglio il metodo per preparare l&#39;insetto mediante inserimento di un elettrodo di riferimento in vetro al volo per immobilizzare proboscide. Noi mostriamo tracce di impulsi elettrici sparati da neuroni gusto in risposta ad uno zucchero e un composto amaro. Aspetti del protocollo sono tecnicamente impegnativo e includiamo una descrizione dettagliata di alcune sfide tecniche comuni che si possono incontrare, come la mancanza di segnale o rumore eccessivo nel sistema, e le possibili soluzioni. La tecnica ha limitazioni, come l&#39;incapacità di fornire stimoli temporalmente complessi, osservare sfondo cottura immediatamente prima stimolo consegna o usare i composti gusto insolubili in acqua convenientemente. Nonostante questi limiti, questa tecnica (comprese variazioni minori si fa riferimento nel protocollo) è uno standard, procedura ampiamente accettato per la registrazione di risposte neuronali Drosophila al gusto composti.

Figura 5A mostra la risposta di una L sensillum ad uno zucchero, saccarosio. Lo stesso sensillum non risponde ad un composto amaro, berberina. Figura 5B mostra che un tipo I sensillum, che contiene un neurone reattivo amaro, visualizza maggiori picchi di ampiezza in risposta alla berberina, e picchi di ampiezza più piccoli in risposta al saccarosio. L sensilla visualizzare una minima risposta di fondo al controllo solvente, TCC, mentre sensilla visualizzo praticamente alcuna risposta al...

Questo protocollo descrive registrazione extracellulare delle possibili azioni di risposta sparati dai neuroni del gusto labellar in Drosophila.

Elettrofisiologici Registrazione da<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le risposte di singole sensilla del gusto sul labro di Drosophila. Questo viene ottenuto innanzitutto costruendo un apparato di elettrofisiologia e configurando tutte le apparecchiature necessarie. Il secondo passaggio consiste nel preparare la mosca per la registrazione. Successivamente, un singolo lum viene stimolato con un composto gustativo mentre la risposta neuronale viene contemporaneamente registrata. Infine, la registrazione elettrofisiologica mediante elettrodo a punta da singole silla etichettate viene utilizzata per mostrare le risposte delle illa gustative a diversi composti gustativi. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi di preparazione della mosca possono risultare tecnicamente complessi e difficili da apprendere.In questa procedura, raccogliere le mosche ELO appena nate dalle colture ben mantenute. Successivamente, far invecchiare le mosche da cinque a dieci giorni in provette di coltura fresche prima della registrazione; prima della preparazione della mosca, raffreddare la piastra del microscopio su ghiaccio per 15-30 minuti. Poi, riempire all'indietro l'elettrodo di riferimento in vetro con la soluzione B ed e.E delicatamente eliminare eventuali bolle sotto il microscopio stereoscopico. Utilizzare la pinzetta per staccare una piccola sezione dell'apice. Successivamente, sfruttare l'azione capillare per rimuovere con il tessuto eventuali bolle rimanenti.Quindi far scivolare l'elettrodo di riferimento riempito con B ed E sul filo del porta-elettrodo, e per evitare di introdurre bolle d'aria, aspirare una mosca in una punta di pipetta P 200. Posizionarla in un secchiello con ghiaccio e raffreddare per 30 secondi fino a un minuto. Successivamente, rimuovere la piastra del microscopio dal ghiaccio e posizionarla sotto il microscopio dopo aver asciugato l'umidità.Battere delicatamente per far uscire la mosca dalla punta della pipetta sulla piastra del microscopio con ingrandimento basso. Rimuovere le quattro zampe con una pinzetta mentre si tiene ferma la Forex con l'altra pinzetta. Posizionare la mosca sul lato ventrale con il lato dorsale rivolto verso l'alto.È sempre necessario fare attenzione a evitare di toccare l'etichetta beum con la pinzetta durante il processo di preparazione, per ridurre al minimo i danni meccanici. Tenendo fermo il moscerino con una coppia di pinzette, inserire l'elettrodo di riferimento lungo la linea mediana del torace dorsale posteriore a circa 45 gradi, nella direzione della testa. Successivamente, fissare il supporto dell'elettrodo di riferimento con argilla modellabile in modo che il moscerino sia visibile sotto il microscopio ad alta ingrandimento. Posizionare e orientare l'elettrodo di vetro verso il collo e la testa, quindi spostare delicatamente il moscerino verso il supporto dell'elettrodo di riferimento utilizzando due coppie di pinzette.Ora, estendere delicatamente la proboscide con una pinzetta e far scivolare ulteriormente la mosca lungo l'elettrodo di riferimento in vetro finché la punta dell'elettrodo non sia all'interno del labro e la proboscide sia completamente estesa. In questo passaggio, fissare il supporto dell'elettrodo di riferimento al micromanipolatore montato sul tavolo antivibrazioni. Posizionare un lobo del labro nel campo visivo del microscopio ad alta ingrandimento e allineato con il flusso d'aria umidificato.Successivamente, accendere il sistema di acquisizione digitale computerizzato per flusso d'aria umidificato o DAS e l'amplificatore. In seguito, utilizzare una siringa e un tubo di plastica per aspirare una piccola quantità di acqua ultrapura attraverso il tubo almeno 10 volte. Per risciacquare l'elettrodo di registrazione in vetro, risciacquare successivamente l'elettrodo di registrazione con TAST almeno cinque volte.Quindi riempire l'elettrodo di registrazione per circa un terzo o a metà con la sostanza di gusto e rimuoverlo dal tubo. Se sono presenti bolle d'aria, battere leggermente per eliminarle oppure semplicemente ricaricare l'elettrodo. Ora far scivolare l'elettrodo sul filo d'argento dello stadio testa in modo rapido e uniforme.Per evitare di introdurre bolle d'aria che potrebbero stimolare il singolo sensillo, utilizzare innanzitutto il micromanipolatore per allineare l'elettrodo di registrazione con il sensillo di interesse. Successivamente, premere il pedale per attivare la modalità di acquisizione dell'amplificatore. Quindi, avanzare con attenzione l'elettrodo di registrazione riempito con la soluzione gustativa mediante la manopola di controllo fine del micromanipolatore, fino a quando entra in contatto con l'apice del sensillo e inizia la registrazione.Rimuovere l'elettrodo dopo uno o due secondi. Ripetere nuovamente la procedura con un altro illa e attendere almeno un minuto tra una presentazione e l'altra allo stesso lum. Se la registrazione avviene con un singolo gusto per un periodo prolungato, il gusto e la soluzione potrebbero seccarsi e la soluzione nella punta potrebbe diventare più concentrata.Questo inconveniente può essere risolto toccando delicatamente la punta dell'elettrodo di vetro con carta liscia per rimuovere una piccola quantità di liquido per azione capillare, registrare le risposte a un altro gusto, risciacquare e caricare l'elettrodo di registrazione con un nuovo stimolo gustativo, quindi ripetere la procedura. Salvare periodicamente i file di dati con informazioni identificative come data, genotipo e tipo di gusto. Questa figura mostra la risposta di un centum al saccarosio zuccherino.Lo stesso centrum non risponde al composto amaro berberina, e questa figura mostra che un sensillo di tipo occhio, che contiene un neurone sensibile all'amaro, presenta picchi di maggiore ampiezza in risposta alla berberina e picchi di minore ampiezza in risposta al saccarosio. Illustrati qui, risultati elettrofisiologici subottimali rappresentativi. Questa traccia rappresenta un'assoluta mancanza di segnale.Questo è il rumore a 50 o 60 hertz proveniente da fonti elettriche esterne, e questo è il rumore stocastico. Questo tracciato indica che il neurone sensoriale Meno stava scaricando da solo mentre sia il neurone recettoriale gustativo amaro sia il neurone sensoriale Meno stavano scaricando. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come registrare le risposte neuronali dall'Oph Atory Silla sul labro.

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Qui si descrivono i metodi elettrofisiologici per la misurazione della trasmissione sinaptica a livello della giunzione neuromuscolare larva di Drosophila. Rilascio evocato è iniziata artificialmente stimolando gli assoni dei motoneuroni, e la trasmissione attraverso il NMJ può essere misurata la risposta postsinaptica evocata nel muscolo.

Metodi elettrofisiologici per la registrazione Potenziali Synaptic dal NMJ Larve di Drosophila

Registrazione elettrofisiologiche in Drosophila Embryo

Risposte elettrofisiologiche dei neuroni sensoriali olfattivi di odori può essere misurata in insetti utilizzando registrazioni sensillum singolo. In questo articolo il video ci mostrerà come eseguire registrazioni sensillum singolo nelle antenne del moscerino della frutta...

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Questo video delinea il protocollo per la registrazione elettrofisiologica dell'attività dei fotorecettori nell'occhio di una Drosophila immobilizzata, consentendo una misurazione precisa delle variazioni di tensione in risposta agli stimoli luminosi.

Registrazione elettrofisiologica delle risposte di tensione dei fotorecettori retinici di Drosophila agli stimoli luminosi

In questo video, una mosca di Drosophila viva è montata in un tubo per studi elettrofisiologici. Gli elettrodi sono posizionati alla base del sensillum per registrare specifiche risposte neuronali ai feromoni con i neuroni del recettore olfattivo della mosca.

Registrazioni elettrofisiologiche da Drosophila sensilla in risposta a odori volatili

Le zampe anteriori e la proboscide di Drosophila contengono un ricco repertorio di neuroni sensoriali gustativi. Qui, presentiamo un metodo che utilizza l'imaging del calcio per misurare le risposte fisiologiche dei neuroni sensoriali nella zampa anteriore e nella proboscide di moscerini vivi dopo l'applicazione esogena di un feromone gustativo.

Misurare risposte fisiologiche di<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni sensoriali a Lipid feromoni utilizza Live Calcio Imaging

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di dimostrare come presentare gli odoranti a bassa volatilità per la registrazione singolo-sensillare da parte dei neuroni del recettore olfattivo Drosophila che rispondono ai feromoni cuticolari a catena lunga.

Registrazione elettrofisiologica da<em&gt; Drosophila</em&gt; Senso Trichoide in risposta a Odoranti di bassa volatilità

Questo protocollo descrive un metodo per registrare l'attività elettrica discendente del sistema nervoso centrale Drosophila melanogaster per abilitare il costo-efficiente e conveniente test degli agenti farmacologici, mutazioni genetiche delle proteine neuronali, e/o il ruolo di inesplorate vie fisiologiche.

Registrazione elettrofisiologica dell'attività del sistema nervoso centrale di terza-Instar Drosophila Melanogaster

Un metodo di registrazione elettrofisiologica raramente utilizzato, la registrazione di base, consente l'analisi di caratteristiche della codifica del gusto che non possono essere esaminate con i metodi di registrazione convenzionali. La registrazione delle basi consente anche l'analisi delle risposte gustative a stimoli idrofobici che non possono essere studiati con metodi elettrofisiologici tradizionali.

Registrazione di base: una tecnica per analizzare le risposte dei neuroni del gusto in Drosophila

Un approccio di imaging del calcio consente la registrazione delle risposte indotte dal gusto nel cervello dei moscerini svegli mentre una soluzione viene applicata al labello. Le risposte gustative primarie in Drosophila melanogaster sono utilizzate come esempio, ma questo protocollo può essere adattato per studiare i neuroni a valle o altre specie.

In vivo Imaging del calcio delle risposte neurali indotte dal gusto nella Drosophila adulta

Impara a registrare risposte elettrofisiologiche dai sensilla gustativi labellari di Drosophila. Questo metodo permette di misurare i potenziali d'azione dei neuroni gustativi durante la stimolazione con composti chimici.

Elettrofisiologici Registrazione da

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